患者由来胃癌幹細胞のステム関連遺伝子を研究するための条件付きノックダウンと適応球形成アッセイを組み合わせた
2020年5月9日
本プロトコルでは、患者由来のGCSCsのステムに及ぼすクラスタリングの効果を研究するために、条件付きノックダウンシステムと適合球形成アッセイを用いた実験計画を提示する。このプロトコルは、異なるタイプのCSCにおけるステム関連遺伝子のインビトロおよびインビボ機能の両方を研究するために容易に適応することができる。
癌幹細胞は、薬剤耐性に再発した癌の転移に関与している。このプロトコルは、がん幹細胞の主要遺伝子の機能を調査するための効率的な方法を提供します。条件付きノックダウンシステムと適応球形成アッセイを用いて、この方法は、異なるタイプの癌幹細胞における幹細胞関連遺伝子に対するインビトロおよびインビボ機能の研究に容易に適応される。
手順を実証すると、私の研究室の研究アシスタントであるユーティン・リーとシャンユー・タンです。レンチウイルス粒子を生成するには、400万個の293Tレンチウイルス包装細胞を100ミリのペトリ皿に種を入れ、10%FBSを補ったDMEMを10ミリリットルで洗い出します。細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%で一晩インキュベートし、トランスフェクションの日に細胞が50〜80%コンフルエントであることを確認します。
減らされた血清培地を室温に持ち込み、原稿の指示に従ってチューブAとBを準備します。チューブAの内容物をチューブB.Mixウェルに加え、室温で15分間インキュベートして脂質DNA複合体を調製します。培養皿から培地を5ミリリットル除去する。
その後、細胞培養皿に脂質DNA複合体の5ミリリットルを加え、賢明に落とし、皿を穏やかに渦巻きます。37°Cと5%の二酸化炭素で24時間培養します。インキュベーション後、トランスフェクション培地を慎重に取り出し、10%FBSを補った10ミリリットルのあらかじめ温めたDMEMに交換してください。
さらに24時間細胞をインキュベートする。トランスフェクション後約48時間、上清を含むレンチウイルス10ミリリットルを収穫し、0.45マイクロメートルの注ぎフィルターで濾過して細胞の破片を取り除きます。すべての細胞培養容器、先端、フィルターおよび注射器はレンチウイルスを含んでいて、処分の前に10%漂白剤で処理されるべきである。
明確化した上清を滅菌容器に移します。Lenti-Xコンセントレータを追加し、穏やかな反転と混ぜます。一晩摂氏4度で混合物をインキュベートします。
翌日、摂氏4度で45分間Gの1500倍のサンプルを遠心します。上清を慎重に取り除き、底部のペレットを乱さないよう注意してください。ペレットを10%FBSで補ったDMEMの1ミリリットルで静かに再中断し、マイナス80°Cで保存します。
種子 600 万胃癌幹細胞または GCSC 100 ミリペトリ皿に 10 ミリリットル DMEM 10%FBS を補った.24時間摂氏37度、炭酸ガス5%で培養します。細胞が70〜80%の合流度に達したら、皿から培地を吸引し、ポリブレン試薬を含む完全なDMEM培地の4ミリメートルで希釈した濃縮レンチウイルス粒子を加える。
細胞を18時間培養器に戻します。ポリブレンは、有効な濃度を決定するために異なる条件でテストする必要があります, これは通常、ミリリットルあたり2〜10ミリグラムの範囲である.18時間後、培地を10ミリリットルのDMEMを10%FBSに交換し、細胞をインキュベーターに24時間戻します。
その後、上清を細胞の破片で吸引し、10%FBSと2.5マイクログラムのピューロマイシンを1ミリリットルで補充した新鮮なDMEMを加える。さらに24時間細胞をインキュベートする。その後、10%FBSと1ミリリットルピューロマイシン当たり5マイクログラムを補充新鮮なDMEMに再び培地を変更します。
さらに24時間のインキュベーションの後、カルシウムとマグネシウムなしで5ミリリットルのDPBSで接着性のGCSCを2回リンスします。1ミリリットルの温め込まれた細胞解離液で細胞を解離し、摂氏37度で2〜3分間インキュベートする。次いで、新鮮な前温めたGCSC完全な培養培地を細胞懸濁液に5ミリリットル加える。
この懸濁液の3ミリリットルを凍結保存用の15ミリリットル遠心管に分配し、他の3ミリリットルを別のチューブに分配して、ドキシサイクリンを誘導します。遠心分離機は両チューブをGの800倍で5分間用いた。次いで、チューブBから上清を吸引し、新鮮な前温められたGCSC完全な培養培地の1ミリリットルで細胞を再懸濁した。
新鮮な事前温められたGCSC完全な培養培地と1ミリリットルのドキシサイクリンあたり2.5マイクログラムの新しい100ミリメートルペトリ皿に適切な数の細胞を播種します。その後、48時間、皿をインキュベートします。自動セルカウンターを使用して、細胞の10マイクロリットルサンプルの密度を決定します。
次に、予め温められたGCSC完全な培養培地で体積を調整し、1ミリリットル当たり20,000個の生存細胞の濃度を得る。新しい、超低い取り付け96ウェル培養プレートの各ウェルに細胞懸濁液の100マイクロリットルを分配する。5%の二酸化炭素で37°Cで細胞をインキュベートします。
球体形成は3~10日以内に起こる。2日ごとに腫瘍球形成を画像化する。原発性ヒト胃腺癌由来の胃癌幹細胞を、血清遊離培地で培養した。
6日後、細胞は表現型のような単細胞から大きな球体に拡大した。GCSCにおけるクラスタリングインの機能を評価するために、クラスタリングインに対する短いヘアピンRNA配列をTet-GV307-RFP-Poベクターにクローン化した。発現ベクターをトランスフェクトした細胞を、ドキシサイクリンで48時間処理した。
