ゼブラフィッシュ幼虫に対する環境汚染物質の神経行動効果の研究
2020年2月5日
この論文では、ゼブラフィッシュ幼虫モデルを用いた環境汚染物質の神経行動毒性の評価について、暴露プロセスや神経行動指標の検査を含む詳細な実験プロトコルを提示する。
私たちのプロトコルは、ゼブラフィッシュの幼虫に対する物質および関心のある汚染物質の神経行動効果を研究し、これらの薬剤の潜在的な神経毒性を明らかにするための明確なプロセスを提供する。この技術は、ゼブラフィッシュモデルにおける神経行動のハイスループットテストを使用して行うことができる。この方法は、ゼブラフィッシュゲノムがヒトとの相同性が高いため、汚染物質のアアレレ神経行動効果を評価して、化学物質管理や汚染物質による公衆衛生上の問題を示すことができるため、ヒトに対する潜在的な神経毒性を実証するために適用することができます。
ゼブラフィッシュは高スループットスクリーニングの利点を有するため、この方法は向精神薬の開発と環境毒性学研究の両方に関する洞察を提供する。最初の実験を勉強することに脅かされてはいけません。プロトコルに従えば、成功するでしょう。
実験を行う少なくとも2時間前に、室温を摂氏28度に設定し、48ウェルマイクロプレートの各ウェルに800マイクロリットルの露光溶液を追加します。次に、1ミリリットルのピペットを使用して、移動およびパス角度実験に備えて、200マイクロリットルの露光溶液中の1つの幼虫をマイクロプレートの各ウェルに移管する。社会行動実験用に6ウェルマイクロプレートを調製するには、6つのウェルマイクロプレートの各ウェルに4ミリリットルの露光溶液を加え、200マイクロリットルの露光溶液で2匹の幼虫を各ウェルに移す。
テストを開始する前に、高スループットの監視ソフトウェアプログラムを開き、トラッキング回転パスアングルモジュールを選択します。48ウェルマイクロプレートを記録プラットフォームに移し、カバーを引き下げる。[ファイルとプロトコルの生成] をクリックして新しいプロトコルの生成を開始し、[ロケーション カウント] の位置に 48 と入力します。
[パラメーター]、[プロトコル パラメーター]、および [時間] をクリックし、[実験期間] を 1 時間 10 分に設定し、[統合期間] を 60 秒に設定します。楕円形のシェイプツールを使用して、左上ウェルの周りに円を描きます。円を選択し、[コピー]、[右上のマーク]、[貼り付け]、および [選択] をクリックします。
マウスを使用して、コピーした円を右上ウェルにドラッグし、[コピー]、[右上のマーク]、[貼り付け]、および [選択] をもう一度クリックします。次に、コピーした円を右下ウェルにドラッグし、[マークの作成とクリア]をクリックします。システムは、プレートの他のすべてのウェルの上に自動的に円を描画します。
次に、[スケールの描画] をクリックし、画面にキャリブレーションラインを描画します。線の長さを入力し、単位を設定して、[グループに適用]をクリックします。動物の色を黒に設定し、検出閾値を16~18に設定して動物の検出を可能にし、非アクティブに小さい速度を0.5センチメートル/秒、小速から大きな速度を毎秒2.5センチメートルに設定します。
パス角度クラスをマイナス 180 からプラス 180 に設定します(ライト条件を設定するには、[パラメータ]、[ライト駆動]、[下の 3 つのトリガ方法のいずれかを使用する]、および[強化](Enhanced)刺激を使用してライト条件を設定します。[エッジ] をクリックし、暗い期間を 10 分に設定し、その後に 3 サイクルの 10 分の明暗期間を交互に設定します。
次に、プロトコルを保存します。すべてのパラメータが設定されたら、テストルームの照明を下げ、幼虫がシステム内で10分間順応できるようにします。順応期間の終わりに、[実験と実行] をクリックし、実験ファイルを保存するフォルダを作成します。
次に、結果名を入力し、[背景と開始]をクリックします。実験の最後に、[実験と停止] をクリックします。その後、48ウェルマイクロプレートを光インキュベーターに戻し、その後の実験を行います。
すべてのグループは16匹の動物を含むことができるので、システムは単一の48ウェルマイクロプレートの異なる処置条件の下で移動およびパス角度の高い効率テストを行うために使用することができる。幼虫の社会活動は、6ウェルプレートを使用してテストすることができます。この代表的な実験では、BDE-47の最高濃度群は暗黒期に顕著な低活動を示したが、光期間中にBDE-47曝露による変化は認められなかった。
また、6-ヒドロキシ-BDE-47の高濃度群は、受精後5日間でより少ないルーチンおよび平均ターンを行った。しかし、より応答性の高いターンは、6-メトキシBDE47露光群で誘導された。ゼブラフィッシュの社会活動は塩素化パラフィン-70と短鎖塩素化パラフィン-52bによって刺激され、長鎖塩素化パラフィン-52aは幼虫の接触期間を短縮した。
テストのために移された幼虫が正常な水泳能力と奇形がないことを確認することが重要です。色の好み、明暗の好み、すべての暗闇、ゼブラフィッシュの尾の動きなどの他の変数は、環境汚染物質の神経行動毒性に関する追加の質問に答えるために含めることができます。BDE-47暴露溶液は神経毒性であり、内分泌破壊の可能性を有するので、皮膚との直接接触を避けるようにしてください。
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概要
