Name: 患者由来胃癌幹細胞のステム関連遺伝子を研究するための条件付きノックダウンと適応球形成アッセイを組み合わせた (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 学ぶ条件付きノックダウンと適応球形成アッセイを用いた患者由来胃癌幹細胞のステム関連遺伝子研究法。この手法はin vitroおよびin vivoでのがん幹細胞研究に応用可能です。

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この研究は広東省自然科学財団(2018A030310586、 2020A1515010989),広東省医学科学研究財団(A2019405)、中国国立自然科学財団(81772957)、科学と科学と 中国広東省の技術プログラム(2017B030301016)、深セン産業情報技術財団(20180309135860)。

本明細書に記載の患者由来胃癌幹細胞を用いた全ての実験は、地元の倫理委員会7によって承認された。
胃癌幹細胞培養
<ol><li>GCSCs完全培養培地の調製<ol>
<li>以下の必須成分を含む新鮮なDME / F12培地を添加することにより、GCSC完全な培養培地を調製します: 20 ng /mL EGF, 10 ng /mL bFGF, 1%インスリン/トランスフェリン/セレナイトナトリウム、0.2%グルコース、0.5%B27、1%グルタマックス、1%非必須アミノ酸、10 μM32メルカプトエタノール、0.75 mg/mL NaHCO 3、10 μMチオグリセリン、100 IU/mLペニシリンおよび100gμM10μM10/m10g/mrepm10/m10g/mmyc0.22 μmフィルターを使用してフィルターと滅菌を行います。 注:GGC完全培養培地は、4°Cで2週間以下で保存することが推奨される。</li>
	</ol></li>
	<li>GCSCsと文化の回復 注:GCSCは以下のように得られた:腫瘍試料は、機械的および酵素的解離を行った。単一細胞懸濁液は、よく散乱した懸濁液からナイロンネットで濾過することにより得られた。得られた癌細胞をGCSCs完全培養培地で培養し、いくつかの細胞は球体を形成するように成長した。これらの球体は、酵素解離を行い、そして、GCSCはCD44/CD54マーカーで染色された細胞集団の細胞蛍光測定による分類によって得ることができる。GCSCの詳細なプロトコルと機能アッセイは7.<ol>
<li>予温性GCSCは37°Cで培養培地を30分以下で完成させた。</li>
		<li>液体窒素貯蔵からGCSCを解凍し、37°Cの水浴で凍結を急速に解凍する。全体の内容が完全に溶けるまでバイアルを渦巻き続けます。 注:37°Cの水浴で凍結した細胞を急速に解凍(<1分)。</li>
		<li>10 mLのGGCC完全培養培地を含む15 mL遠心分離管に、クリオシャルの全内容物を移す。800 x g で 5 分間 RT で遠心分離機。</li>
		<li>上清を慎重に吸引し、新鮮なGCSC完全培地の10 mLに細胞ペレットを懸濁します。セルの懸濁液を100mmペトリ皿に入れます。37°Cのプレートを5%CO2インキュベーター2でインキュベートし、3日目に5mLの新鮮な完全培地を加えます。</li>
	</ol></li>
	<li>GCSCs腫瘍球のサブカルチャー 注:腫瘍球中心のGCSCは、直径80〜100μmまで成長する球のサイズの前に十分な栄養素しか持っていません。暗くて低い屈折球が現れたら(約6日間の培養)、腫瘍球をサブ培養する必要がある。<ol>
<li>皿を穏やかに振り、GcSCs腫瘍球培養培地(培地および非接着性腫瘍球)を無菌15 mL遠心分離管に移します。大きな中量の場合は、より大きな遠心管が必要になることがあります。</li>
		<li>600 x g で 5 分間遠心分離し、上清を慎重に処分します。遠心分離後、オフホワイトペレットが見えます。</li>
		<li>2 mLの細胞解離液を加えて、37°Cで機械的および酵素的解離のためにペレットを再懸濁させます。 消化手順で2〜3分ごとに10回上下に静かにピレットし、腫瘍球が単一細胞懸濁液に分散するまで球体を分解する。この全解離プロセスは15分未満にすることをお勧めします。 メモ:顕微鏡で目視チェックを行い、大きな球体や細胞の凝集体が残っていないか確認します。</li>
		<li>10 mLの新鮮な事前温めたGCSC完全な培養培地(細胞剥離液の体積5倍)を加えて、消化手順と遠心分離機を800 x g のRTで5分間終了します。</li>
