Name: ゲノムスケールCRISPR/Cas9遺伝子スクリーンを用いた細胞表面受容体同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 学ぶゲノムスケールCRISPR/Cas9スクリーニングによる細胞表面受容体同定法。フローサイトメトリーと次世代シーケンスを用いて、リガンド相互作用を網羅的に探索し、創薬研究に応用可能な無作為アプローチを確立する。

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著者らは開示するものは何もない。

細胞認識に関与する細胞成分をコードする遺伝子を同定するCRISPRベースのスクリーニング戦略について説明する。CRISPR活性化を用いる同様のアプローチは、大きなタンパク質ライブラリー26を生成する必要なしに組換えタンパク質の直接相互作用受容体を同定する遺伝的代替手段も提供する。しかし、このアプローチの1つの大きな利点は、細胞にネイティブに表示される表面分子によって媒介される相互作用に適用可能であり、受容体の過剰発現に依存しないことであり、受容体の結合的な有数に影響を及ぼす可能性がある。したがって、他の方法とは異なり、この技術は、受容体の生化学的性質または細胞生物学に関する仮定を行うものではなく、非常に大きなタンパク質、または膜を複数回横断したり、他のタンパク質と複合体を形成したりするタンパク質、およびグリカン、糖脂質、およびリン脂質などのタンパク質以外の分子を使用して通常研究が困難なタンパク質によって媒介される相互作用を研究する機会を提供する。この手法のゲノムスケールの性質を考えると、このアプローチは、受容体を同定するだけでなく、結合事象に必要な追加の細胞成分を同定する利点もあり、それによって受容体の細胞生物学に関する洞察を提供する。
この方法を使用して孤立タンパク質の受容体を同定する際の主な制限の1つは、タンパク質に結合する細胞株を最初に同定するための最初の要件である。これは必ずしも容易ではなく、遺伝的スクリーンにも許容される結合表現型を表示する細胞株を同定することは、このアッセイを展開するための時間制限ステップとなり得る。一部の細胞株は、他のものよりも多くのタンパク質に結合する傾向があります。これは、HSに結合するタンパク質に特に関連します, これらのタンパク質は、HS側鎖を表示する任意の細胞株に結合する傾向があるため, ネイティブ結合コンテキストに関係なく.さらに、細胞株中のシンデカン(すなわち、HSを含有するプロテオグリカン)のアップレギュレーションがHS結合タンパク質26の結合の増加につながることを観察した。これは、スクリーニング用の細胞ラインを選択する際に考慮すべき要因である可能性があります。しかしながら、HSの添加結合が特異的受容体への結合を妨げないことも重要である。これは、結合が観察された場合、このアッセイにおいてHSによって媒介される結合が共依存性19ではなく添加剤であるため、HSのみによって媒介される可能性があることを意味する。このようなシナリオでは、記載されたヘパリン遮断アプローチは、完全な遺伝的画面を実行する必要なしにそのような行動を識別することができる。
細胞株を選択する有用なリソースは、ゲノム、トランスクリプトミクス、および約1,000の癌細胞株27の培養条件情報を含む細胞モデルパスポートである。生物学的文脈に応じて、細胞は発現プロファイルに基づいて選択することができる。細胞株の選択を支援するために、我々は、約1,500個のプリアナンツされたヒト細胞表面糖タンパク質28の発現に従って、細胞モデルパスポート内に~1,000個の細胞株を集集した(補足図2;成長条件と共に各細胞株のクラスター情報が補足表2に提供される)。未知の機能を有するタンパク質の結合をテストする場合、各クラスターから代表的な細胞株のパネルを選択して、幅広い受容体をカバーする可能性を高めると便利です。選択を与えられて、培養が容易で、トランスデュースが容易な細胞株を選ぶのが推奨される。これらの細胞株はゲノムスケールスクリーニングに用いるので、後のステップでCRISPRベースの遺伝子スクリーニングのためのsgRNAの送達に最も一般的に利用可能な方法であるため、大量に容易に増殖することができ、レンチウイルス伝達に寛容であることが好ましい。
