Name: 歯髄パラクリン信号に反応した神経突起の成長を研究する共培養法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 学ぶ 歯髄細胞と三叉神経節ニューロンの共培養法。トランスウェルシステムを用いて、歯髄間葉細胞と神経線維の細胞・分子相互作用を調査し、歯の神経支配と発達メカニズムを解明するための実験プラットフォームを提供します。

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この研究は、a)国立衛生研究所/NIAMS(助成金番号R01 AR062507とR01 AR053860からRSへ)、b)アラバマ大学バーミンガム歯科学術研究トレーニング(DART)助成金(番号T90DE022736(PI MacDougall))によって、国立歯科・頭蓋顔面研究研究所/クリオフェイシャル研究研究所/SBPに支援されました。 c) UABグローバル・センター・フォー・クラニオ顔面・口腔・歯科障害センター(GC-CODED)パイロットおよびD)国立歯科頭蓋顔面研究所SBPに対する研究/国立衛生研究所K99 DE024406助成金。

<ol><li>Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+3A+controls+timing+and+patterning+of+the+dental+pulp+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation.</a> Differentiation. 84 (5), 371-379 (2012).</li>
<li>Kollar, E. J., Lumsden, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tooth+morphogenesis%3A+the+role+of+the+innervation+during+induction+and+pattern+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+de+biologie+buccale%22%5BJournal%5D)">Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation.</a> Journal de biologie buccale. 7 (1), 49-60 (1979).</li>
<li>Lillesaar, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurites+from+trigeminal+ganglion+explants+grown+in+vitro+are+repelled+or+attracted+by+tooth-related+tissues+depending+on+developmental+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage.</a> Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).</li>
<li>Fried, K., Lillesaar, C., Sime, W., Kaukua, N., Patarroyo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+finding+of+pain+nerve+fibers%3A+Neural+growth+mechanisms+in+the+tooth+pulp%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Target finding of pain nerve fibers: Neural growth mechanisms in the tooth pulp.</a> Physiology & Behavior. 92 (1-2), 40-45 (2007).</li>
<li>Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+innervation+in+developing+and+regenerating+orofacial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (12), 2241-2251 (2014).</li>
<li>Luukko, K., Kettunen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+tooth+morphogenesis+and+innervation+by+local+tissue+interactions%2C+signaling+networks%2C+and+semaphorin+3A%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adhesion+%26+Migration%22%5BJournal%5D)">Integration of tooth morphogenesis and innervation by local tissue interactions, signaling networks, and semaphorin 3A.</a> Cell Adhesion & Migration. , 1-9 (2016).</li>
<li>Smit, M., Leng, J., Klemke, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+for+neurite+outgrowth+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Assay for neurite outgrowth quantification.</a> BioTechniques. 35 (2), 254-256 (2003).</li>
<li>de Almeida, J. F. A., Chen, P., Henry, M. A., Diogenes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+of+the+apical+papilla+regulate+trigeminal+neurite+outgrowth+and+targeting+through+a+BDNF-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Stem cells of the apical papilla regulate trigeminal neurite outgrowth and targeting through a BDNF-dependent mechanism.</a> Tissue engineering. Part A. 20 (23-24), 3089-3100 (2014).</li>
<li>Pagella, P., Miran, S., Mitsiadis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Developing+Tooth+Germ+Innervation+Using+Microfluidic+Co-culture+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices.</a> Journal of Visualized Experiments. (102), e53114(2015).</li>
<li>Coelen, R. J., Jose, D. G., May, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+hexadimethrine+bromide+%28polybrene%29+on+the+infection+of+the+primate+retroviruses+SSV+1%2FSSAV+1+and+BaEV%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The effect of hexadimethrine bromide (polybrene) on the infection of the primate retroviruses SSV 1/SSAV 1 and BaEV.</a> Archives of Virology. 75 (4), 307-311 (1983).</li>
<li>Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+growth-associated+proteins+in+the+neurons+of+adult+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+methods%22%5BJournal%5D)">Overexpression of growth-associated proteins in the neurons of adult transgenic mice.</a> Journal of neuroscience methods. 71 (1), 3-9 (1997).</li>
<li>Alić, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+from+mouse+strain+Thy1+YFP-16+are+a+valuable+tool+to+monitor+and+evaluate+neuronal+differentiation+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells from mouse strain Thy1 YFP-16 are a valuable tool to monitor and evaluate neuronal differentiation and morphology.</a> Neuroscience Letters. 634, 32-41 (2016).</li>