本記事では、ゼブラフィッシュ幼魚モデルを用いて環境汚染物質の神経行動毒性を評価するためのプロトコルを紹介します。潜在的な神経毒性を評価するための曝露プロセスおよび神経行動試験について詳述します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経毒性学
- 環境科学
- 行動解析
背景
- ゼブラフィッシュの幼魚は、神経行動への影響を研究するための有用なモデルである。
- ゼブラフィッシュのゲノムは、ヒトと高い相同性を共有している。
- ハイスループットスクリーニングにより、神経行動の効率的な試験が可能になる。
- 神経毒性を理解することは、公衆衛生および化学物質管理にとって極めて重要である。
研究目的
- 環境汚染物質による神経行動学的影響を評価すること。
- 物質がヒトに及ぼす潜在的な神経毒性を実証すること。
- 向精神薬の開発および環境毒性学に関する知見を提供すること。
使用した手法
- ゼブラフィッシュ幼魚の高スループット試験。
- 神経行動学的指標の評価。
- さまざまな環境汚染物質への曝露。
- 毒性を判定するための行動反応の解析。
主要な結果
- 本プロトコルにより、ゼブラフィッシュにおける神経行動毒性を正常に特定できる。
- ハイスループット手法を用いることで、神経行動への影響に関する信頼性の高いデータが得られる。
- 得られた知見は、化学物質管理戦略に役立てることができる。
- 結果は、汚染物質がヒトの健康に及ぼす潜在的な影響を示唆している。
結論
- ゼブラフィッシュモデルは、神経毒性の研究に有効です。
- プロトコルに従うことで、神経行動試験において良好な結果を得ることができます。
- 本研究は、汚染物質が健康に及ぼす影響の理解に寄与します。
よくある質問
業界における重要性
ゼブラフィッシュ幼魚を用いたハイスループットな神経行動アッセイは、環境汚染物質による神経毒性影響の早期検出を可能にし、毒性学および創薬パイプラインにおける予測の信頼性を向上させます。このモデルシステムは、ヒトとの遺伝的相同性を持つため、メカニズムに基づいたリスク低減とトランスレーショナルな関連性を結びつける役割を果たします。これらのアッセイを研究開発ワークフローに組み込むことで、ポートフォリオの選別が効率化され、神経活性化合物や環境安全性評価におけるリスク調整後の推進決定に有用な知見が得られます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 遺伝学的に操作可能な脊椎動物モデルを用い、神経毒性経路のメカニズム的な解析を可能にします。
- 神経活性および神経毒性化合物の機能的なターゲット検証を可能にします。
- 化合物スクリーニングの初期段階におけるトリアージおよび優先順位付けの予測精度を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 神経毒性のスケーラブルなスクリーニングに向けた、ハイスループットかつ定量的な行動学的読み出しを提供します。
- 化合物ライブラリや汚染物質パネル全体での再現性を確保するため、アッセイ条件を標準化します。
- 後続のメカニズム解析または表現型スクリーニングワークフローに向けた、検証済みの生物学的システムを準備します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 神経行動学的エンドポイントを、ヒトの神経毒性に関連するトランスレーショナルバイオマーカーと整合させます。
- 環境物質および医薬品候補物質について、探索から前臨床安全性評価までの連続性を提供します。
- オフターゲット効果や有害な神経行動学的影響を早期に明らかにすることで、候補物質の推進に伴うリスクを低減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このゼブラフィッシュを用いた神経行動学的アッセイは、初期探索から前臨床安全性評価までの連続的なプロセスに適合しており、リード最適化の前に迅速な仮説検証とメカニズム的なリスク低減を可能にします。
- 探索生物学： 脊椎動物システムにおける神経毒性作用および経路関与の帰無仮説検定を可能にします。
- スクリーニング： 化合物比較のための再現性のある定量的な運動および社会行動指標を提供します。
- 分析： 条件間解析のための統計的に堅牢な従属変数測定値を生成します。
- トランスレーショナルリサーチ： ヒトの健康への影響に関連する、疾患に関連した行動エンドポイントを提供します。
- 企業の再利用： 継続的な神経毒性および薬剤安全性研究のための、拡張可能で再利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 神経毒性評価における予測の信頼性を高め、メカニズム上の曖昧さを軽減します。
- 運用上の価値： 研究開発チーム間での標準化、スループット、および再現性を向上させます。
- 戦略的価値： リスクを早期に特定することで、意思決定（go/no-go判定）および資本配分を改善します。
- ポートフォリオへの影響： リスク調整後の優先順位付けをサポートし、より安全で効果的な候補化合物の推進を後押しします。
実施上の検討事項
- ゼブラフィッシュの取り扱い、行動解析のセットアップ、およびデータ解析に関する専門知識が必要です。
- ハイスループットイメージングおよび行動トラッキングのためのインフラストラクチャが必要です。
- 曝露プロトコルとリードアウトパラメータについて、チーム間での標準化が求められます。
- プロトコルの最適化により、さまざまな神経行動学的エンドポイントや汚染物質クラスに適応可能です。
- データの整合性を確保するため、環境変数および実験変数の厳格な管理に依存します。