		<li>上清を捨て、1 mLの新鮮な温めるGCSC完全な培地で細胞を再懸濁します。10 mLの新鮮な事前温めたGCSC完全な培養培地で適切な数の細胞を新しい100mmペトリ皿に播種し、37°C、5%CO2でインキュベートする。2</li>
		<li>5 mLの新鮮な温め込み完了培地を加えて3日後に腫瘍球培養液を再供給する。6日後、腫瘍球が直径80〜100μmまで成長すると、通過細胞が成長する。</li>
	</ol></li>
	<li>GCSCsの凍結保存 注:腫瘍球に直接培地を加えて、GCSC細胞を凍結保存しないでください。細胞保護剤が細胞の長期安定的な貯蔵を確実にするために細胞に入ることができるように、GCSCの腫瘍球を単一細胞に消化する必要があります。細胞が健全な状況にあり、汚染がないようにしてください。<ol>
<li>GcSCs腫瘍球を収穫する。600 x g で 5 分間の遠心分離機。</li>
		<li>上清を捨て、細胞解離液2 mLを加えて、37°CでGCSC腫瘍球を解離する。 10 mLのGMC完全培養培地を添加して消化手順を終了する。</li>
		<li>5分間800 x g で遠心分離機を使用し、単一のGCSCsを収集します。</li>
		<li>無血清凍結保存剤培地でGCSCを静かに中断します。推奨される最終濃度は5 x 105- 5 x 106 細胞/mLです。</li>
		<li>細胞懸濁液を1 mLアリコートでマークされた極低温バイアルに分配する。</li>
		<li>すぐにイソプロパノールチャンバーに細胞を含むクリボビアルを置き、-80°Cで保存します。 バイアルを翌日液体窒素に移し、長期保存します。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 誘導可能なノックダウンGCSCsラインの生成
注意:組換えレンチウイルスは、国立衛生研究所と疾病管理センターによってレベル2の生物として指定されています。レンチウイルスを含む作業は、これらのレンチウイルスシステムによって生成されるウイルス上清が潜在的に危険な組換えウイルスを含むことができることを考慮して、バイオセーフティレベル2施設の維持を必要とする。
<ol><li>レンチウイルス粒子の生成<ol>
<li>表 1 の設計に基づいて、ヒトクラスターを標的とする誘導性shRNAとGeneChem(GV307)を含む2つのレンチウイルスベクターを合成する(GV307ベクターには、TetIIP-TurboRFP-MCS(MIR30)-Ubi-TetR-IRES-Pomycin)。</li>
		<li>シード 4 x 106 293T レンティウイルス包装細胞を100 mmペトリ皿に、10 mLのDMEMを10%牛血清で補います。</li>
		<li>293T細胞を37°C、5%CO2で一晩2インキュベートする。293T細胞密度がトランスフェクションの日に約50〜80%コンフルエントであることを確認してください。</li>
		<li>減らされた血清媒体を室温に持ち込み、 表2に記載されているようにチューブAとチューブBを準備する。</li>
		<li>チューブAをチューブBに移し、よく混ぜ、室温で20分間インキュベートし、脂質DNA複合体を調製します。</li>
		<li>5 mLの培地を除去し、脂質DNA複合体を添加する前に、合計5 mLを残します。</li>
		<li>培養皿に5mLの脂質DNA複合体を滴下して加え、皿をそっと渦巻いて複合体を分配する。 注:293T細胞を乱さないように、慎重に皿の壁に液体を分配します。</li>
		<li>37°Cで24時間、5%CO2で培養培養皿。</li>
		<li>トランスフェクション後24時間後、トランスフェクション媒体を慎重に取り出し、10%FBSを添加した10mLの予温DMEMにそっと交換してください。37°Cで24時間インキュベート、5%CO2. 注:すべての上清と先端は、処分前に10%漂白剤で処理する必要があります。</li>
		<li>トランスフェクション後約48時間後、レンチウイルス含有上清の10mLを収穫する。 注:すべての細胞培養容器および先端は、処分前に10%の漂白剤で処理する必要があります。</li>
		<li>0.45 μmの細孔フィルターを使用してレンチウイルス上清をフィルターして、細胞の破片を除去します。 注:すべてのフィルタと注射器は、処分前に10%漂白剤で処理する必要があります。</li>
		<li>移動は、滅菌容器に上清を明確にし、Lenti-Xコンセントレータ(清澄上上清の1/3ボリューム)を加えて、穏やかな反転によって混合します。</li>
		<li>4°Cで一晩インキュベートした混合物。</li>