次に、ウェスタンブロットによりクラスタイン発現を検証し、デンジトメトリーで定量した。GCSCにおけるドキシサイクリンおよびキロンチンのノックダウンの存在は、腫瘍球形成を阻害した。スクランブルされたshRNAコントロールを使用して導入した細胞では腫瘍球形成の阻害は認められなかったが、ドキシサイクリンだけでは腫瘍球形成を阻害しなかったことを示す。
これらの結果は、クラスタリングインサイレンシング後、GCSCがゆっくりと成長し、腫瘍球を形成できないことを示唆している。このデータに基づいて、クロクラスタリングは、GCSCsの自己再生活性を促進する上で重要な役割を果たし、胃癌患者における癌幹細胞を抑制するための有望な薬物標的となり得る可能性を示している。腫瘍球は、個々の細胞または凝集細胞上の固体丸い構造であるべきであり、腫瘍球と考えるべきではない。
しかし、一部の癌幹細胞は、典型的な腫瘍球構造を形成しない場合がある。この手順は、vitroで再生可能な可能性のために癌幹細胞を調べるための他の方法に従うことができる。例えば、ステム関連マーカーの発現を検討することができる。
このプロトコルは、生存上の幹細胞などのがん幹細胞における重要な遺伝子の機能を研究するために拡張することができます。
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概要
このプロトコルは、条件付きノックダウンシステムと適応した球体形成アッセイを使用して、患者由来のGCSCの幹性にクラストリンの効果を研究するための実験設計を提示します。様々な種類のがん幹細胞における幹性関連遺伝子のin vitroおよびin vivo研究に容易に適応できます。
主要な研究要素
科学の分野
- がん生物学
- 幹細胞研究
- 遺伝子機能解析
背景
- がん幹細胞（CSC）はがんの再発と転移に寄与します。
- CSCにおける特定の遺伝子の役割を理解することは、標的療法を開発するために重要です。
- このプロトコルはクラストリン遺伝子とその幹性への影響に焦点を当てています。
- この方法は異なるがんタイプへの柔軟な適用を可能にします。
研究の目的
- 患者由来のGCSCの幹性におけるクラストリンの役割を調査すること。
- 幹性関連遺伝子を研究するための信頼性の高い方法を提供すること。
- CSCの生物学と潜在的な治療標的の理解を深めること。
使用した方法
- 遺伝子サイレンシングのための条件付きノックダウンシステム。
- 幹性を評価するための適応した球体形成アッセイ。
- in vitroおよびin vivoの実験設計。
- 遺伝子送達のためのレンチウイルス粒子の使用。
主要な結果
- レンチウイルス粒子を生成する手順を実証しました。
- GCSCに対するクラストリンの効果に関する洞察を提供しました。
- この方法の様々なCSCタイプへの適応性を示しました。
- 幹性関連遺伝子を研究することの重要性を強調しました。
結論
- このプロトコルは、がん幹細胞におけるクラストリンの役割を研究するのに効果的です。
- 異なるタイプのがん幹細胞に適応できます。
- この研究は、がん治療戦略に新しい洞察をもたらす可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables mechanistic de-risking of stemness-associated genes in patient-derived gastric cancer stem cells, supporting target validation in oncology discovery. By combining conditional knockdown with an adapted sphere formation assay, it provides quantitative, reproducible readouts for assessing gene function in cancer stemness pathways. The approach enhances predictive confidence in early-stage target selection and portfolio prioritization for gastric cancer therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking clusterin knockdown to reduced sphere formation, clarifying its role in GCSC self-renewal.
- Operational Value: Enables functional target validation through inducible, reversible gene silencing in a disease-relevant system.
- Predictive Value: Supports preclinical go/no-go decisions by demonstrating that clusterin inhibition impairs tumorigenic potential in vitro.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, quantifiable sphere formation metrics suitable for high-content screening adaptation.
- Reproducibility: Uses lentiviral delivery and puromycin selection to ensure consistent knockdown efficiency across experiments.