<li>Howroyd, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+Trigeminal+Ganglion+of+Nonrodent+Species+Used+in+Toxicology+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Dissection of the Trigeminal Ganglion of Nonrodent Species Used in Toxicology Studies.</a> Toxicologic Pathology. , (2019).</li>
<li>Schwieger, J., Esser, K. H., Lenarz, T., Scheper, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+long-term+spiral+ganglion+neuron+culture+with+reduced+glial+cell+number%3A+Effects+of+AraC+on+cell+composition+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Establishment of a long-term spiral ganglion neuron culture with reduced glial cell number: Effects of AraC on cell composition and neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 268, 106-116 (2016).</li>
<li>Liu, R., Lin, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Efficient+Method+for+Dorsal+Root+Ganglia+Neurons+Purification+with+a+One-Time+Anti-Mitotic+Reagent+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">An Efficient Method for Dorsal Root Ganglia Neurons Purification with a One-Time Anti-Mitotic Reagent Treatment.</a> PLoS ONE. 8 (4), 60558(2013).</li>
<li>Burry, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimitotic+drugs+that+enhance+neuronal+survival+in+olfactory+bulb+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Antimitotic drugs that enhance neuronal survival in olfactory bulb cell cultures.</a> Brain Research. 261 (2), 261-275 (1983).</li>
<li>Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+Purification%2C+and+Culture+of+Primary+Murine+Sensory+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons.</a> Methods in molecular biology. 1656, Clifton, N.J. 229-251 (2017).</li>
<li>Dussor, G. O., Price, T. J., Flores, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activating+transcription+factor+3+mRNA+is+upregulated+in+primary+cultures+of+trigeminal+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Activating transcription factor 3 mRNA is upregulated in primary cultures of trigeminal ganglion neurons.</a> Molecular Brain Research. 118 (1-2), 156-159 (2003).</li>
<li>Lillesaar, C., Arenas, E., Hildebrand, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+rat+trigeminal+neurones+to+dental+pulp+cells+or+fibroblasts+overexpressing+neurotrophic+factors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Responses of rat trigeminal neurones to dental pulp cells or fibroblasts overexpressing neurotrophic factors in vitro.</a> Neuroscience. 119 (2), 443-451 (2003).</li>
<li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+tooth+pulp+cells+elicit+neurite+growth+from+trigeminal+neurones+and+express+mRNAs+for+neurotrophic+factors+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro.</a> Neuroscience Letters. 308 (3), (2001).</li>
<li>Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tooth+pulp+tissue+promotes+neurite+outgrowth+from+rat+trigeminal+ganglia+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurocytology%22%5BJournal%5D)">Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro.</a> Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).</li>
<li>Chmilewsky, F., Ayaz, W., Appiah, J., About, I., Chung, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+Growth+Factor+Secretion+From+Pulp+Fibroblasts+is+Modulated+by+Complement+C5a+Receptor+and+Implied+in+Neurite+Outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Nerve Growth Factor Secretion From Pulp Fibroblasts is Modulated by Complement C5a Receptor and Implied in Neurite Outgrowth.</a> Scientific reports. 6, 31799(2016).</li>
<li>Pagella, P., Neto, E., JimÃ©nez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+co-culture+systems+for+studying+tooth+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation.</a> Frontiers in Physiology. 5, 326(2014).</li>
<li>Miura, T., Yokokawa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+culture+on+a+chip%3A+Developmental+biology+applications+of+self-organized+capillary+networks+in+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+Growth+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Tissue culture on a chip: Developmental biology applications of self-organized capillary networks in microfluidic devices.</a> Development, Growth & Differentiation. 58 (6), 505-515 (2016).</li>
</ol>

著者たちは開示するものは何もない。

口腔の日々の活動は、歯が適切な使用と維持を可能にするために外的刺激と内部炎症を感知することを必要とする。しかし、歯の内膜の発達過程を促進する信号に関する情報は限られています。このプロトコルは、2つの集団間の相互通信を研究するために、プライマリDP細胞およびTGニューロンを分離および共培養する方法を提供する。いくつかの変数が最適化され、以下に説明されるように、研究のさらなる道を開いたままにします。
このアッセイの各ステップにおいて、コントロールが重要です。基礎となるDP細胞を含まないTGニューロンを用いてトランスウェルフィルターを全てのアッセイに含めて、TG増殖のベースラインを提供する必要があります。Ad-Cre-GFPリコンビナーゼで対象の横たわった遺伝子を削除する場合、蛍光マーカーのみを発現するコントロールウイルスを使用して、同等の数の細胞が感染していることを確認する必要があります。Ad-eGFPとAd-Cre-GFPの100および200 MOIで、それぞれ最小の細胞死で高レベルの感染を実証しましたが、各ラボはこのステップを最適化する必要があります。蛍光タンパク質は異なるプロモー...

