Name: 全実装免疫学化学と3D再構成を用いた咽頭弓動脈の可視化と解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: 学ぶ全実装免疫蛍光と3D再構成を用いたマウス胚咽頭弓動脈の可視化手法。組織クリアリングと共焦点顕微鏡で血管構造の関係性を解析し、先天性心疾患のメカニズム解明に貢献します。

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この原稿を丁寧に読んで編集してくれたブリアナ・アレクサンダー、カオラン・オドネル、マイケル・ワルカラに感謝します。この研究は、NIH R01 HL103920、R01 HL134935、R21 OD025323-01からSAへの国立心臓、肺および血液研究所からの資金提供によって支えられた。AJRは、NHLBI HL103920-08S1および国立関節炎・筋骨格・皮膚疾患研究所トレーニング助成金T32052283-11によってサポートされています。

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著者らは開示するものは何もない。

3Dでマウス胚の内皮を可視化する能力は、その発達に新たな洞察を提供しました 3.ここでは、胚の高解像度3Dイメージング、血管接続の可視化、およびPAA形成の定量的分析を可能にするプロトコルを提示する。このプロトコルは、遺伝的変化または環境侮辱がPAAの発達にどのような影響を与えるかを確認するために使用することができます。ここで報告された手順は、VEGFR2およびERGに対する抗体を使用してPAA形成を可視化し、EC数を定量化する。しかし、追加の抗体を使用して、神経堤の配置や平滑筋細胞分化など、アーチ動脈の発達の他の側面を視覚化し、分析することができます。この手順が胚発生の初期段階で使用される場合、このプロトコルで検出された一部の抗原(例えば、ERG)がまだ発現していない可能性があることに注意することが重要である。DAPIやDRAQ5などの他の核染色や、核タグ付きトレーサを用いた系統標識を使用して、EC番号を定量化することができます。
プロトコルには、1)胚が溶液の変化の間に乾燥しないようにするためのいくつかの重要なステップがあります。...

マウスの胚発生時に、咽頭弓動脈(PAA)は、心臓と後部大動脈1を結ぶ対称的な二側側の動脈対として生じる。胚が発達するにつれて、PAAの第1および第2のペアは後退し、第3、第4、および第6のPAAは大動脈動脈を形成する一連の非対称リモデリングイベントを受ける2。
PAA 3,4,6は血管形成を介して発達し、血管形成3.これらのアーチ動脈の形成または改造における欠陥は、ディジョージ症候群4、5の患者に見られるような様々な先天性心不全を5引き起こす。したがって、PAAの発達を調節するメカニズムを理解することは、先天性心疾患(CHD)病因をよりよく理解することにつながる。
PAA開発を可視化および分析するための現在のアプローチとしては、組織切片の免疫蛍光、血管キャスト、インドのインク注入、高解像度のエピスコピック顕微鏡、および/または全実装免疫組織化学11、4、5、6、74,5,6,が挙げられる。ここでは、体積データ、血管接続性、細胞アイデンティティを収集、解析、定量化するために、全実装免疫蛍光、共焦点顕微鏡、3D画像レンダリングを組み合わせたプロトコルについて説明する。さらに、咽頭弓血管叢の形成とPAAへの改修を研究する手段として、各咽頭弓中のICの数を区分化し定量化する方法を詳述する。このプロトコルはPAAの開発を分析するために設計されていますが、他の発達中の血管ネットワークを分析するために使用することができます。