一般的に、表現型の選択は単一のソートで行われます。しかし、これは、コントロールと比較して染色された細胞集団の明るさによって決定される。反復的な選択のラウンドは、目的の表現型の信号対雑音比が低い場合、または画面の目的が強い表現型を有する変異体を同定することである場合に採用される可能性がある。FACS ベースの画面に反復選択アプローチを使用する場合、選別プロセスは、主にソーターの完全な力のために、細胞死を引き起こす可能性があることを考慮することが重要です。したがって、収集されたすべてのセルが次の並べ替えのラウンドで表されるわけではありません。
ライブラリの複雑さは、特にネガティブな選択画面の場合、結果を開始ライブラリに存在していたものと比較することによってのみ決定できるため、遺伝的画面を成功させる上で非常に重要な要素です。否定的な選択画面では、500-1,000 x の複雑さのライブラリを維持するのが一般的です。しかし、正の選択画面は、特定の表現型に対して少数の変異体しか選択されないため、ライブラリサイズに対してより堅牢である。したがって、ここで説明する正の選択画面では、画面の品質を損なうことなくライブラリサイズを50〜100倍の複雑さに縮小することができる。さらに、これらの画面では、特定のセルラインの特定の日にコントロールライブラリを、その特定のセルラインに対してその日にソートされたすべてのサンプルの「一般的なコントロール」として使用することもできます。これにより、作成およびシーケンス処理が必要なコントロール ライブラリの数が減ります。
このアプローチを使用するためのもう一つの重要な考慮事項は、インビトロ細胞増殖に不可欠な遺伝子を同定する際の機能喪失スクリーンの限界です。この点では、変異細胞が培養中に保持される時間が長いほど、必須遺伝子に変異を有する細胞が生存不能になり、変異ライブラリーにもはや表現されない可能性が高くなる。300以上の細胞株におけるプロジェクトスコアイニシアチブの一部として行われた最近の遺伝的スクリーンは、KEGGアクローゼンタンパク質分泌およびN-グリコシル化経路における複数の遺伝子が、多くの場合、多くの細胞株に不可欠であると同定されることを示している(補足図3)29。細胞認識プロセスの文脈で増殖と生存に必要な遺伝子の効果を調査する場合、スクリーンを設計する際に考慮することができます。この場合、早期の時点(例えば、9日目のポストトランスダクション)で画面を実施することは、一般的に適切であろう。しかし、このアプローチを使用して、一般的な細胞経路ではなく、強いサイズ効果を持ついくつかのターゲットを同定する場合、後の時点(例えば、15-16日のポストトランスダクション)で画面を実行することが適切である可能性があります。
スクリーニングからの結果は非常に強い;過去に行われた8つの組換えタンパク質結合スクリーンにおいて、細胞表面受容体は、すべての場合19においてトップヒットした。このアプローチを使用して相互作用パートナーを同定する場合、受容体と表面上の提示に寄与する因子が高い統計的信頼度で識別されることを期待すべきである。画面が実行され、単一のgRNAノックアウトを使用してヒットが検証されると、AVEXIS4などの既存の生化学的方法と表面プラズモン共鳴を使用した精製タンパク質の直接焼成可能な結合を使用して、さらなるフォローアップを行うことができます。ここで説明するアプローチは、可溶型組換え結合プローブを生成することができるすべてのタンパク質に適用可能である。
要約すると、これは細胞表面タンパク質によって媒介される相互作用を同定するためのゲノムスケールCRISPRノックアウトアプローチである。この方法は、一般に、生物自身の細胞間(例えば、神経および免疫学的認識)、ならびに宿主細胞と病原体タンパク質の間を含む、幅広い異なる生物学的文脈における細胞表面認識に必要な細胞経路を同定するために適用可能である。この方法は、受容体同定のために設計された生化学的アプローチに代わる遺伝的代替手段を提供し、受容体の生化学的性質または細胞生物学に関する事前の仮定を必要としないため、完全に予期せぬ発見を行う大きな可能性を秘めている。