		<li>遠心分離機サンプルは4°Cで45分間1,500 x g で行う。 遠心分離後、オフホワイトペレットが見えます。上清を慎重に除去し、ペレットを乱さないよう注意してください。 注:すべての上清と先端は、処分前に10%漂白剤で処理する必要があります。</li>
		<li>ウイルスストックとして10%FBSを補ったDMEMの1mLにペレットを静かに再懸濁し、-80°Cで保管してください。</li>
	</ol></li>
	<li>安定したトランスフェクト細胞株の生成<ol>
<li>シード 6 x 106 GCSC は 100 mm ペトリ皿に、10 mL DMEM は 37 °C で 24 時間 10% FBS、5%CO2 (感染前の合流点 70-80% ) を補います。</li>
		<li>皿の中に培地を吸引し、ポリブレン試薬(5 μg/mL)を含む完全なDMEM培地の4 mLで希釈した濃縮レンチウイルス粒子を皿に加えます。37°Cで18時間インキュベート、5%CO2. 注:ポリブレンの最適な濃度は、細胞の種類に依存し、有効な濃度を決定するために異なる濃度でテストする必要があります。それ以外の場合は、経験的に決定され得るが、通常は2〜10μg/mLの範囲である。すべてのチューブと先端は、処分前に10%の漂白剤で処理する必要があります。</li>
		<li>培地を交換し、10%FBS培地で10mLのDMEMに交換し、37°Cで24時間インキュベートし、5%CO2でインキュベートする。2 注:すべての媒体と先端は、処分前に10%の漂白剤で処理する必要があります。</li>
		<li>上清を細胞デブリで吸引し、ピューロマイシン(2.5 μg/mL)を含む10%FBS培地で補った新鮮なDMEMと交換し、37°Cで24時間インキュベート2し、5%CO2をインキュベートする。次に、ピューロマイシン(5 μg/mL)を含む10%FBS培地で補充された新鮮なDMEMを交換し、37°Cで2インキュベートし、さらに24時間の場合は5%CO2をインキュベートします。</li>
		<li>カルシウムとマグネシウムを含まないDPBSの5 mLで接着性のGcSCを2回リンスします。</li>
		<li>1 mLの予温細胞解離液でGCSCsを解離し、37°Cで2〜3分間インキュベートする。</li>
		<li>5 mLの新鮮な事前温めたGCSC完全な培養培地を細胞懸濁液に加える。</li>
		<li>細胞を凍結保存するための15 mL遠心管(チューブA)に3mLを分配し、他の3mLを15 mL遠心管(チューブB)に分配してドキシサイクリンを誘導する。</li>
		<li>遠心管AとチューブBを800xgでg5分間用いた。</li>
		<li>無血清凍結保存剤培地1 mLでチューブAのペレットを再懸濁し、バイアルを-80°Cに一晩移し、液体窒素貯蔵中に取り出します。</li>
		<li>上清を吸引し、チューブBの細胞を1mLの新鮮な前温めたGSC完全な培養培地中に再懸濁させた。適切な数の細胞を10 mL新鮮な事前温められたGCSCの新しい100 mmペトリ皿に播種し、ドキシサイクリン(Dox)(2.5 μg/mL)を用いた完全な培養培地を、37°Cで48時間インキュベートし、5%CO2でインキュベートします。2 注: Dox の最適濃度は、細胞のラインによって異なる場合があります。各細胞株は、KDの有効濃度と細胞上の毒性を決定するために、異なるDox濃度でテストする必要があります。</li>
		<li>ウェスタンブロッティングにより、GCSCにおけるクラスタリングの安定的な抑制を確認する。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 球形成アッセイ
<ol><li>凍結誘導可能なノックダウン GCSCs 回線を解凍します(ステップ 1.2 を参照)。</li>
	<li>自動化セルカウンターを使用して、10 μLサンプルの生存可能なセル密度を決定します。</li>
	<li>事前に温められたGCSC完全な培養培地で容積を調節して、2 x 104 個の生存細胞/mLの濃度を得る。</li>
	<li>3つの新しい96ウェル超低添付着物培養プレートウェル(0.1 mL /well)各グループに分配します。</li>
	<li>5%CO2で37°Cのインキュベーターで細胞をインキュベー2トする。球体形成は3-10日以内に起こるべきである。腫瘍球形成の可視化を2日ごとに監視し、記録する。 注:腫瘍球形成の障害の場合には、培地を変更することは推奨されません。これらの腫瘍球は、単一および凝集細胞から容易に区別されるべきである。</li>
	<li>イメージングソフトウェアを用いて形成された腫瘍球のサイズを評価することにより、腫瘍球形成結果を決定する。</li>
</ol>

