Name: 出生後(P1-3)マウス神経起源ニッチからの神経球の分離と拡大 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 学ぶ神経球アッセイによる出生後マウス神経幹細胞の分離と培養法。SVZとDG由来の細胞を用いて、神経発生と多能性を研究するための3次元培養技術を習得できます。

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<li>Ogawa, Y., Kaizu, K., Yanagi, Y., Takada, S., Sakuraba, H., Oishi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+differentiation+of+Sandhoff+disease+model+mouse-derived+multipotent+stem+cells+toward+a+neural+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Abnormal differentiation of Sandhoff disease model mouse-derived multipotent stem cells toward a neural lineage.</a> PLoS ONE. 12 (6), e0178978(2017).</li>
<li>Khacho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Dynamics+Impacts+Stem+Cell+Identity+and+Fate+Decisions+by+Regulating+a+Nuclear+Transcriptional+Program%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Dynamics Impacts Stem Cell Identity and Fate Decisions by Regulating a Nuclear Transcriptional Program.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 232-247 (2016).</li>
<li>Soares, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tauroursodeoxycholic+Acid+Enhances+Mitochondrial+Biogenesis%2C+Neural+Stem+Cell+Pool%2C+and+Early+Neurogenesis+in+Adult+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Tauroursodeoxycholic Acid Enhances Mitochondrial Biogenesis, Neural Stem Cell Pool, and Early Neurogenesis in Adult Rats.</a> Molecular Neurobiology. 55 (5), 3725-3738 (2017).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

Nccsのインビトロシステムは、細胞および分子機構のより良い理解を可能にし、生体内でさらに検証することができる。NSAは、その三次元構造による生理学的状態を模倣する非常に強力な方法です。また、この培養系は、単層培養系などの他のインビトロ系と比較して、技術的に培養10に対しても容易である。実際、NSAを用いると、細胞の発達中に露出した外因性の手がかりを制御することは容易であり、拡張または分化段階の間に、メディアに関心のある因子の正確かつ可変量を加えるだけでなく、他の細胞タイプ6で神経球を培養することによって。さらに、単層培養と比較して、NSAでは、少量の組織から、または少数の細胞からより高い細胞密度を得ることができ、並行研究を行うことを可能にし、したがって動物の数を減少させる1。
NSAは、NSC11、12、1311を単離および拡張する最も一般的な方法であり、12,13異なる条件間の所定の組織サンプル5および前駆体細胞頻度に存在する前駆細胞の数を推定するために使用することができる。しかし、神経圏と単層培養はどちらも静止NSC14を考慮していない。また、NSAはいくつかの制限を有する11、12、1312,13および結果として生じる神経圏周波数は、培地成分を含む多くの要因に依存し、解剖手順、解11離プロセス1111、12、13、及び神経圏凝集,12,135。確かに、高密度培養では、神経球は凝集する傾向がある。したがって、サンプル内の前駆細胞の数を推定する際には注意が必要です。上記の制限を克服するために、単一層,5、15に分離されたNCCsを拡張し5、継代することもできる。重要なのは、NSAを使用して異なる条件間で前駆細胞周波数を比較することは非常に有用であり、正確であり、これらの制限はすべて同じ実験で行われるすべての条件の間で暗黙的かつ類似しているためです。
神経圏文化には注意が必要な重要なステップがあります。脳の収穫ステップでは、髄液の完全な除去と神経原性ニッチの良好な分離は、NCCsの純度と収率を最大化するために不可欠です。組織解離の間、トリプシンのタンパク質分解活性のために、トリプシンまたはより長いインキュベーション時間の過剰な使用は、細胞のライシスを引き起こす可能性がある。さらに、通過の日は、神経球の健全な集団を得るために重要です。直径が200μmを超える通過性神経球は、NCCsの生存率、増殖および分化能力に大きく影響する。6さらに、SVZ細胞およびDG細胞用PDLおよびPLD/ラミニンをコーティングすることは、分化プロセスを損なうことなく神経球から良好な細胞移動を確実にするために不可欠です。免疫細胞化学分析の観点から、PFAによるインキュベーション時間が長いと、抗原をマスキングし、背景を増加させることで染色を損なう可能性があります。
NSAは、神経発達と分化のインビトロ研究のためだけでなく、治療目的のために、一貫した無制限のNSPCsを提供するための強力なツールです16,,17.実際、このアッセイは、NSPC増殖および分化18,19,19に関与する分子および細胞機構をさらに理解するために、遺伝的および行動モデルに適用することができる。このアッセイはまた、異なる薬物および化合物20、21、2221,22を試験するとともに、NSC特性を調節するために遺伝子操作19、23,23を行う場合にも有用である。20免疫細胞化学に加えて、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応およびウェスタンブロット分析はRNAおよびタンパク質発現にアクセスするために行うことができるが、一方、電気生理学的研究およびカルシウムイメージングは、新生ニューロン21の機能を評価するために使用することができる。