細胞表面受容体タンパク質による細胞外相互作用は、組織組織、宿主-病原体認識、免疫調節などの重要な生物学的プロセスを直接的に行う。膜受容体はモノクローナル抗体などの体系的に送達された治療薬の有効な標的であるため、これらの相互作用を調査することは、より広範な生物医学界に興味深いものである。その重要性にもかかわらず、これらの相互作用を研究することは技術的に困難なままです。これは主に、膜組み込み受容体が両生性であり、生化学的操作のために生物学的膜から分離することが困難であり、それらの相互作用は弱い相互作用親和性(μM-mM範囲のKKDs)1に代表される。1その結果、多くの一般的に使用される方法は、タンパク質相互作用のこのクラスを検出するのに適していません1,,2.
細胞外受容体リガンド相互作用を考慮に入れた細胞外受容体リガンド相互作用を考慮して、さまざまな方法が開発されている。これらのアプローチの多くは、哺乳類または昆虫細胞系で可溶性組換えタンパク質として受容体の全ての異性ドメインを発現することを含み、これらのタンパク質がグリカンおよびジスルフィド結合などの構造的に重要な翻訳後修飾を確実に含んでいる。低親和性結合を克服するために、エクトドメインは、しばしばそれらの結合性を増加させるためにオリゴマー化される。アビッドタンパク質のエクトドメインは、直接組換えタンパク質-タンパク質相互作用スクリーン4、5、6、75,6における4相互作用パートナーを同定するための結合プローブとして正常に使用されている。,7広く成功しているが、組換えタンパク質ベースの方法は、膜受容体のエクトドメインが可溶性タンパク質として産生されることを必要とする。したがって、連続した細胞外領域(例えば、シングルパスタイプI、II型、またはGPIアンカー)を含むタンパク質に対してのみ一般的に適用可能であり、膜に複数回及ぶ受容体複合体および膜タンパク質には一般的には適していません。
相補的なDNA(cDNA)のライブラリーを細胞にトランスフェクトし、結合性表現型の利益について試験した発現クローニング技術も、細胞外タンパク質とタンパク質相互作用を同定するために使用されている。近年、クローン化および配列配列されたcDNA発現プラスミドの大規模なコレクションの入手可能性は、細胞表面受容体をコードするcDNAを過剰発現する細胞株をスクリーニングし9、相互作用を同定するために組み換えタンパク質の結合をスクリーニングする方法を促進している。cDNA過剰発現ベースのアプローチは、組換えタンパク質ベースの方法とは異なり、原形質膜の文脈における相互作用を同定する可能性を与える。しかし、cDNA発現構築物を使用する成功は、正しく折り畳まれた形でタンパク質を過剰発現させる細胞の能力に依存しますが、これはしばしばトランスポーター、シャペロン、および正しいオリゴマーアセンブリなどの細胞アクセサリー因子を必要とします。したがって、単一のcDNAをトランスフェクトするだけでは、細胞表面の発現を達成できない場合があります。
cDNA構築物または組換えタンパク質プローブを使用したスクリーニング技術は、リソースを大量に消費し、大量のcDNAまたは組換えタンパク質ライブラリーを必要とします。最近では、大規模なライブラリの組み立てを必要としない細胞外相互作用を同定するために、質量分析法を用いた具体的な設計法が利用されている。しかしながら、これらの技術は細胞表面の化学的操作を必要とし、細胞表面に存在する分子の生化学的性質を変化させることができ、現在はグリコシル化タンパク質11,12,12によって媒介される相互作用にのみ適用可能である。現在入手可能な方法の大半は、グリカン、脂質、コレステロールなどの分子を含む膜微小環境からの寄与をほとんど無視しながら、タンパク質間の相互作用に重点を置いています。
CRISPRベースのアプローチを用いた高効率のバイアレリックターゲティングの最近の開発により、定義された遺伝子を欠く細胞のゲノムスケールライブラリは、異なる文脈に関与する細胞成分を同定するための体系的かつ公平な方法でスクリーニングすることができる単一のプールで、 細胞シグナル伝達プロセスの解剖、薬物、毒素、病原体に対する耐性を付与する摂動の同定、および抗体13、14、15、16,15,の特異性の決定を含む。13,16ここでは、細胞外受容体とリガンド相互作用を同定するための現在の生化学的アプローチに代わるゲノムスケールCRISPRベースのノックアウト細胞スクリーニングアッセイについて述べている。遺伝子スクリーンによって膜受容体によって媒介される相互作用を同定するこのアプローチは、cDNAまたは組換えタンパク質の大規模なライブラリをコンパイルする必要を回避するため、個々のリガンドに焦点を当てた研究者に特に適しています。
このアッセイは、3つの主要なステップからなる:1)対象の受容体の細胞外領域からなる非常にアヴィッドな組換えタンパク質結合プローブが生成され、蛍光ベースのフローサイトメトリーベースの結合アッセイで使用される。2)結合アッセイは、組換えタンパク質プローブの相互作用パートナーを発現する細胞株を同定するために使用される。3) 目的のタンパク質と相互作用する細胞株のCas9発現バージョンが生成され、ゲノムスケールCRISPR/Cas9ベースのノックアウト画面が行われる(図1)。この遺伝子スクリーンでは、組換えタンパク質と細胞株への結合は、プローブに結合する能力を失ったノックアウトライブラリー内の細胞を、蛍光ベースの活性化細胞分類(FACS)およびシーケンシングによって同定された結合表現型の喪失を引き起こした遺伝子を用いて分類する測定可能な表現型として使用される。原則として、熱心なプローブと細胞表面表示に必要な結合を担う受容体をコードする遺伝子が同定される。
このプロトコルの最初のステップは、膜結合受容体のエクトドメインを表す熱心な組換えタンパク質プローブの産生を含む。これらの受容体は、それらのエクトドメインが組換え可溶性タンパク質1として発現する場合、しばしば細胞外結合機能を保持することが知られている。目的のタンパク質については、可溶性組換えタンパク質は、結合性を高めるためにオリゴマー化することができる場合であれば、任意の形式で適切な真核生物タンパク質発現系で産生することができ、蛍光ベースのフローサイトメトリーベースの結合アッセイ(例えば、FLAGタグ、ビオチンタグ)に使用できるタグが含まれています。HEK293タンパク質発現系を用いた膜受容体の可溶性異物ドメインの製造に関する詳細なプロトコル、ならびにペンタマータンパク質および単量体タンパク質の両方の産生のための異なる多量体化技術およびタンパク質発現構築物については、前に1,17,17を説明した。ここでのプロトコルは、単量体のビオチン化されたタンパク質からフルオロクロム(例えば、フィコエリスリン、またはPE)に結合させることによって蛍光性有数のプローブを生成するステップを説明する。ゲノムスケールスクリーンを行うための一般的なプロトコルは、すでに20,21,21に記載されており、したがって、プロトコルは、主にヒトV1(「ゆす」)ライブラリ18を用いたCRISPR/Cas9ノックアウトスクリーニングシステムを用いてフローサイトメトリーベースの組換えタンパク結合スクリーンを行う詳細に焦点を当てている。