<ol><li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2018%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).</li>
<li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%2C+2016%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics, 2016.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 66 (1), 7-30 (2016).</li>
<li>Valent, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cell+definitions+and+terminology%3A+the+devil+is+in+the+details%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (11), 767-775 (2012).</li>
<li>Pützer, B. M., Solanki, M., Herchenröder, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+cancer+stem+cell+targeting%3A+How+to+strike+the+evil+at+its+root%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Advances in cancer stem cell targeting: How to strike the evil at its root.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 120, 89-107 (2017).</li>
<li>Saygin, C., Matei, D., Majeti, R., Reizes, O., Lathia, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+Cancer+Stemness+in+the+Clinic%3A+From+Hype+to+Hope%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting Cancer Stemness in the Clinic: From Hype to Hope.</a> Cell Stem Cell. 24 (1), 25-40 (2019).</li>
<li>Takaishi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+gastric+cancer+stem+cells+using+the+cell+surface+marker+CD44%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification of gastric cancer stem cells using the cell surface marker CD44.</a> Stem Cells. 27 (5), 1006-1020 (2009).</li>
<li>Chen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+cancer+stem+cells+in+tumor+tissues+and+peripheral+blood+derived+from+gastric+adenocarcinoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of cancer stem cells in tumor tissues and peripheral blood derived from gastric adenocarcinoma patients.</a> Cell Research. 22 (1), 248-258 (2012).</li>
<li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyes+wide+open%3A+a+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).</li>
<li>Hannon, G. J., Rossi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlocking+the+potential+of+the+human+genome+with+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Unlocking the potential of the human genome with RNA interference.</a> Nature. 431 (7006), 371-378 (2004).</li>
<li>Seibler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+gene+knockdown+in+mice+using+a+tight%2C+inducible+shRNA+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Reversible gene knockdown in mice using a tight, inducible shRNA expression system.</a> Nucleic Acids Research. 35 (7), e54(2007).</li>
<li>Xiong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Verteporfin+blocks+Clusterin+which+is+required+for+survival+of+gastric+cancer+stem+cell+by+modulating+HSP90+function%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Verteporfin blocks Clusterin which is required for survival of gastric cancer stem cell by modulating HSP90 function.</a> International Journal of Biological Sciences. 15 (2), 312-324 (2019).</li>
<li>Ohkawa, J., Taira, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+the+functional+activity+of+an+antisense+RNA+by+a+tetracycline-responsive+derivative+of+the+human+U6+snRNA+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Control of the functional activity of an antisense RNA by a tetracycline-responsive derivative of the human U6 snRNA promoter.</a> Human Gene Therapy. 11 (4), 577-585 (2000).</li>
</ol>