- Scalability: Compatible with 96-well ultra-low attachment plates, enabling parallel testing of multiple genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Uses patient-derived gastric cancer stem cells, maintaining phenotypic fidelity to human tumor biology.
- Translational Continuity: Bridges in vitro stemness assessment with potential in vivo validation of clusterin as a therapeutic target.
- Risk-Adjusted Advancement: Provides mechanistic evidence to prioritize clusterin in preclinical pipelines targeting cancer stem cell-driven relapse and resistance.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling target validation after initial hit identification and before lead optimization in oncology programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking gene knockdown to functional stemness outcomes via sphere formation.
- Screening: Generates quantitative, imaging-based readouts that can be automated for compound or genetic suppressor screens.
- Analytics: Enables densitometric analysis of Western blots and sphere quantification for objective comparison of genetic conditions.
- Translational Research: Connects in vitro stemness phenotypes to potential in vivo models through conserved assay adaptability.
- Enterprise Reuse: The conditional knockdown-sphere formation platform is reusable across stemness-associated genes and cancer types beyond gastric cancer.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in stemness gene function through inducible, reversible knockdown in primary-derived cells.
- Operational Value: Standardizes stemness assessment via sphere formation, improving inter-lab reproducibility and assay transferability.
- Strategic Value: Increases confidence in target selection by providing causal evidence linking gene suppression to loss of tumorigenic potential.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets like clusterin based on functional validation in patient-relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lentiviral production, cell culture, and molecular biology techniques including transfection and selection.
- Depends on access to ultra-low attachment plates, automated cell counters, and Western blotting infrastructure for validation.
- Necessitates standardization of doxycycline induction and puromycin selection timing across laboratories for consistent knockdown.
- Requires optimization of polybrene concentration and lentiviral titer for efficient transduction of primary gastric cancer stem cells.
- Limited by the dependency on sphere formation as a stemness readout, which may not capture all stemness phenotypes in heterogeneous cultures.
