全実装免疫学化学と3D再構成を用いた咽頭弓動脈の可視化と解析

ここでは、全実装免疫蛍光、組織クリア、共焦点顕微鏡、3D再構成を用いて、咽頭弓動脈3、4、および6個のマウス胚を可視化・解析するプロトコルについて述べている。

この方法は、各咽頭のアーチを区画化することを可能にする。その後、咽頭弓動脈の発達を研究する手段として、内皮細胞数を各アーチで定量することができる。このアプローチの主な利点は、異なる血管構造間の関係を視覚化する能力と、その構造が突然変異体にどのような影響を与えたかを定量的に決定する能力である。

大動脈の動脈は、一般的に先天性心疾患で変異する。我々の方法は、突然変異が血管形成および再造法の生理学的過程をどのように変化させるかの研究を可能にする。先天性心疾患のメカニズムに関する洞察を得るためにこの方法を用い、特に光シート顕微鏡の出現によって他のシステムに適用することができる。

まず、ガラスピペットを使用して、各マウス胚性日9.5または10.5胚をPBSの1ミリリットルを含む個々の2ミリリットルチューブに移す。固定後、細かい鉗子を使用して後肢のすぐ上に胚を慎重につまみ、横切りカットして胚の後部を取り除きます。胚を透過させるには、PBSをPBSTに置き換え、胚を摂氏4度に置き、一晩穏やかな攪拌を行う。

翌日、PBSTを600マイクロリットルのブロッキングバッファーに置き換え、穏やかな攪拌で摂氏4度で16〜18時間のインキュベーションのために胚に触れることなく。翌朝、ブロッキングバッファーを、穏やかな攪拌で摂氏4度で4〜5日間のインキュベーションのために、チューブ当たり関心のある一次抗体の600マイクロリットルに交換する。インキュベーションの終わりに、PBSTの1ミリリットルで1ミリリットルのPBSTを1時間から5時間洗浄し、室温で穏やかな攪拌を行い、1時間ごとにPBSを変え、その後、新鮮なPBSTで摂氏4度で一晩インキュベーションし、翌日にはさらに1時間に4〜5回洗浄します。

最後の洗浄後、各チューブのPBSTを摂氏4度で4〜5日間のインキュベーション用に適切な二次抗体溶液600マイクロリットルに交換します。インキュベーションの終わりに、ちょうど実証したように洗浄ごとに新鮮なPBSTの1ミリリットルで胚を洗浄し、ガラスピペットを使用して各胚を個々のプラスチックパラフィン型に穏やかに移します。各胚の周りからPBSTを慎重に取り除き、各胚を矢状位置に向けさせる。

その後、各胚がちょうど覆われるまで、各金型に約500マイクロリットルの熱アガロースを素早く加え、アガロースが固まるまでアルミニウム箔で覆われた氷の上にカビを置きます。胚サンプルの脱水のために、各胚の周りにアガロースのブロックを切断するためにきれいなメスを使用し、25%メタノールの1ミリリットルを含む標識された2ミリリットルチューブに移すために鉗子を使用してアガロースを把握する。暗闇の中で穏やかな攪拌で1時間のインキュベーションの後、25%メタノールをチューブあたり50%メタノールの1ミリリットルに置き換え、暗闇の中でさらに1時間のインキュベーションを行います。

脱水が終わったら、100%メタノールを50%BABBの1ミリリットルに置き換え、暗闇の中で穏やかな攪拌を伴う1時間のインキュベーションを行います。インキュベーションの最後に、50%BABBをチューブあたり100%BABBの1ミリリットルに置き換え、暗闇の中で穏やかな攪拌を伴う1時間のインキュベーションを行い、続いて100%BABBで2回目のインキュベーションを行います。イメージングのために胚を取り付けるには、速いウェルバンパーから接着剤を取り外し、バンパーを24に6ミリリットル数1.5ガラスカバースリップに置きます。

接着剤に優しい圧力をかけてカバースリップとバンパーの間の気泡を取り除き、各チューブから慎重に100%BABBを廃棄します。その後、細かい鉗子を使用して、胚に触れることなく胚を慎重に速い井戸に移し、2番目のカバースリップをバンパーに置きます。3番目の咽頭のアーチ全体に内皮を表面化するには、ソフトウェアで目的の画像を開き、[新しいサーフェスを追加]をクリックします。