利益相反は宣言されていません。

GCは、世界で癌関連死の第3位の原因です。GCSCは胃癌の再発、転移および薬剤耐性において重大である。胃癌患者のGCSCを使用することで、弱点を探索し、GC患者の治療のための標的薬を開発することができます。
球形成アッセイは、がん幹細胞の自己再生ポテンシャルをインビトロで調べるのに有用な方法である。結果は、形成された球の割合を、シードされた単一細胞の元の数で割って提示することができる。我々は、このアッセイの結果を改善し、他のタイプの癌幹細胞の再現性を容易にするために、いくつかの時点ですべての細胞/球の平均サイズを計算するために、独自の方法を適応させました。このアッセイの結果は、初期のシード細胞の数に大きく依存することを証明しました。これは、初期細胞の単離を維持し、球状コロニーの数を正確に測定する(細胞凝集を除く)ためのこのアッセイの重要なポイントです。また、細胞の凝集や単一の細胞から球を明確に区別するために、カウント時間を最適化することが重要です。
Tet-誘導可能なシステムは、このプロトコルのクラスタリングと同様に、インビト...

胃癌(GC)は、癌の最も一般的かつ致命的なタイプの1である。GC療法における併用手術、化学療法および放射線療法の進歩にもかかわらず、予後は依然として悪く、5年生存率は依然として非常に低い2である。再発と転移は、治療後の死亡を引き起こす主な理由です。
癌幹細胞(CSC)は、腫瘍3を再構成する異なる細胞系統を自己更新し、生成する能力を有する癌細胞のサブセットである。CSCは、自己再生および新しい腫瘍の播種の能力と、伝統的な化学および放射線療法4に対する耐性のために、癌の再発および転移の原因であると考えられている。したがって、CSCを標的とし、CSCを排除することは、治療を改善し、癌患者の死亡率を減らすエキサイティングな可能性を提供する。
CSCは、多くのタイプの固形腫瘍5から単離されている。2009年には、ヒト胃癌細胞株から分離された胃癌幹細胞(GCSC)が、もともと高石ららによって記述された。Chenたちの研究グループは、まずヒト胃腺癌(GAC)腫瘍組織からGCSCを同定し、精製した7.これらの知見は、GCSCs生物学を研究する機会を提供するだけでなく、臨床的に非常に重要な役割を提供する。
CSCの特長は球体8を形成する能力です。単一細胞は低密度で非接着条件でメッキされ、自己再生を有する細胞のみが球体と呼ばれる固体球状のクラスターに成長することができる。このように、球形成アッセイは、金標準アッセイと見なされ、インビトロで幹細胞の自己再生電位を評価するために広く使用されている。
RNA干渉(RNAi)は、特定の遺伝子9のノックダウンによる遺伝子機能を研究するための強力な研究ツールです。しかし、長期安定遺伝子ノックダウン技術には、細胞の生存に不可欠な遺伝子の機能を探求するという課題など、一定の制限があります。条件付きRNAiシステムは、誘導剤の投与によって時間的および/または特別に制御された方法で所望の遺伝子のダウンレギュレーションに有用であり得る。テトラサイクリン(Tet)誘導性システムは、最も広く使用されている条件付きRNAiシステム10の1つである。Tet誘導可能なシステムは、外因性誘導体(優先的にドキシサイクリン、ドキックス)の添加時にshRNAの発現を制御することによって標的遺伝子サイレンシングを誘導することができる。Tet-誘導可能なシステムは、テトオンシステムとテトオフシステムの2種類に分けられます。shRNAの発現は、インデューサーの存在下でオン(Tet-On)またはオフ(Tet-Off)することができる。インデューサーを含まないTet-ON系では、構成的に発現したTetリプレッサー(TetR)は、shRNA発現に対するテト応答性ポルIII依存性プロモーターを含むTet応答性要素(TRE)配列に結合し、shRNAの発現を抑制する。Doxの添加時に、TetRはテト応答性ポルIII依存プロモーターから隔離される。これはshRNAの発現を促進し、遺伝子ノックダウンにつながる。
ここで説明するプロトコルは、機能的テトラサイクリン誘導性shRNAシステムと適応球形成アッセイを用いて患者由来のGCSCにおけるクラスタリングインの機能を研究する。11我々は、GCSC自己再生におけるクラスタリングインの効果を研究するために、上記のプロトコルを使用する。この方法論は、他のタイプの癌幹細胞にも適用可能である。