<table><tbody><tr><td>10x PBS</td><td>MP Biomedicals</td><td>PBS10X02</td><td></td></tr><tr><td>20x 水浸対物レンズ</td><td>ニコン</td><td>MRD77200</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>バイオ・ラッド・ラボラトリーズ</td><td>1613101</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 抗ヤギ</td><td>Invitrogen</td><td>A-11055</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 抗マウス</td><td>Invitrogen</td><td>A-31570</td><td></td></tr><tr><td>解析ソフトウェア</td><td>イマリス 9.2.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ベンジルアルコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>305197</td><td></td></tr><tr><td>ベンジル安息香酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8.18701.0100</td><td></td></tr><tr><td>カバー スリップ</td><td>VWR</td><td>16004-312</td><td></td></tr><tr><td>DAPI(5 mg/mL ストック)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフチューブ (2.0 mL)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>05-408-138</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td></td></tr><tr><td>ファルコンチューブ(50 mL)</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Fast wells</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664113</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Forceps Roboz</td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-VEGFR2</td><td>R&Dシステムズ株式会社</td><td>AF644</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ニコン</td><td>A1HD25</td><td></td></tr><tr><td>マウス 抗ERG</td><td>Abcam</td><td>ab214341</td><td></td></tr><tr><td>ノーマル ロバ 血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>パスツールピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿(35 mm)</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック</td><td>32-103</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿(60 mm)</td><td>ジェネシー・サイエンティフィック</td><td>32-105</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック金型</td><td>VWR</td><td>18000-128</td><td></td></tr><tr><td>スケーペル</td><td>・エクセリント・インターナショナル社</td><td>29552</td><td></td></tr><tr><td>トリトン-X-100</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP 151-500</td><td></td></tr></tbody></table>

全実装免疫学化学と3d再構成を用いた咽頭弓動脈の可視化と解析

Visualization and Analysis of Pharyngeal Arch Arteries using Whole-mount Immunohistochemistry and 3D Reconstruction

咽頭弓動脈(PAA)3、4、および6の不適切な形成または改修は、先天性心疾患の最も重篤な形態のいくつかに寄与する。PAAの形成を研究するために、ベンジルアルコール/ベンジルベンゾアート(BABB)組織クリアリングと共焦点顕微鏡を組み合わせた全実装免疫蛍光を用いたプロトコルを開発した。これにより、細かい細胞分解能で咽頭のアーチ内皮を可視化し、血管構造の3D接続性を可能にします。ソフトウェアを用いて、PAA内の内皮細胞(IC)の数、咽頭アーチ3、4、および6内のPAAを取り巻く血管叢内のICの数を定量化するプロトコルを確立しました。胚全体に適用される場合、この方法論は胚脈管構造の包括的な視覚化および定量的分析を提供する。

ここで示した全実装免疫蛍光プロトコルは、明確でクリーンな結果を生じ、図1Aに見られるように咽頭アーチ内皮の3D再構成を可能にする。各抗体溶液中で十分な時間、胚をインキュベートして、サンプルを通して完全に浸透し、また、抗体インキュベーション後の胚を十分に洗浄することが重要です。図1BBでは、抗体またはブロッキング緩衝液のいずれかで粒子状の結果として大きく、明るいドットが現れます。我々は、各抗体インキュベーションがこの問題を解決した後、使用前に各溶液を遠心分離し、PBSTを長時間に及ぶ。
図2は、プロトコルのセクション7に記載されているように、分析のために咽頭アーチとPAAを表面化するために使用されるプロセスを示...

ここでは、全実装免疫蛍光、組織クリア、共焦点顕微鏡、3D再構成を用いて、咽頭弓動脈3、4、および6個のマウス胚を可視化・解析するプロトコルについて述べている。

全実装免疫学化学と3D再構成を用いた咽頭弓動脈の可視化と解析

Improper formation or remodeling of the pharyngeal arch arteries (PAAs) 3, 4, and 6 contribute to some of the most severe forms of congenital heart ...