<table><tbody><tr><td>抗マウスアルカリホスファターゼ</td><td>シグマ</td><td>A4656</td><td></td></tr><tr><td>ブラストサイジン</td><td>Chem-Cruz</td><td>SC-204655血液</td><td></td></tr><tr><td>&細胞培養 DNA Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>13362</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>ジエタノールアミン</td><td>Σ</td><td>398179</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Blood and Tissue kit</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-96 Side Magnet</td><td>Invitrogen</td><td>12331D</td><td></td></tr><tr><td>HEK293T パッケージ細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>シグマ</td><td>H4784-1G</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix</td><td>Kapa</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミン LTX with PLUS 試薬</td><td>Invitrogen 15338100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MoFlo XDP セルソーター</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ni2+-NTA アガロースビーズ</td><td>イエナ バイオサイエンス</td><td>AC-501-25</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>OX-68抗体</td><td>AbD セロテック</td><td>MCA1022R</td><td></td></tr><tr><td>p-ニトロフェニルリン酸</td><td>Sigma</td><td>1040-506</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 脱塩カラム</td><td>GE ヘルスケア</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>ポリブレン</td><td>ミリポア</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレンチューブ ベッド容量 5 mL</td><td>Qiagen</td><td>34964</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K、組換え、PCR グレード</td><td>ロシュ</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td>Gibco</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>Q5 ホット スタート ハイフィデリティ 2&times;マスターミックス</td><td>NEB</td><td>M0494L</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>SCFA フィルター</td><td>Nalgene</td><td>190-2545</td><td></td></tr><tr><td>ソニー セルソーター</td><td>ソニー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPRI ビーズ (Agencourt AMPure XP ビーズ)</td><td>ベックマン</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジンコーティングマイクロタイタープレート</td><td>Nalgene</td><td>734-1284</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン-PE</td><td>バイオレジェンド</td><td>405204</td><td></td></tr></tbody></table>