<table><tbody><tr><td>0.22 以上 μ;m フィルター</td><td>ミリポア</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>1-チオグリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Gibco</td><td>2068586</td><td></td></tr><tr><td>アニマルフリー 組換えヒト EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td></td></tr><tr><td>B-27 サプリメント (50X)、無血清</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 超低アタッチメント マルチウェルプレート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3474</td><td></td></tr><tr><td>Countess Cell Counting Chamber スライド</td><td>Invitrogen</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>Countess II Automated Cell Counter</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6152</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Gibco</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, High Glucose, GlutaMAX, Pyruvate</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>10569044</tr><tr><td>ドキシサイクリン ヒクレート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>DPBS、カルシウム不使用、マグネシウム不使用</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum、認定、オーストラリア</td><td>Gibco</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>インスリン、トランスフェリン、セレン溶液 (ITS -G)、100X</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>41400045</tr><tr><td>レンチウイルスベクター</td><td>GeneChem</td><td>GV307</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X 濃縮器</td><td>Takara</td><td>631232</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution, 100X</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 & micro;m、PVDF、33 mm、ガンマ線滅菌</td><td>ミリポア</td><td>SLHV033RB</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 一般長期保存 極低温チューブ</td><td>Thermo Scientific</td><td>5000-1020</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Cell Culture/Petri Dishes</td><td>Thermo Scientific</td><td>171099</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin, Liquid</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pHelper 1.0 (gag/pol component)</td><td>GeneChem</td><td>pHelper 1.0</td><td></td></tr><tr><td>pHelper 2.0 (VSVG component)</td><td>GeneChem</td><td>pHelper 2.0</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>Nadium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>STEM-CELLBANKER 凍結保存培地</td><td>ZENOAQ</td><td>11890</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase 細胞解離液</td><td>Gibco</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 1 M Tris-HCI Buffer, pH 7.5</td><td>Invitrogen</td><td>15567027</td><td></td></tr><tr><td>ZEISS 倒立顕微鏡</td><td>ZEISS</td><td>Axio Vert.A1</td><td></td></tr></tbody></table>

患者由来胃癌幹細胞のステム関連遺伝子を研究するための条件付きノックダウンと適応球形成アッセイを組み合わせた

Combined Conditional Knockdown and Adapted Sphere Formation Assay to Study a Stemness-Associated Gene of Patient-derived Gastric Cancer Stem Cells

がん幹細胞(CSC)は、治療後の腫瘍の開始、発達および再発に関与し、過去数十年の間に多くの研究の注目を集めています。したがって、がん細胞幹細胞に関与する重要な遺伝子の役割を調べる方法を開発することが重要です。胃癌(GC)は、最も一般的で致命的なタイプの癌の1つです。胃癌幹細胞(GCSC)は、胃癌再発、転移および薬剤耐性の根源であると考えられている。GCSCs生物学を理解することは、標的療法の開発を進め、最終的には患者の死亡率を減らすために必要である。本プロトコルでは、患者由来のGCSCsのステムに及ぼすクラスタリングの効果を研究するために、条件付きノックダウンシステムと適合球形成アッセイを用いた実験計画を提示する。このプロトコルは、異なるタイプのCSCにおけるステム関連遺伝子のインビトロおよびインビボ機能の両方を研究するために容易に適応することができる。