歯のインナーブは、歯の内部が圧力、温度および炎症を感知することを可能にし、そのすべてが歯器官の使用および維持にとって重要である。虫歯や外傷に伴う歯の痛みを感知しないと、病気の進行につながります。したがって、適切な内線は、正常な歯の成長、機能およびケアのための要件である。
ほとんどの臓器は出生時までに完全に機能し、内臓化されていますが、歯の発達は成人生活にまで及び、出生後段階1、2の間に協調して歯の内膜とミネラル化が起こる。興味深いことに、歯髄(DP)間感覚は、最初は胚発生時に反発シグナルを分泌し、発達中の歯器官への軸索の侵入を防ぎ、後に歯が噴火に近づくにつれて誘引因子の分泌に移行する3,4。出生後の段階では、象牙質沈着が始まる頃に歯牙(TG)神経から逸脱した軸索が歯に浸透する(Pagella,P.いくつかの生体内研究では、神経間葉相互作用がマウスの歯の内膜化を導く(Luukko,K.al.
細胞共培養は、研究者が神経集団と間葉集団間の相互作用を操作できる制御された環境を提供する。共培養実験により、歯のインナーブと発達を導くシグナル伝達経路をより深く掘り下げることができます。しかし、いくつかの従来の方法は、共培養で細胞を研究するために使用される技術的な課題を提示する。例えば、ニューライトの結晶バイオレット染色は、TGバンドル分散液に含まれるシュワン細胞を非特異的に染色することができ、また、比較的小さな応答で色強度のピークが7に有する可能性がある。マイクロ流体室は魅力的なオプションを提供しますが、トランスウェルフィルタ8、9よりもかなり高価であり、DP分泌物に対する神経応答の調査のみを許可します。これらの問題に対処するために、a)DP分泌物に応答したTG神経突起の正確な染色およびイメージング、b)DP細胞および/またはTGニューロンの遺伝子改変による特定のシグナル経路の調査、およびc)TGニューロンによって分泌された因子に対するDP細胞応答の調査を可能にするプロトコルを開発した。このプロトコルは、in vitro共培養アッセイの制御された環境における歯のインナーブの複数の特徴を正確に調査する能力を提供する。