この方法は、各咽頭のアーチを区画化することを可能にする。その後、咽頭弓動脈の発達を研究する手段として、内皮細胞数を各アーチで定量することができる。このアプローチの主な利点は、異なる血管構造間の関係を視覚化する能力と、その構造が突然変異体にどのような影響を与えたかを定量的に決定する能力である。大動脈の動脈は、一般的に先天性心疾患で変異する。我々の方法は、突然変異が血管形成および再造法の生理学的過程をどのように変化させるかの研究を可能にする。先天性心疾患のメカニズムに関する洞察を得るためにこの方法を用い、特に光シート顕微鏡の出現によって他のシステムに適用することができる。まず、ガラスピペットを使用して、各マウス胚性日9.5または10.5胚をPBSの1ミリリットルを含む個々の2ミリリットルチューブに移す。固定後、細かい鉗子を使用して後肢のすぐ上に胚を慎重につまみ、横切りカットして胚の後部を取り除きます。胚を透過させるには、PBSをPBSTに置き換え、胚を摂氏4度に置き、一晩穏やかな攪拌を行う。翌日、PBSTを600マイクロリットルのブロッキングバッファーに置き換え、穏やかな攪拌で摂氏4度で16〜18時間のインキュベーションのために胚に触れることなく。翌朝、ブロッキングバッファーを、穏やかな攪拌で摂氏4度で4〜5日間のインキュベーションのために、チューブ当たり関心のある一次抗体の600マイクロリットルに交換する。インキュベーションの終わりに、PBSTの1ミリリットルで1ミリリットルのPBSTを1時間から5時間洗浄し、室温で穏やかな攪拌を行い、1時間ごとにPBSを変え、その後、新鮮なPBSTで摂氏4度で一晩インキュベーションし、翌日にはさらに1時間に4〜5回洗浄します。最後の洗浄後、各チューブのPBSTを摂氏4度で4〜5日間のインキュベーション用に適切な二次抗体溶液600マイクロリットルに交換します。インキュベーションの終わりに、ちょうど実証したように洗浄ごとに新鮮なPBSTの1ミリリットルで胚を洗浄し、ガラスピペットを使用して各胚を個々のプラスチックパラフィン型に穏やかに移します。各胚の周りからPBSTを慎重に取り除き、各胚を矢状位置に向けさせる。その後、各胚がちょうど覆われるまで、各金型に約500マイクロリットルの熱アガロースを素早く加え、アガロースが固まるまでアルミニウム箔で覆われた氷の上にカビを置きます。胚サンプルの脱水のために、各胚の周りにアガロースのブロックを切断するためにきれいなメスを使用し、25%メタノールの1ミリリットルを含む標識された2ミリリットルチューブに移すために鉗子を使用してアガロースを把握する。暗闇の中で穏やかな攪拌で1時間のインキュベーションの後、25%メタノールをチューブあたり50%メタノールの1ミリリットルに置き換え、暗闇の中でさらに1時間のインキュベーションを行います。脱水が終わったら、100%メタノールを50%BABBの1ミリリットルに置き換え、暗闇の中で穏やかな攪拌を伴う1時間のインキュベーションを行います。インキュベーションの最後に、50%BABBをチューブあたり100%BABBの1ミリリットルに置き換え、暗闇の中で穏やかな攪拌を伴う1時間のインキュベーションを行い、続いて100%BABBで2回目のインキュベーションを行います。イメージングのために胚を取り付けるには、速いウェルバンパーから接着剤を取り外し、バンパーを24に6ミリリットル数1.5ガラスカバースリップに置きます。接着剤に優しい圧力をかけてカバースリップとバンパーの間の気泡を取り除き、各チューブから慎重に100%BABBを廃棄します。その後、細かい鉗子を使用して、胚に触れることなく胚を慎重に速い井戸に移し、2番目のカバースリップをバンパーに置きます。3番目の咽頭のアーチ全体に内皮を表面化するには、ソフトウェアで目的の画像を開き、[新しいサーフェスを追加]をクリックします。サーフェス 1 をダブルクリックし、新しいサーフェスの名前を第 3 咽頭アーチに変更します。自動作成をスキップし、手動で編集を選択し、サーフェスの方向を YZ 平面に設定します。