原発性ヒト胃腺癌由来の胃癌幹細胞を無血清培地で培養した。6日後、単一細胞状表現型(図1A)から細胞が拡大して大きな球体を形成する(図1B)。
GCSCにおけるクラスタリングインの機能を評価するために、上述のプロトコルに従って、ジロニンおよびスクランブルに対するshRNA配列をTet-GV307-RFP-Poベクターにクローン化した。テトラサイクリン調節shRNA-クラスタイン発現ベクターを安定的にトランスフェクトしたGCSCを生成し、48時間のドキシサイクリン(図2)で処理した(そして、shRNAはコントロールとしてスクランブルした)。クラスタニンの発現レベルはウェスタンブロットで検証され、その後、濃度測定法...

本プロトコルでは、患者由来のGCSCsのステムに及ぼすクラスタリングの効果を研究するために、条件付きノックダウンシステムと適合球形成アッセイを用いた実験計画を提示する。このプロトコルは、異なるタイプのCSCにおけるステム関連遺伝子のインビトロおよびインビボ機能の両方を研究するために容易に適応することができる。

Cancer stem cells (CSCs) are implicated in tumor initiation, development and recurrence after treatment, and have become the center of attention of many ...

癌幹細胞は、薬剤耐性に再発した癌の転移に関与している。このプロトコルは、がん幹細胞の主要遺伝子の機能を調査するための効率的な方法を提供します。条件付きノックダウンシステムと適応球形成アッセイを用いて、この方法は、異なるタイプの癌幹細胞における幹細胞関連遺伝子に対するインビトロおよびインビボ機能の研究に容易に適応される。手順を実証すると、私の研究室の研究アシスタントであるユーティン・リーとシャンユー・タンです。レンチウイルス粒子を生成するには、400万個の293Tレンチウイルス包装細胞を100ミリのペトリ皿に種を入れ、10%FBSを補ったDMEMを10ミリリットルで洗い出します。細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%で一晩インキュベートし、トランスフェクションの日に細胞が50〜80%コンフルエントであることを確認します。減らされた血清培地を室温に持ち込み、原稿の指示に従ってチューブAとBを準備します。チューブAの内容物をチューブB.Mixウェルに加え、室温で15分間インキュベートして脂質DNA複合体を調製します。培養皿から培地を5ミリリットル除去する。その後、細胞培養皿に脂質DNA複合体の5ミリリットルを加え、賢明に落とし、皿を穏やかに渦巻きます。37°Cと5%の二酸化炭素で24時間培養します。インキュベーション後、トランスフェクション培地を慎重に取り出し、10%FBSを補った10ミリリットルのあらかじめ温めたDMEMに交換してください。さらに24時間細胞をインキュベートする。トランスフェクション後約48時間、上清を含むレンチウイルス10ミリリットルを収穫し、0.45マイクロメートルの注ぎフィルターで濾過して細胞の破片を取り除きます。すべての細胞培養容器、先端、フィルターおよび注射器はレンチウイルスを含んでいて、処分の前に10%漂白剤で処理されるべきである。明確化した上清を滅菌容器に移します。Lenti-Xコンセントレータを追加し、穏やかな反転と混ぜます。一晩摂氏4度で混合物をインキュベートします。翌日、摂氏4度で45分間Gの1500倍のサンプルを遠心します。上清を慎重に取り除き、底部のペレットを乱さないよう注意してください。ペレットを10%FBSで補ったDMEMの1ミリリットルで静かに再中断し、マイナス80°Cで保存します。種子 600 万胃癌幹細胞または GCSC 100 ミリペトリ皿に 10 ミリリットル DMEM 10%FBS を補った.24時間摂氏37度、炭酸ガス5%で培養します。細胞が70〜80%の合流度に達したら、皿から培地を吸引し、ポリブレン試薬を含む完全なDMEM培地の4ミリメートルで希釈した濃縮レンチウイルス粒子を加える。