<table><tbody><tr><td>5-フルオロ-2'-デオキシウリジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0503</td><td>15 &mu;共培養培地中のM濃度、2</td></tr><tr><td>日目 24ウェル細胞培養プレート</td><td>Corning</td><td>3524</td><td>共培養プレート</td></tr><tr><td>Alexa-546 抗ニワトリ</td><td>Invitrogen</td><td>A-11040</td><td>抗GFP抗体によって標識された神経突起伸長を染色する二次、1:500</td></tr>希釈 <tr><td>抗GFP抗体</td><td>Aves Lab, Inc</td><td>GFP-1010</td><td>Thy1-YFPニューロンを標識する一次抗体、1:200</td></tr>希釈<tr><td>抗ニューロフィラメント200抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NO142</td><td>モノクローナル一次抗体 ニューロンを標識する抗体、1:1000 希釈、YFP マウスが利用できない場合は代替</td></tr><tr><td>B6;129- Tgfbr2tm1Karl/J</td><td>ジャクソン研究所</td><td>12603</td><td>Tgfbr2f/f/f 最適化されたプロトコルB6の歯髄細胞に使用されるマウスモデル</td></tr><tr><td>。Cg-Tg(Thy1-YFP)16Jrs/J</td><td>ジャクソン研究所</td><td>3709</td><td>三叉神経細胞に使用されるThy1-YFPマウスモデル遺伝子型</td></tr><tr><td>コラゲナーゼII</td><td>型ミリポア</td><td>234155-100MG</td><td>三叉神経細胞の分散に使用</td></tr> ウ<tr><td>シ胎児血清</td><td>Gibco</td><td>10437</td><td>共培養培地への添加物</td></tr><tr><td>微細鉗子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11413-11</td><td>TG解剖用微細鉗子</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td>トランズウェルインサートを最終濃度 10 &mu;g/ml、ストック溶液は1.5mg/mlと仮定</td></tr><tr><td>溶解バッファー(バッファーRLT)</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>共培養後の歯髄細胞からRNAを抽出</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>ギブコ</td><td>25030081</td><td>共培養培地への添加物</td></tr><tr><td>マイクロ解剖ハサミ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3146-1EA</td><td>頭蓋骨を開くための解剖ハサミ</td></tr><tr><td>顕微鏡カバー ガラス</td><td>フィッシャーブランド</td><td>12-545-81</td><td>オプションの細胞培養および免疫蛍光処理用の環状カバースリップ</td></tr><tr><td>最小限のエッセンシャル培地</td><td>ギブコ</td><td>12571063</td><td>共培養培地ベース</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>ギブコ</td><td>15070063</td><td>共培養培地への抗生物質添加物</td></tr><tr><td>ホスファターゼ阻害剤</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>04 906 837 001</td><td>歯髄細胞からタンパク質を抽出するためのRIPAバッファーへの添加物 ポスト共培養</td></tr><tr><td>ポリブレン</td><td>ミリポア</td><td>TR-1003-G</td><td>歯髄細胞のトランスフェクションに使用</td></tr><tr><td>ポリ-D-リジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7280</td><td>歯髄細胞接着を助けるカバースリップコーティング</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤</td><td>ミリポア</td><td>05 892 791 001</td> 共<td>培養後の歯髄細胞からタンパク質を抽出するためのRIPAバッファーへの添加</td></tr>物 <tr><td>RNAse/DNAseフリーのエッペンドルフチューブ</td><td>デンビル</td><td>C-2172</td><td>アッセイ終了時のRNA、DNAまたはタンパク質収集用の滅菌済み1.7 mlチューブ</td></tr><tr><td>ThinCert細胞培養インサート</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662631</td><td>共培養アッセイにおける三叉神経ニューロン用トランズウェルインサート</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.25%)</td> <td>Gibco</td><td>25200056</td><td>使用 fto 歯科歯髄細胞を分散</td></tr>させる <tr><td>トリプシンII型</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-7409</td><td>分散に使用三叉神経ニューロン</td></tr><tr><td>超微細鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11370-40</td><td>解剖用超微細鉗子</td></tr><tr><td>Uridine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U3750</td><td>1 &mu;共培養培地中の M 濃度、2 日目</td></tr><tr><td>真空ろ過システム</td><td>ミリポア</td><td>SCNY00060</td><td>Steriflip ディスポーザブルフィルター、50 &mu;mのナイロン網フィルター</td></tr><tr><td>バイアルの鉗子</td><td>Fine Science Tools</td><td>110006-15</td><td>円錐形への組織移動のための長い鉗子</td></tr></tbody></table>

歯髄パラクリン信号に反応した神経突起の成長を研究する共培養法

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

歯のインナーブは、歯の内部が圧力、温度および炎症を感知することを可能にし、そのすべてが歯器官の使用および維持にとって重要である。感覚的な内膜がなければ、毎日の口腔活動は回復不可能な損傷を引き起こすであろう。その重要性にもかかわらず、歯の発達と維持における内膜の役割はほとんど見過ごされてきた。いくつかの研究は、DP細胞がTG軸索を引き付け、歯全体に導くために細胞外マトリックスタンパク質およびパラクリンシグナルを分泌することを実証している。しかし、DP間質と神経の薬効との間のクロストークに関する詳細な洞察を提供した研究はほとんどありません。この知識のギャップに対処するために、研究者は共文化と様々な技術を活用してこれらの相互作用を調査し始めました。ここでは、大口径の細孔を有するトランスウェルフィルターに分散したTGニューロンを用いて一次DP細胞を共培養し、細孔を通して軸索成長を可能にする複数のステップを実証する。loxP部位によって隣接した目的の遺伝子を有する原発性DP細胞は、アデノウイルス-Cre-GFPリコンビナーゼ系を用いて遺伝子欠失を促進するために利用された。Thy1-YFPマウスのTGニューロンを使用すると、共焦点顕微鏡によるバックグラウンドレベルをはるかに上回る発現を有する正確なアフェレントイメージングが可能となった。DP応答は、取り外し可能なガラスカバースリップにメッキされたDP細胞の免疫蛍光染色を介して、タンパク質またはRNAの収集および分析、または代替的に調査することができる。培地はプロテオーム分析などの手法を用いて分析できますが、これはウシ胎児血清の存在によるアルブミンの枯渇を必要とします。このプロトコルは、共培養アッセイの制御された環境に応答して、TGニューロンおよびDP細胞の形態学的、遺伝的、および細胞骨格応答を研究するために操作することができる簡単な方法を提供する。