神経球アッセイ(NSA)は、1992年1年、22年に最初に説明され、神経幹細胞(NSC)研究におけるユニークで強力なツールのままです。主な神経原性領域からのNSCの分離は、生理学的状態でこれらの細胞を維持するための要件が十分に理解されていないので、困難な問題を抱えています。NSAにおいて、細胞は、表皮成長因子(EGF)および塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)1、2、3を含む増殖因子の存在を有する化学的に定義1,2,3された無血清培地で培養される。神経前駆細胞(幹細胞および前駆細胞)は、これらの細胞がEGFおよびFGF応答性の期間に入り活性増殖の期間であるので、これらのマイトゲンを用いて選択され、他の細胞、すなわち分化した細胞は、死ぬ4である。神経前駆細胞は神経球として増殖し、その後、これらの細胞のプールをさらに拡大するために通過することができる5.重要なことに、これらの神経幹細胞前駆細胞(NCC)は多能であるため、ニューロン、オリゴデンドロサイトおよびアストロサイト5の3つの主要な細胞型(CNS)に分化することができる。
NSAは、生理学的および疾患の文脈の両方で、NSC増殖および自己再生、および神経およびグリア分化を含むいくつかのプロセスを研究するために使用することができる未分化CNS前駆体の再生可能な供給源を提供する。さらに、インビトロ研究は、開発中の神経前駆体に存在する固有の仕様の程度を評価し、細胞の全能力を研究し、それらの正常な環境6に関連する外因性の手がかりを除去することによって使用することができる。神経球モデルは、血清を欠いた培地中に細胞を維持することによって、環境キューが周囲の細胞6によってのみ提供されるので、推定調節因子を評価するのに価値がある。さらに、NSAでは、NSPCは培養中に容易に拡大され、領域あたりの細胞の密度が高く、神経圏の不均一な組成はインビボニッチ6といくつかの類似性を有する。これらの確立された利点は、この方法論が多くの研究者によって広く使用されている理由です。
以下のプロトコルは、2つの主要な神経原性領域(脳室領域(SVZ)および海馬樹状回(DG)からの出生後NSPC集団の単離から、神経球としての細胞の拡大、ならびにニューロン、星細胞およびオリゴデンドロサイトへの分化に関する全てのプロセスを詳細に記述する。最後に、SVZおよびDG由来のNCCsのステムおよび多能性特性にアクセスするために、異なるアッセイも記載されている。