ゲノムスケールcrispr/cas9遺伝子スクリーンを用いた細胞表面受容体同定

Cell Surface Receptor Identification Using Genome-Scale CRISPR/Cas9 Genetic Screens

膜埋め込み細胞表面受容体間の直接的な相互作用によって媒介される細胞間通信は、多細胞生物の正常な発達と機能にとって極めて重要である。しかし、これらの相互作用を検出することは技術的に困難です。本稿では、特異的細胞表面認識事象に必要な細胞経路を明らかにする、体系的なゲノムスケールCRISPR/Cas9ノックアウト遺伝子スクリーニングアプローチについて述べる。このアッセイは、哺乳動物タンパク質発現系で産生される組換えタンパク質を、細胞ベースの遺伝的スクリーンにおける相互作用パートナーを同定するための熱心な結合プローブとして利用する。この方法は、膜組み込み受容体のエクトドメインに対応する組換え結合プローブによって検出される細胞表面相互作用に必要な遺伝子を同定するために使用することができる。重要なことに、このアプローチのゲノムスケールの性質を考えると、直接受容体を同定するだけでなく、細胞表面での受容体の提示に必要な細胞成分を同定する利点もあり、それによって受容体の生物学に関する貴重な洞察を提供する。

本稿では、細胞外受容体とリガンドの相互作用を同定するためのゲノムスケール細胞ベースのスクリーニングアプローチについて述べる。

ゲノムスケールCRISPR/Cas9遺伝子スクリーンを用いた細胞表面受容体同定

Intercellular communication mediated by direct interactions between membrane-embedded cell surface receptors is crucial for the normal development and ...