これらの結果は、TGニューライト単一培養の制御と比較して、基礎となるウェル中の一次DP細胞の存在下でTGニューライトの成長が増加したことを示している(図2A、C)。ニューライトの成長には、いくつかのアッセイ・ツー・アッセイの変動があります。したがって、TGニューロン単一培養は、神経突起の成長の基底レベルを検出するためのコントロールとして、すべてのアッセイに含まれるべきです。Ad-Cre-GFPおよびAd-eGFPの感染後にこのプロトコルで使用したTgfbr2f/fマウス由来の一次細胞は、同等の数の細胞で確認された(図2D)。Ad-eGFPは、コントロールウイルスベクターとして役立った。Ad-Cre-GFPは、半定量PCR(図2E)によって示されるように、横並び遺伝子Tgfbr2を削除した。増殖因子β受容体2(Tgfbr2)欠失を変化させる...

我々は、トランスウェルフィルター上に培養された三叉(TG)ニューロンを用いた歯科パルプ(DP)一次細胞の分離、分散およびめっきについて述べた。DP細胞の細胞応答は、免疫蛍光またはRNA/タンパク質分析で分析することができる。共焦点顕微鏡を用いた神経細胞マーカーの免疫蛍光は、神経突起の成長応答の解析を可能にする。

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

このプロトコルは、歯髄幹細胞を三叉神経細胞と共存させる方法の詳細な概要を提供する。それを使って、クロストークによって駆動される複数の応答を調査することができます。この技術の主な利点は、一方または両方の細胞集団を研究および操作し、結果を正確に測定する能力である。この方法は神経研究に直接関連しており、歯科パルプ幹細胞が外傷性イベントや神経変性疾患によって損傷を受けた神経組織をどのように修復するかの研究に関する洞察を提供する可能性があります。このテクニックには学ぶ段階がいくつかあり、それらのすべてを維持するのは難しいかもしれません。このプロトコルは、それを支援するために各段階を詳述します。歯髄および神経節は分散が困難であり、様々な渦およびピペットを必要とする。それでも、あなたは完全な分散を得ることはありませんので、最適化と複製が必要になります。マウスの安楽死後、口が天井に向かって、首のベースが作業面に平らになるように、使い捨ての下パッドに頭を置きます。カミソリの刃と鋸の動きを使用して、下顎骨と上顎骨を分離します。大臼歯への容易なアクセスを可能にするためにはさみや鉗子で舌を取り除きます。無菌ガーゼパッドの上に皿の中に開いた頭を置き、解剖顕微鏡の下に標本を置きます。最初の臼歯を取り囲む歯槽骨組織を取り除く。歯槽の開口部に鉗子を挿入し、口の頬または言語側に向かって歯から離れて組織をいじめます。すべての上顎第一の大臼歯を収集し、氷の上に1X PBSと別の細胞培養皿に顎下および上顎の最初の臼歯を穏やかに移す。各上顎第一大臼歯の外側を囲むエナメル外側器官を取り除きます。鉗子のセットでカスプが下がって開いているルートが露出するように、大臼歯を回転させます。歯の底に楕円形の開口部があり、歯垢とエナメル質の薄い層によってカプセル化された不透明な歯髄組織があります。鉗子の先端を使用して、鉱化された組織の内部円周の周りに鉗子の片腕を動かすことによって歯科パルプを穏やかに緩める。ミネラル化構造から歯髄組織を取り出し、1X PBSを含む第3の皿に移します。エナメル質の外器官がまだ分離されていない場合は、外器官を取り除きます。50ミリリットルの円錐管で0.25%トリプシンEDTAにすべての歯髄組織を移す。混合物をボルテックスし、10分間摂氏37度の温水浴に入れます。無菌フードの下で、酵素を不活性化するためにトリプシンに少なくとも1対1の培地の最終比率に温めた共培養培地を加える。10ミリリットルのピペットでメディアを何度も上下にピペストして、さらにメディアに歯科パルプを分散させ、大きな泡を避ける。分散した歯科パルプの1ミリリットルを24ウェル組織培養プレートの各ウェルに移す。プレートを37°Cのインキュベーターに入れなさい。そして、細胞がメディアを交換する前に48時間、未分散組織から取り付けて

a-co-culture-method-to-study-neurite-outgrowth-response-to-dental

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

神経突起伸長アッセイのためのコラーゲンゲルのチックStatoacousticガングリオンと脊髄の外植片の解剖と文化

のいずれかを使用して人間の歯髄幹細胞（hDPSCs）の単離および特性を説明する方法...

