歯髄パラクリン信号に反応した神経突起の成長を研究する共培養法

我々は、トランスウェルフィルター上に培養された三叉(TG)ニューロンを用いた歯科パルプ(DP)一次細胞の分離、分散およびめっきについて述べた。DP細胞の細胞応答は、免疫蛍光またはRNA/タンパク質分析で分析することができる。共焦点顕微鏡を用いた神経細胞マーカーの免疫蛍光は、神経突起の成長応答の解析を可能にする。

このプロトコルは、歯髄幹細胞を三叉神経細胞と共存させる方法の詳細な概要を提供する。それを使って、クロストークによって駆動される複数の応答を調査することができます。この技術の主な利点は、一方または両方の細胞集団を研究および操作し、結果を正確に測定する能力である。

この方法は神経研究に直接関連しており、歯科パルプ幹細胞が外傷性イベントや神経変性疾患によって損傷を受けた神経組織をどのように修復するかの研究に関する洞察を提供する可能性があります。このテクニックには学ぶ段階がいくつかあり、それらのすべてを維持するのは難しいかもしれません。このプロトコルは、それを支援するために各段階を詳述します。

歯髄および神経節は分散が困難であり、様々な渦およびピペットを必要とする。それでも、あなたは完全な分散を得ることはありませんので、最適化と複製が必要になります。マウスの安楽死後、口が天井に向かって、首のベースが作業面に平らになるように、使い捨ての下パッドに頭を置きます。

カミソリの刃と鋸の動きを使用して、下顎骨と上顎骨を分離します。大臼歯への容易なアクセスを可能にするためにはさみや鉗子で舌を取り除きます。無菌ガーゼパッドの上に皿の中に開いた頭を置き、解剖顕微鏡の下に標本を置きます。

最初の臼歯を取り囲む歯槽骨組織を取り除く。歯槽の開口部に鉗子を挿入し、口の頬または言語側に向かって歯から離れて組織をいじめます。すべての上顎第一の大臼歯を収集し、氷の上に1X PBSと別の細胞培養皿に顎下および上顎の最初の臼歯を穏やかに移す。

各上顎第一大臼歯の外側を囲むエナメル外側器官を取り除きます。鉗子のセットでカスプが下がって開いているルートが露出するように、大臼歯を回転させます。歯の底に楕円形の開口部があり、歯垢とエナメル質の薄い層によってカプセル化された不透明な歯髄組織があります。

鉗子の先端を使用して、鉱化された組織の内部円周の周りに鉗子の片腕を動かすことによって歯科パルプを穏やかに緩める。ミネラル化構造から歯髄組織を取り出し、1X PBSを含む第3の皿に移します。エナメル質の外器官がまだ分離されていない場合は、外器官を取り除きます。

50ミリリットルの円錐管で0.25%トリプシンEDTAにすべての歯髄組織を移す。混合物をボルテックスし、10分間摂氏37度の温水浴に入れます。無菌フードの下で、酵素を不活性化するためにトリプシンに少なくとも1対1の培地の最終比率に温めた共培養培地を加える。

10ミリリットルのピペットでメディアを何度も上下にピペストして、さらにメディアに歯科パルプを分散させ、大きな泡を避ける。分散した歯科パルプの1ミリリットルを24ウェル組織培養プレートの各ウェルに移す。プレートを37°Cのインキュベーターに入れなさい。

そして、細胞がメディアを交換する前に48時間、未分散組織から取り付けて移動することを可能にする。安楽死と皮膚の除去後、頭蓋骨の基部にマイクロ解剖ハサミの先端を挿入します。頭蓋骨の矢状縫合に沿ってカットします。

頭蓋骨の基部のラムドイド縫合糸に沿って耳でコロナ縫合糸に沿って4つの小さな水平カットを行います。これにより、2 つのフラップのボーンが作成されます。鉗子を使用して骨の2つのフラップを剥がして脳を明らかにする。

上顎プロセスの脳と骨の間の硬膜に収容された三叉神経節を見つける。目、上顎、下顎下に移動する3つの枝をカットします。そして、氷の上の皿で冷たい1X PBSに神経節を転送するためにストレートエッジファイン鉗子を使用してください。

すべての三叉束が収穫されると、ファイル鉗子を使用して、無菌濾過されたコラゲターゼの1ミリリットル当たり5ミリグラムを含む50ミリリットルの円錐状チューブに神経節を移し、混合物を37°Cの水浴に入れます。5~10分ごとに、水浴からチューブを取り出し、渦を出して、お風呂に戻ります。643xgで2分間コラゲターゼ三叉ニューロン溶液を遠心分離する。

組織培養フードの下で、クロピペットでコラゲレーターーゼを軽く吸引し、1%無菌濾過トリプシンIIの5ミリリットルを加え、チューブを37°Cの水浴に25〜30分間置き、この時間枠内でチューブを5分ごとに短時間渦液します。メディアに対するトリプシンの1対1の比率でメディアを追加し、残りのトリプシンを無効にします。細胞数を数え、培地中の1ミリリットル当たり200,000細胞に希釈する。

コーティングされたトランスウェルフィルターを歯科パルプ付きの井戸に入れる。トランスウェルフィルターに250マイクロリットルをピペットし、一晩摂氏37度で細胞を培養する。翌日、培地を1ミクロモルウリジンと15マイクロモル5-Fluoro-2'deoxyuridineを補った共培養培地の1ミリリットルに置き換え、中中性突起増殖を防ぐ可能性のある間葉細胞の過剰増殖を止める。

2日目に有糸分裂抑制剤を追加しないと、神経突起の増殖は起こらない。本研究では、三叉神経突起単培養の制御と比較して、基礎下層の一次歯髄細胞の存在下で三叉状の神経突起伸長が増加した。TGF-β受容体2フロックス/フロックスマウスから単離された初等細胞は、ade-Cre-GFPまたはade-eGFPのいずれかの注射後に数で同等であった。

半定量的PCRは、アデノウイルス-Cre-GFPが、コントロールウイルスベクターとして機能するアデノウイルスeGFPを用いた成長因子β受容体2を変換する横置遺伝子を削除したことを示す。成長因子β受容体2欠失を変化させる培養において、神経突起伸長は減少した。細胞集団の結晶紫色染色後のトランスウェルフィルターの明視野イメージングは、大きな細孔が流行していることを示している。

大きな矢印は間葉系形態を持つ細胞を指し示し、小さな矢印は神経形態の細胞を指している。結晶バイオレットは、バイアスなしで両方の細胞を染色しました。また、アレクサ488二次抗体を用いたβ-IIIチューブリンの免疫蛍光染色は、異性体のイメージングを困難にする複数の細胞の非特異的染色を示す。

歯髄細胞も三叉神経細胞も容易に分散しないので、各研究者はめっき手順を最適化する必要があります。歯科用パルプ細胞を別々のウェルで培養するだけで、免疫蛍光を使用するか、RNAまたはタンパク質レベルを定量化して、歯髄細胞がニューロンにどのように反応しているかを判断することができます。アデノウイルスに接触する容器や先端を漂白することを忘れないでください。

鋭利なビンにカミソリを適切に捨ててください。