<table><tbody><tr><td>0.05% トリプシン-EDTA (1X)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>0.4% トリパン ブルー溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20ML</td><td></td></tr><tr><td>12mm ガラスカバーガラス</td><td>VWR</td><td>631-1577</td><td></td></tr><tr><td>15mL 遠心分離管</td><td>コーニング</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>5-ブロモ-2'-デオキシウリジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9285-1G</td><td></td></tr><tr><td>50 mL遠心分離機チューブ</td><td>コーニング</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>70% エタノール</td><td>Manuel Vieira &C&ordf;(irm&atilde;o)Sucrs、Lda</td><td>UN1170</td><td></td></tr><tr><td>接着スライド、Menzel Gl&auml;ser, SuperFrost Plus</td><td>VWR</td><td>631-9483</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ロバ抗チキン IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A11039</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ロバ抗ウサギ IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ロバ抗ラット IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A21208</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 ロバ抗マウス IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A10037</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 ロバ抗ウサギ IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A10042</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 ヤギ抗マウス IgG (H+L)</td><td>Life Technologies</td><td>A21235</td><td></td></tr><tr><td>抗 5-ブロモ-2-デオキシウリジン</td><td>Dako</td><td>M0744</td><td></td></tr><tr><td>抗 CD140a (PDGFR&α;) (ラット)</td><td>BD Biosciences</td><td>558774</td><td>1:500 の比率で希釈します。</td></tr><tr><td>抗コンドロイチン硫酸プロテオグリカンNG2(ウサギ)</td><td>メルクミリポア</td><td>AB5320</td><td>1:200の比率で希釈します。</td></tr><tr><td>抗ダブルコルチン(ウサギ)</td><td>Abcam</td><td>ab18723</td><td>1:200の比率で希釈します。</td></tr><tr><td>抗ダブルコルチン(鶏肉)</td><td>シナプス系</td><td>326006</td><td>1:500の比率で希釈します。</td></tr><tr><td>抗グリア線維性酸性タンパク質(ウサギ)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9269-.2ML</td><td>1:1000の比率で希釈します。</td></tr><tr><td>抗ミエリン塩基性タンパク質(ウサギ)</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>78896S</td><td>1:200の比率で希釈します。</td></tr><tr><td>Anti-Nestin(マウス)</td><td>Merck Milipore</td><td>MAB353</td><td>1:200の比率で希釈します。</td></tr><tr><td>抗ニューロン核(マウス)</td><td>Merck Milipore</td><td>MAB377</td><td>PBS 1Xに6% BSAを使用し、1:400の比率で希釈します。</td></tr><tr><td>Anti-SOX2 (rabbit)</td><td>Abcam</td><td>ab97959</td> 1<td>:500の比率で希釈します。</td></tr><tr><td>抗チューブリン &β;3(ウサギ)</td><td>BioLegend</td><td>802001</td><td>1:200の比率で希釈します。</td></tr><tr><td>Axiovert 200 広視野顕微鏡</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50X), 無血清</td><td>ThermoFisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-500g</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>NZYTech</td><td>MB04602</td><td></td></tr><tr><td>細胞計数チャンバー, Neubauer</td><td>Hirschmann</td><td>8100104</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養 CO2インキュベーター</td><td>ESCO</td><td>CCL-170B-8</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar TC-Treated 24 Multiple Well Plate</td><td>Corning</td><td>CLS3524-100EA</td><td></td></tr><tr><td>二ナトリウムリン酸水素二水和物</td><td>Merck Milipore</td><td>1.06580.1000</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, GlutaMAX Supplement</td><td>ThermoFisher</td><td>31331028</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 - ファインフォーセプス</td><td>FST</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #5S 鉗子</td><td>FST</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>デュモン#7鉗子</td><td>FST</td><td>11272-30</td><td></td></tr><tr><td>上皮成長因子</td><td>サーモフィッシャー</td><td>53003018</td><td></td></tr><tr><td>線維芽細胞成長因子</td><td>サーモフィッシャー</td><td>13256029</td><td></td></tr><tr><td>フィルターペーパー</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>ファインハサミ - シャープ</td><td>FST</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Gillete Platinum 5ブレード</td><td>Gillette</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HBSS, no calcium, no magnesium</td><td>ThermoFisher</td><td>14175053</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>1399</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Merck Milipore</td><td>1.09057.1000 (1L)</td><td></td></tr><tr><td>Labculture Class II Biological Safety Cabinet</td><td>ESCO</td><td>2012-65727</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>McILWAIN Tissue Chopper</td><td>The Mickle Laboratory Engineering CO., LTD.</td><td>MTC/2</td><td>を 450 &mu;m</td></tr><tr><td>マイクロヘラ - 12 cm</td><td>FST</td><td>10091-12</td><td></td></tr><tr><td>マイクロチューブ 0.5 mL</td><td>SARSTEDT</td><td>72.699</td><td></td></tr><tr><td>マイクロチューブ 1.5 mL</td><td>SARSTEDT</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>マイクロチューブ 2.0 mL</td><td>SARSTEDT</td><td>72.691</td><td></td></tr><tr><td>NeuroCult Chemical Dissociation Kit (Mouse)</td><td>Stem Cell</td><td>5707</td><td></td></tr><tr><td>オリンパスの顕微鏡 SZ51</td><td>オリンパス</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド、粉末</td><td>VWR</td><td>28794.295</td><td></td></tr>ペ<tr><td>ニシリン-ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿60 mm</td><td>コーニング</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>リン酸塩標準溶液、PO43-水中</td><td>BDH ARISTAR</td><td>452232C</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-D-リジン100mg</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P7886</td><td></td></tr>ポリ<tr><td>-L-オルニチン溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td></td></tr>塩化<tr><td>カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405-250g</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170-25MG</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>VWR</td><td>27800.360.5K</td><td></td></tr>水<tr><td>酸化ナトリウム</td>メル<td>クミリポア</td><td>535C549998</td><td></td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>BDH</td><td>14630</td><td></td></tr><tr><td>VWR INCUライン IL10</td><td>VWR</td><td>390-0384</td><td></td></tr></tbody></table>