細胞を18時間培養器に戻します。ポリブレンは、有効な濃度を決定するために異なる条件でテストする必要があります, これは通常、ミリリットルあたり2〜10ミリグラムの範囲である.18時間後、培地を10ミリリットルのDMEMを10%FBSに交換し、細胞をインキュベーターに24時間戻します。その後、上清を細胞の破片で吸引し、10%FBSと2.5マイクログラムのピューロマイシンを1ミリリットルで補充した新鮮なDMEMを加える。さらに24時間細胞をインキュベートする。その後、10%FBSと1ミリリットルピューロマイシン当たり5マイクログラムを補充新鮮なDMEMに再び培地を変更します。さらに24時間のインキュベーションの後、カルシウムとマグネシウムなしで5ミリリットルのDPBSで接着性のGCSCを2回リンスします。1ミリリットルの温め込まれた細胞解離液で細胞を解離し、摂氏37度で2〜3分間インキュベートする。次いで、新鮮な前温めたGCSC完全な培養培地を細胞懸濁液に5ミリリットル加える。この懸濁液の3ミリリットルを凍結保存用の15ミリリットル遠心管に分配し、他の3ミリリットルを別のチューブに分配して、ドキシサイクリンを誘導します。遠心分離機は両チューブをGの800倍で5分間用いた。次いで、チューブBから上清を吸引し、新鮮な前温められたGCSC完全な培養培地の1ミリリットルで細胞を再懸濁した。新鮮な事前温められたGCSC完全な培養培地と1ミリリットルのドキシサイクリンあたり2.5マイクログラムの新しい100ミリメートルペトリ皿に適切な数の細胞を播種します。その後、48時間、皿をインキュベートします。自動セルカウンターを使用して、細胞の10マイクロリットルサンプルの密度を決定します。次に、予め温められたGCSC完全な培養培地で体積を調整し、1ミリリットル当たり20,000個の生存細胞の濃度を得る。新しい、超低い取り付け96ウェル培養プレートの各ウェルに細胞懸濁液の100マイクロリットルを分配する。5%の二酸化炭素で37°Cで細胞をインキュベートします。球体形成は3~10日以内に起こる。2日ごとに腫瘍球形成を画像化する。原発性ヒト胃腺癌由来の胃癌幹細胞を、血清遊離培地で培養した。6日後、細胞は表現型のような単細胞から大きな球体に拡大した。GCSCにおけるクラスタリングインの機能を評価するために、クラスタリングインに対する短いヘアピンRNA配列をTet-GV307-RFP-Poベクターにクローン化した。発現ベクターをトランスフェクトした細胞を、ドキシサイクリンで48時間処理した。次に、ウェスタンブロットによりクラスタイン発現を検証し、デンジトメトリーで定量した。GCSCにおけるドキシサイクリンおよびキロンチンのノックダウンの存在は、腫瘍球形成を阻害した。スクランブルされたshRNAコントロールを使用して導入した細胞では腫瘍球形成の阻害は認められなかったが、ドキシサイクリンだけでは腫瘍球形成を阻害しなかったことを示す。これらの結果は、クラスタリングインサイレンシング後、GCSCがゆっくりと成長し、腫瘍球を形成できないことを示唆している。このデータに基づいて、クロクラスタリングは、GCSCsの自己再生活性を促進する上で重要な役割を果たし、胃癌患者における癌幹細胞を抑制するための有望な薬物標的となり得る可能性を示している。腫瘍球は、個々の細胞または凝集細胞上の固体丸い構造であるべきであり、腫瘍球と考えるべきではない。しかし、一部の癌幹細胞は、典型的な腫瘍球構造を形成しない場合がある。この手順は、vitroで再生可能な可能性のために癌幹細胞を調べるための他の方法に従うことができる。例えば、ステム関連マーカーの発現を検討することができる。このプロトコルは、生存上の幹細胞などのがん幹細胞における重要な遺伝子の機能を研究するために拡張することができます。

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患者由来胃癌幹細胞のステム関連遺伝子を研究するための条件付きノックダウンと適応球形成アッセイを組み合わせた

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