スライス位置を使用して、第3のPAAと後部大オルタが接続する場所に第3咽頭アーチ面面を配置します。3 番目の咽頭アーチ面平面が表示されるようにイメージを回転させ、オルソ スライサーをオフにします。[描画]輪郭モードで、距離描画モード機能を選択し、必要に応じてパラメータ設定を調整します。すべてのパラメータが設定されたら、Esc キーを押して[描画]をクリックし、マウス カーソルで 3 番目の咽頭アーチの周囲をトレースします。その後、スライス位置を使用して10〜25スライスを移動し、咽頭アーチの周囲をトレースします。アーチ全体をトレースしたら、[サーフェスを作成]をクリックして、トレース領域のサーフェスを生成します。サーフェス構造のマスキングの場合は、編集メニューで、3 番目の PAA および DAPI のマスク選択を選択し、「OK」をクリックします。次に、新しいチャネルの名前を PAA DAPI として変更します。残りのチャンネルに対してこの手順を繰り返します。PAA とは別に内皮叢を視覚化するには、3 番目の PAA のマスク選択を選択し、DAPI を選択します。[サーフェス外のボクセルを選択]をオフにして、サーフェス内のボクセルを選択します。サーフェス内のボクセルをゼロに設定し、[OK]をクリックします。新しいチャネルを PAA DAPI 以外のチャネルの名前を変更します。残りのチャンネルに対してこの手順を繰り返します。3 番目の PA のマスク選択を選択し、非 PAA DAPI を選択して「OK」をクリックします。新しいチャネルの名前をプレックス DAPI として変更します。残りのチャンネルに対してこの手順を繰り返します。対象の各構造内の個々の内皮細胞を定量化するには、表示調整パネルで、PAA ERGチャンネルを除くすべてのチャンネルをオフにします。プロパティメニューの下で、[新しいスポットを追加]をクリックし、1 PAAの合計内皮細胞数の名前を変更します。青い矢印をクリックし、送信元チャネルの PAA ERG チャネルを選択します。推定 XY 直径を 4 マイクロメートルに調整し、青い矢印をクリックして次のパネルに進みます。スライディングスケールを使用してスポット数を調整し、各ERG陽性内皮細胞核が1つのスポットで表されるようにします。次に、緑色の二重矢印をクリックし、ディスプレイ調整パネルで PAA ERG チャネルをオフにします。PAA VEGFR2 チャネルをオンにして PAA 内皮を視覚化し、[編集]をクリックして[追加/削除]をクリックしてオブジェクトのサーフェスを選択します。次に、Esc キーを押しながら Shift キーを押しながら、VEGFR2 陽性でないスポットを削除し、[統計情報] タブをクリックして内皮細胞の総数を決定します。全体のマウント免疫蛍光は、咽頭のアーチ内皮の3D再構成を可能にする明確でクリーンな結果を生成します。この画像では、大きな明るいドットの存在は、抗体またはブロッキング緩衝液のいずれかで微粒子の結果である。咽頭アーチとPAA表面染色後、マスク機能を使用することで、表面領域を視覚的に分離し、独立して分析することができます。マスキングはまた、各構造内の内皮細胞番号の個別の分析と定量化を可能にする。例えば、ここでのスポット特徴は、ERGを発現する各核に単一スポットを割り当てることによって、PAAおよび神経叢の両方における内皮細胞の総数を定量化するために使用した。この画像では、スポット関数によって生成されたERG陽性VEGFR2陰性スポットが観察できる。したがって、ソフトウェアによって認識される各ドットが実際に単一の内皮細胞を表すことを確認することが不可欠です。きれいな、明確なイメージを得るために、すべての溶液をスピンダウンし、抗体インキュベーション後に各胚を適切かつ徹底的に洗浄することを忘れないでください。BABBは腐食性と毒性があることを覚えておくことが重要です。溶媒を適切に取り扱い捨て、溶融した胚を完全に密封して、BABBの漏れを防ぎます。

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