現在利用可能な生化学的アプローチを用いた細胞表面相互作用の検出は、依然として技術的な課題を抱えています。このプロトコルは、ゲノムスケール細胞スクリーニングアプローチを用いて、細胞表面における受容体リガンド相互作用を同定する遺伝的代替手段を提供する。他のほとんどの既存の方法とは異なり、この方法は受容体の生物学に関する仮定をしません。それは細胞表面の分子の広い範囲によって媒介される相互作用を識別する機会を提供する。細胞表面分子はモノクローナル抗体などの薬物に直接アクセスできます。したがって、これらの分子によって媒介される相互作用の同定は、重要な治療上の意味を持つことができる。この方法は、一般に、細胞シグナル伝達および認識プロセスの探索に関心のある研究者に適用可能であり、神経および免疫学的相互作用および宿主病原体相互作用を含む幅広い生物学的文脈にある。このプロトコルには、高スループットのセルソートマシンと次世代シーケンシングマシンが必要です。プロトコルを開始する前に、これらの機能が使用可能であることを確認してください。96ウェルプレートにビオチン化タンパク質サンプルの8つの連続希釈を行い、各希釈液の最終体積が少なくとも200マイクロリットルであり、タグのみのコントロールが含まれていることを確認します。各ウェルから100マイクロリットルを取り除き、新しい96ウェルプレートに移すことによって、サンプルの複製プレートを作ります。すべての結合エッセイに制御プローブとして使用されるタグのみのタンパク質制御を含む。1つのプレートのウェルに0.1マイクログラム/ミリリットルレンサビジン-PEを100マイクロリットル、もう一方のプレートのウェルに希釈バッファー100マイクロリットルを加えます。プレートを室温で20分間インキュベートします。一方、希釈バッファーでストレプトアビジンコードプレートのウェルを15分間ブロックします。プレートを洗った後、乾燥していることを確認してください。次に、サンプルの総体積を両方のプレートからストレプトアビジンコードプレートの個々のウェルに移し、室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、200マイクロリットルの洗浄バッファーでプレートを3回洗浄します。マウスアンチラットCd4d3 +4 IgGの100マイクロリットルを追加し、さらに1時間プレートをインキュベートします。を繰り返します。抗マウスアルカリホスファターゼコンジュゲートの100マイクロリットルを追加し、室温で1時間プレートを残します。その後、洗浄バッファーでウェルを 3 回、希釈バッファーで 1 回洗います。p-ニトロフェニルリン酸を色素エタノールアミンバッファーで1ミリリットルあたり1ミリグラムで調製し、各ウェルに100マイクロリットルを加えます。15分間のインキュベーションの後、吸光度を測定し、各ウェルを405ナノメートルで持っています。プレート上に信号がない最小希釈を、四面子を作成するための適切な希釈係数として使用します。インキュベートストレプトアビジン-PEと適切なビオチン化タンパク質希釈を室温で30分間用いた。その後、コンジュゲートタンパク質を光保護チューブに4°Cで保存し、さらに使用します。処理された円錐管を200回Gで5分間回転させます。上清を取り除き、後で使用するためにマイナス20°Cでチューブの1つを凍結します。他のチューブのペレットを1%BSAのPBSの10ミリリットルで再懸濁し、96ウェルプレート上の陰性対照として100マイクロリットルの細胞を確保する。次に、コンジュゲートされた組換えタンパク質を円錐チューブおよび96ウェルプレートの細胞懸濁液に加えます。緩やかな回転を伴うベンチトップローターで、4°Cで少なくとも1時間セル染色を行います。その後、細胞をGの200倍に5分間ペレットし、上清を除去する。細胞を2回洗浄した後、5ミリリットルのPBSで再懸濁する。30マイクロメートルのストレーナーを通して細胞をひずんで細胞クラスターを取り除く。次に、フロー臭でそれらを分析します。BFP 陽性細胞と PE 陰細胞のゲートには、陰性コントロール サンプルを使用します。その後、サンプルをソートし、500、000〜100万BFP陽性およびPE陰性細胞を1.5ミリリットル遠心チューブに集めます。痛みケージは、タンパク質への細胞の結合に依存しますが、通常、PE陰性サンプルの1〜5%が収集されます。次に、5分間Gの500倍の遠心分離機で選別した細胞を、慎重に上清を取り除きます。ペレットは、マイナス20°Cで最大6ヶ月間保存することができます。マジックの count 関数を使用して、並べ替えされていない、並べ替えられた母集団のシーケンスを参照ライブラリにマップし、生のカウント ファイルを生成します。コントロールとして未ソートコントロールサンプルからの生のカウントと処理としてソートされたサンプルからのカウントを使用して魔法のテスト関数を実行します。生成された遺伝子サマリーファイルを開き、ポーズランク列を昇順でランク付けします。次に、誤検出率がポイント 0.05 未満のヒットを特定します。受容体は、通常、最初の位置で非常に頻繁にランク付けされます.最後に、R または同等のソフトウェアを使用して、正の選択のための堅牢なランク付けアルゴリズム スコアをプロットします。ヒトTNFSF9およびヒトTNFSF9およびPのファルシパームまたはH5の結合パートナーの同定のためのゲノムスケールノックダウンスクリーンは、NCI-SNU-1およびHEC-293細胞でそれぞれ行った。Rh5の結合挙動は、ヘパラン硫酸の両方の影響を受け、TN-FRSF-9は既知の受容体TN-FSF-9との結合を失わなかったのに対し、BSG受容体は公知であった。可溶性ヘパリンによるインキュベーションの際.制御変異体ライブラリーにおけるGNA分布により、ライブラリーの複雑さは実験の過程を通じて維持されていたことが明らかになった。スクリーンの技術的品質は、必須遺伝子の基準セットの分布と比較して、G-RNAの標的化の観察された折り畳み変化の分布を調べることによって評価された。さらに、経路レベルの濃縮は、期待される必須経路が同定され、中退集団において有意に豊かであることを明らかにした。対照試料を元のプラスミドライブラリーと比較した場合。堅牢なランクアルゴリズムまたはRRAスコアは、G-RNAが予想よりも一貫して高くランク付けされている尺度を提供します。TNFRSF9 の画面で、最もヒットしたのは、既知のバインディング パートナーである TNFSF9 でした。また、TP53経路に関連する多数の遺伝子も同定された。RH5の場合、既知の受容体に加えて、硫酸化されたギャグの産生に必要な遺伝子と、SLC16A1遺伝子も同定された。スクリーニングアプローチは通常非常に堅牢であり、直接相互作用する受容体は、この集団の順序で濃縮された遺伝子のリストに高度にランク付けされるべきである。画面から得られたヒットを検証することが重要です。相互作用がタンパク質によって媒介される場合、例えば、バイナリタンパク質タンパク質相互作用を研究するために設計された生化学的アプローチは、さらなる検証研究に使用することができる。このアプローチの非バイアスのゲノムスケールの性質から、脂質、マルチパス膜タンパク質、グリカンなどの細胞分子の研究が困難な相互作用を探求するのに役立つことを期待しています。また、受容体の密売や生物学に必要な新しい経路を明らかにすることができます。.

cell-surface-receptor-identification-using-genome-scale-crisprcas9

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

ここで説明したジェノタイピング技術、キャピラリーゲル電気泳動に結合する蛍光ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、ヌクレアーゼ媒介ノックアウトクローンのハイスループット遺伝子型決定を可能にします。これは、他の遺伝子型判定技術が直面している制限を回避し、配列決定法よりも費用対効果の高いです。...

