乾燥した後のヒト角膜上皮細胞の代謝活性に及ぼす人工涙液製剤の効果

このプロトコルの目的は、人工涙液製剤がヒトの角膜上皮細胞を乾燥から保護できるかどうかをin vitroモデルで評価することです。この方法は、ドライアイの症状を持つ個人の眼の保護に役立つドライアイ製剤を特定するために使用できます。このアッセイは、角膜上皮細胞の代謝活性を検出するための非常に感度の高い尺度を利用しています。

その結果、乾燥による角膜細胞の健康状態の小さな変化を検出することができます。本日、その手順を実演するのは、Parisa Mirzapour氏、Nijani Nagaarudkumaran氏、Adeline Suko氏です。まず、コラーゲンコーティングされたフラスコで、10%のウシ胎児血清と1%のペニシリン/ストレプトマイシンを含む20ミリリットルのDMEM/F12を摂氏37度、二酸化炭素5%で不死化ヒト角膜上皮細胞を増殖させ、2〜3日ごとに培地を交換します。

細胞がほぼコンフルエントになったら、細胞培養培地を取り出し、各フラスコに4〜6ミリリットルの細胞解離培地を加えます。細胞が剥離するまで摂氏37度で細胞をインキュベートし、顕微鏡で定期的にチェックします。各フラスコに2〜6ミリリットルのDMEM/F12と10%FBSを加え、内容物を50ミリリットルの遠心分離管に移します。

細胞を450〜500倍gで5分間遠心分離します。次に、上清を吸引し、事前に温めた培地に細胞を再懸濁します。血球計算盤で細胞濃度を決定し、100, 000個の細胞を含む体積を計算します。

48ウェルのコラーゲンIコーティング培養プレートの各ウェルに培地を、計算された細胞容量とともに追加し、各ウェルの最終容量が0.5ミリリットルであることを確認します。その後、細胞を24時間インキュベートします。制御手順では、ウェルから培地を取り出し、直ちに150マイクロリットルの試験製剤または培地制御溶液で細胞を処理します。

その後、細胞を30分間インキュベートします。細胞から試験液を取り出し、0.5ミリリットルの10%代謝染料溶液を加えます。細胞をさらに4時間インキュベートします。

インキュベーション後、各ウェルから100マイクロリットルの色素溶液を取り出し、96ウェルプレートに移します。プレートリーダーを使用して各ウェルの蛍光を測定し、励起を540ナノメートルに、発光を590ナノメートルに設定します。回収手順を実行するには、前述のように、細胞を試験溶液またはコントロールとインキュベートします。

次に、各ウェルに0.5ミリリットルのDMEM/F12培地を加えます。細胞を18時間インキュベートします。次に、培地を取り出し、代謝活性をテストします。

制御手順を実行するには、48ウェルプレートの細胞から培地を取り出し、直ちに試験製剤または培地制御溶液で処理します。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で30分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞から試験溶液を取り出し、摂氏37度、湿度45%のチャンバーに5分間置いて乾燥させます。

次に、0.5ミリリットルの10%代謝色素溶液を加え、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で4時間インキュベートします。インキュベーション後、各ウェルから100マイクロリットルの代謝色素溶液を96ウェルプレートに移し、蛍光を測定します。回収手順を実行するには、前述のプロトコルを繰り返し、乾燥ステップの後にDMEM/F12培地で18時間のインキュベーションを含めます。

次に、テキスト原稿に記載されているように、データに対して統計分析を実行します。3つのドライアイ製剤が、ヒト角膜上皮細胞の生存率に及ぼす影響について比較されました。溶液1と2は、乾燥前の細胞の代謝活性に有意な影響を及ぼしました。

溶液1に曝露された細胞は、18時間の回復後に細胞代謝活性がさらに低下したため、最初に損傷を受け、損傷は修復されませんでした。それに比べて、溶液3は上皮細胞の代謝活性に軽度の影響しか及ぼさなかった。これらの脂質含有ドライアイ製剤の細胞保護能力を比較したところ、1液目と2液目は細胞を乾燥ストレスから守らないことがわかりました。

ただし、解決策 3 では、ある程度の保護が提供されました。コラーゲンコーティングされたプレートに細胞を播種するときは、細胞懸濁液に均一に混合された細胞が含まれていることを確認し、各ウェルに同じ細胞数で播種してください。3つ目のソリューションは、他の2つの脂質含有製品と比較して、細胞生存率と乾燥ストレスからの保護において統計的に有意な改善を示しました。

リン脂質を含む鉱油、HP-グアー、プロピレングリコールにより、溶液3が角膜細胞に水分保護を提供し、乾燥下での蒸発を減少させる可能性があります。