単離、特徴付けと二つの異なる方法を使用して永久歯に由来するヒト歯髄幹細胞の分化の比較

このビデオでは、トランズウェルフィルターを使用して三叉神経細胞と初代歯髄細胞の共培養を確立する技術を紹介しています。この物理的に分離された状態では、歯髄組織から得られた間葉系細胞がパラクリンシグナル伝達分子を分泌し、孔内を横断してニューロンの分化と間葉系への移動を促進し、共培養システムを確立します。...

歯髄細胞と三叉神経細胞の共培養を確立し、クロスコミュニケーションを実現

このビデオは、歯の胚芽パルプと三叉神経節の間の相互作用を研究するためのマイクロ流体デバイスの使用を示しています。マイクロ流体デバイス内の組織の配置を示し、デバイスのマイクログルーブを介して歯の胚芽に向かっている三叉神経突起の成長を詳細に視覚化します。さらに、歯の胚芽髄への神経突起伸展を促進または阻害する歯由来の分子因子の役割を強調しており、これは出生後の効率的な歯の神経支配を確保するために重要です。...

マイクロ流体共培養システムを用いた歯胚芽と三叉神経節の相互作用の解析

後根神経節（DRG）、末梢神経系の感覚ニューロンを含む構造である。解離した場合、それらは損傷部位でのインビボ環境を模倣し、in vitroでの神経再生及び髄鞘形成を研究するための貴重なモデルを提供し、SC-ような脂肪由来幹細胞（ASC）と共培養することができる。...

根神経節ニューロンと差別化された脂肪由来幹細胞を背：<em&gt;インビトロ</em末梢神経再生を研究するために&gt;共培養モデル

共培養は、神経と標的組織や臓器との間の相互作用を研究するための貴重な方法を表しています。マイクロ流体システムは、神経節と発生中の臓器または組織全体を異なる培養培地で共培養することができるため、ニューロンとその標的との間のクロストークのin...

マイクロ流体共培養装置の使用歯胚神経支配の開発の分析

歯髄由来間葉系幹細胞と共培養の直接的および間接的なメソッドに基づく前立腺癌細胞の相互作用の評価のためのプロトコルを提供します。条件中、トランスも膜間接傍分泌活動を分析に適しています。差動シードは直接細胞相互作用の適切なモデルを一緒に細胞を染色します。...

それらの相互作用を研究する歯髄組織と癌細胞との共培養から間葉系幹細胞の分離

ここでプリオン蛋白発現神経細胞の分化過程を評価するために人間の歯髄幹細胞の分離と伝搬するためのプロトコルを提案する.

分離、伝達、およびプリオン蛋白質発現ひと歯髄幹細胞の神経分化

ここでは、3Dマトリックスで軸を成長させる行動を分析し、その自然な発達を模倣する方法を提供する。...

神経系発達中の軸の成長と挙動を解析する3Dコラーゲンベースのヒドロゲルの生成

この記事では、外植片培養法を使用した歯髄幹細胞の初代培養を確立するための段階的なガイドと、ICSCRTガイドラインに基づくこれらの細胞の特性評価について説明します。このプロトコルによって単離された細胞は、さらなるアプリケーションのための間葉系幹細胞と見なすことができます。...

歯髄幹細胞の初代培養

このプロトコルでは、マウス背根神経節 (DRG)...

背根神経節培養の In Vitro モデルの確立:がん-神経クロストーク研究のための補完的アプローチ

学ぶ 歯髄細胞と三叉神経節ニューロンの共培養法。トランスウェルシステムを用いて、歯髄間葉細胞と神経線維の細胞・分子相互作用を調査し、歯の神経支配と発達メカニズムを解明するための実験プラットフォームを提供します。

歯髄パラクリン信号に反応した神経突起の成長を研究する共培養法

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