ハイスループットフォーマットでの遺伝子型CRISPR / Cas9媒介ノックアウト変異体に蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法を用いました

このプロトコルでは、デザインを多重化融合タンパク質として知られているエンハンサー干渉 (エンハンサー-i) SID4X-dCas9-KRAB...

細胞を用いた多重 CRISPR ベース エンハンサー干渉エンハンサー機能の解剖

ここでは、ターゲット上の活動の損失することがなくより高い特定性を達成するために CRISPR Cas9 を最適化するためにプロトコルを提案する.狙撃スクリーンと呼ばれる進化のアプローチを使用して、所望の特性を持つ変異体 Cas9 を見つけます。スナイパー Cas9 は切り捨てられた単一ガイド Rna...

進化を介してターゲットの活性を失うことがなく CRISPR Cas9 のオフターゲット効果を最小限に抑えるための狙撃兵 Cas9 を使用してください。

CRISPR/sgRNA ライブラリは、蛋白質コーディングの遺伝子を尋問に適用されています。ただし、CTCF 境界の遺伝子発現制御の機能を明らかにするための sgRNA ライブラリの可能性は未踏のままになります。ここでは、 HOX遺伝子座の CTCF 境界の働きを解明するHOX遺伝子特定 sgRNA...

HOX軌跡 Focused CRISPR/sgRNA ライブラリ スクリーニングを識別する重要な CTCF の境界

CRISPR-Cas9技術は、あらゆる細胞型の哺乳類ゲノムを正確に編集する効率的な方法を提供し、ゲノム全体の遺伝スクリーンを実行する新しい手段を表します。プールされたゲノム全体のCRISPR-Cas9スクリーンのパフォーマンスを成功させるには必要な手順を説明する詳細なプロトコルをここで提供します。...

哺乳類細胞におけるCRISPRベースの遺伝子スクリーンのプール

AviTag特異的位置制限照明強化ビオチニル化(ALIBi)は、リボソームの細胞内集団を標識し親和性を精製し、下流のシーケンスおよびプロテオーム解析のために開発された新しいオプトジェネティック活性化法です。...

組換えペプチドタグ特異的位置制限照射強化ビオチニル化に基づく細胞内リボソームサブポピュレーションの単離

CRISPRのような技術に対する大きな障壁は、重要な遺伝子を破壊する可能性のあるオフターゲットイベントです。「Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by...

オフターゲット遺伝子編集の検討のためのCIRCLE-Seq

この記事では、健康なドナーキメラ抗原受容体T細胞におけるゲノムワイドCRISPRノックアウトスクリーニングを完了するための消耗に対する in vitro モデルの適用に関するプロトコルについて説明しています。...

キメラ抗原受容体T細胞におけるIn vitroゲノムワイドCRISPRノックアウトスクリーニングの実施

ここでは、CRISPR/Cas9技術とCell Counting...

CRISPR/Cas9技術とセルカウンティングの併用による造血幹細胞および前駆細胞の異常増殖関連遺伝子の評価

ゲノムワイドなCRISPR/Cas9スクリーニング法の適用により、放射線耐性および感受性遺伝子を選択するために、細心の注意を払った構造化されたアプローチが与えられています。このプロトコルは、臨床投与された化学薬品に対する耐性のメカニズムを調査する他の研究努力のための汎用性の高いフレームワークとしても役立つ可能性を秘めています。...

放射線感受性および放射線耐性遺伝子を明らかにするためのゲノムワイドCRISPRスクリーニング

CAR T細胞におけるCRISPR-Cas9スクリーニングの改良:ライブラリー調製のための洗練された方法

学ぶゲノムスケールCRISPR/Cas9スクリーニングによる細胞表面受容体同定法。フローサイトメトリーと次世代シーケンスを用いて、リガンド相互作用を網羅的に探索し、創薬研究に応用可能な無作為アプローチを確立する。

ゲノムスケールCRISPR/Cas9遺伝子スクリーンを用いた細胞表面受容体同定

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