サーフェス 1 をダブルクリックし、新しいサーフェスの名前を第 3 咽頭アーチに変更します。自動作成をスキップし、手動で編集を選択し、サーフェスの方向を YZ 平面に設定します。スライス位置を使用して、第3のPAAと後部大オルタが接続する場所に第3咽頭アーチ面面を配置します。

3 番目の咽頭アーチ面平面が表示されるようにイメージを回転させ、オルソ スライサーをオフにします。[描画]輪郭モードで、距離描画モード機能を選択し、必要に応じてパラメータ設定を調整します。すべてのパラメータが設定されたら、Esc キーを押して[描画]をクリックし、マウス カーソルで 3 番目の咽頭アーチの周囲をトレースします。

その後、スライス位置を使用して10〜25スライスを移動し、咽頭アーチの周囲をトレースします。アーチ全体をトレースしたら、[サーフェスを作成]をクリックして、トレース領域のサーフェスを生成します。サーフェス構造のマスキングの場合は、編集メニューで、3 番目の PAA および DAPI のマスク選択を選択し、「OK」をクリックします。次に、新しいチャネルの名前を PAA DAPI として変更します。

残りのチャンネルに対してこの手順を繰り返します。PAA とは別に内皮叢を視覚化するには、3 番目の PAA のマスク選択を選択し、DAPI を選択します。[サーフェス外のボクセルを選択]をオフにして、サーフェス内のボクセルを選択します。

サーフェス内のボクセルをゼロに設定し、[OK]をクリックします。新しいチャネルを PAA DAPI 以外のチャネルの名前を変更します。残りのチャンネルに対してこの手順を繰り返します。3 番目の PA のマスク選択を選択し、非 PAA DAPI を選択して「OK」をクリックします。新しいチャネルの名前をプレックス DAPI として変更します。

残りのチャンネルに対してこの手順を繰り返します。対象の各構造内の個々の内皮細胞を定量化するには、表示調整パネルで、PAA ERGチャンネルを除くすべてのチャンネルをオフにします。プロパティメニューの下で、[新しいスポットを追加]をクリックし、1 PAAの合計内皮細胞数の名前を変更します。

青い矢印をクリックし、送信元チャネルの PAA ERG チャネルを選択します。推定 XY 直径を 4 マイクロメートルに調整し、青い矢印をクリックして次のパネルに進みます。スライディングスケールを使用してスポット数を調整し、各ERG陽性内皮細胞核が1つのスポットで表されるようにします。

次に、緑色の二重矢印をクリックし、ディスプレイ調整パネルで PAA ERG チャネルをオフにします。PAA VEGFR2 チャネルをオンにして PAA 内皮を視覚化し、[編集]をクリックして[追加/削除]をクリックしてオブジェクトのサーフェスを選択します。次に、Esc キーを押しながら Shift キーを押しながら、VEGFR2 陽性でないスポットを削除し、[統計情報] タブをクリックして内皮細胞の総数を決定します。

全体のマウント免疫蛍光は、咽頭のアーチ内皮の3D再構成を可能にする明確でクリーンな結果を生成します。この画像では、大きな明るいドットの存在は、抗体またはブロッキング緩衝液のいずれかで微粒子の結果である。咽頭アーチとPAA表面染色後、マスク機能を使用することで、表面領域を視覚的に分離し、独立して分析することができます。

マスキングはまた、各構造内の内皮細胞番号の個別の分析と定量化を可能にする。例えば、ここでのスポット特徴は、ERGを発現する各核に単一スポットを割り当てることによって、PAAおよび神経叢の両方における内皮細胞の総数を定量化するために使用した。この画像では、スポット関数によって生成されたERG陽性VEGFR2陰性スポットが観察できる。

したがって、ソフトウェアによって認識される各ドットが実際に単一の内皮細胞を表すことを確認することが不可欠です。きれいな、明確なイメージを得るために、すべての溶液をスピンダウンし、抗体インキュベーション後に各胚を適切かつ徹底的に洗浄することを忘れないでください。BABBは腐食性と毒性があることを覚えておくことが重要です。

溶媒を適切に取り扱い捨て、溶融した胚を完全に密封して、BABBの漏れを防ぎます。