出生後(p1-3)マウス神経起源ニッチからの神経球の分離と拡大

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

神経球アッセイは、増殖、自己再生、多能性を含む神経幹細胞/前駆細胞(NCC)の固有の特性を研究するための非常に有用なインビトロ技術です。出生後および成人の脳では、NCCは主に2つの神経新生ニッチに存在する:側心室を裏打ちする脳室帯(SVZ)と海馬デンテート回(DG)のサブ顆粒帯。出生後の脳からの神経原性ニッチの分離は、より高い収率の結果的な利点を有する培養中のNCCのより高い量を得ることを可能にする。各神経圏内の細胞間の密接な接触は、神経起源のニッチに似ている可能性のある微小環境を作成します。ここでは、1-3日齢(P1-3)マウスからSVZおよびDG由来の神経球培養を生成する方法と、経大体による神経球の拡張について詳しく説明します。これは、神経圏アッセイにより、NSPCクローンの高速生成(6-12日)が可能であり、動物の使用数の大幅な減少に寄与するため、有利なアプローチです。分化条件で神経球をめっきすることにより、NSPCと異なる神経系統(ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト)の分化細胞で構成される細胞の擬似単層を得ることができ、NSPC増殖、分化、細胞生存および腎生異に対する固有または外因性因子の作用の研究を可能にする。

NSAを用いて得られたSVZおよびDG神経球は、未分化細胞で構成され、Sox2に対して陽性、ネスチンに対する自己再生能力および陽性に関与する転写因子である、NSPCsで発現する中間フィラメントタンパク質(図1A)。また、SVZ由来の神経球は、DGよりも大きな寸法を持っています(図1A)。重要なのは、分化条件において、SVZ由来およびDG由来のNCCsは、細胞の疑似単層を形成する神経球から移動する(図1B)。
自己再生能力にアクセスするために、細胞対アッセイは、分化プロセスを開始する分割細胞において消失する傾向があるSox2およびnestinの発現に基づいて行われる。両方の神経性領域で、 Sox2+/+/nestin+/+/DCX--対称分割(自己更新)、Sox2-/+Figure 2A1,B1/nestin-/+ / /の存在を観察することが可能です。 DCX+/-非対称分割 (図 2A1,B2) および Sox2-/-/nestin--/DCX+/+対称分割 (分化) (図 2A2,B1)。
神経球を通過すると、NCCの収率が増加します。しかし、DIV2での細胞死は、受け継ぎによって変化する。実際、Pi陽性細胞の割合はSVZの細胞通過に伴って増加する(P0:15.6%±1.2%対P1:19.2%±2.7%対P2:32.35%±0.14%対P3:39.6%±4.0%)DG(P0:16.31%±0.95%対P1:32.1%±1.7%対P2:27.42%対P3:32.2%±3.1%)(図3)
分化の開始時にSVZとDG NSPCsの分化から得られたニューロンで神経新しい遺伝子導入を評価することができます: DIV1 (図 4A,D),DIV2 (図 4B,E) および DIV3 (図 4C,F).実際、図4に示されているように、分化に伴って、神経突起の長さと影響が増加します。
細胞増殖は、SVZ由来およびDG由来の神経球において評価することができる。DIV1の一次分化された神経球をSVZ(図5A1)とDG(図5A2)と比較すると、BrdU陽性細胞の割合はDGよりもSVZで高い(SVZ:6.15%±0.64%対DG:3.27%±0.13%;p&lt;0.05;n=4;図 5A3)。また、細胞分化は、成熟したニューロンを識別するニューロン核(NeuN)などの成熟したメーカーとBrdU染色を組み合わせることによってもアクセスすることができる(図5B1、B2)。図5B3は、成熟したニューロンに分化する増殖前駆物質の割合がSVZおよびDGで類似していることを示している(SVZ:12.04%±1.58%対DG:13.56%±0.48%;p&gt;0.05;n=4)。
SVZおよびDG由来のNCCのステムおよび多能性は、異なる分化日(DIV2およびDIV7)で異なるマーカーの発現を評価することによってNSAを使用してアクセスすることができる。実際に、NSC(ネスチン及びグリア性フィブリリン酸性タンパク質[GFAP]-二重陽性細胞)は、両方の神経原性領域に存在する(図6A,G)。これらの細胞は、未熟なニューロン(DCX陽性細胞)(図6B,H)、成熟したニューロン(NeuN陽性細胞)(図6F,L)、オリゴデンドロビテ前駆細胞(ニューロングリア抗原2[NG2]および血小板由来増殖)に分化することができる 因子受容体α[PDGFRα]-陽性細胞)(図6C,I)、C,I成熟オリゴデンドロサイト(ミエリン塩基性タンパク質[MBP]陽性細胞)(図6E,K)およびアストロサイト(GFAP陽性細胞)(図6D,J)。
異なる基質は、分化条件下で細胞の擬似単層を形成するためにカバースリップをコーティングするために使用することができます。補助図 1に示すように、カバーリップが PDL 単独での場合よりも PLO または PDL と組み合わせたラミニンを使用したエクストラコーティングを持つ場合、DG 細胞の移行が多くなります (補助図 1B-H)。実際、PDLとラミニンを基質として一緒に使用すると(補助図1C、G)、DG細胞はPDLが単独で使用されるSVZ細胞よりもコンフルエントな擬似単層を形成する(補助図1A、E)。
重要なことに、これらの結果は、2つの主要な神経原性ニッチに由来するNSCの茎および多能性特性を評価するNSAの可能性を示す。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig1.jpg"> 図1:神経球体または擬モノ層として培養した脳室下帯およびデンテート回由来NSPC。(A) SVZおよびDG由来の神経球の代表的な明視野(A1,A3)および蛍光(A2,A4)画像で、Hoechst 33342(青)とNSC(緑色)とネスチン(赤)の核が染色された。(B)分化条件下でSVZおよびDG由来の神経球から生成された擬似モノ層の代表的な明視野画像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig2.jpg"> 図2:細胞対アッセイ。前駆細胞分裂に由来する細胞対の代表的な蛍光画像。SVZおよびDG核をHoechst 33342(青)、Sox2(赤)およびネスチン(白)の幹細胞様細胞、ならびにDCX(緑色)を有する未熟なニューロンで染色した。パネルA1とB1の矢印は、Sox2+/+/nestin+/+/DCX-/-対称的な自己更新部門を示し、 パネル A1 と B2 の矢印は、Sox2+/-/nestin+/-/DCX-/+非対称分割を示し、パネル A2 および B1 の破線矢印は Sox2-/-/nestin-/-/DCX+/+対称的な分化分割を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig3.jpg"> 図3:細胞通過による細胞生存解析SVZおよびDG由来分化された神経球培養におけるDIV2におけるPI陽性細胞の定量分析を、0、1、2および3の通路後(P0−P3)した後に行った。データは平均値±SEM、n = 1-8で表されます。PI = ヨウ化プロピジウム。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig4.jpg"> 図4:DIV1、2および3における腎産生解析。神経突起の代表的な共焦点蛍光画像は、βIII-管内シグナルによって同定され、SVZおよびDGニューロンにおいて(A、D)DIV1、(B,E)DIV2、および(C,F)DIV3においてである。A,DB,E<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig5.jpg"> 図5:細胞増殖アッセイ。DIV1におけるBrdU陽性細胞の代表的な共焦点像(A1)SVZおよび(A2)DG.(A3)DG-およびSVZ由来の分化された神経球培養におけるDIV1におけるBrdU陽性細胞の定量的分析データは平均値±SEM、n=4で表される。*p &lt; 0.05 t検定による。DIV7におけるBrdU-およびNeuN陽性細胞の代表的な蛍光画像(B1)SVZおよび(B2)DG.矢印はBrdU-/NeuN陽性細胞を示す。(B3)DIV7におけるBRDU-ノイN陽性細胞の定量分析データは平均値±SEM、n=4で表される。BrdU: 5-ブロモ-2'-デオキシウリジン, 合成チミジンアナログ.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig5large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60822/60822fig6.jpg"> 図6:SVZ由来およびDG由来の分化された神経球培養に存在する神経細胞型。SVZおよびDG由来細胞型の代表的な蛍光画像は、2日および7日後の神経圏分化(DIV2およびDIV7)で、細胞核をHoechst 33342(青)で染色し、GFAP(A,G緑)およびネスチン(赤)のNSC(B、H)未熟化B,HDCX(緑)、(C,I)PDGFRα(緑)およびNG2(赤)のオリゴデンドロサイト前駆細胞のニューロン、GFAP(緑)のアC,Iストロサイト(D,J)、MBP(緑)の成熟したオリゴデンドロサイト(緑色)、および(F,L)NeuN(赤)の成熟したニューロン。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822fig6large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/60822/60822suppfig1.jpg"> 補足図1:神経球の付着と移行のための異なる基質をテストして、疑似単層を形成する。ポリD-リジンを基質として用いたSVZ由来擬似モノ層(A,E)の代表的な蛍光画像、(B,F)ポリD-リジンを基材として用いたDG由来擬似モノレイヤー、(C,G)ラミニンを基板としてポリDリジンを用いたDG由来擬似モノレイヤー、およびポリ-L-オルニチンを基材としてポリD-L-オルニチンを用いたDG由来擬似モノレイヤーC,G<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60822/60822suppfig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

本稿では、主マウス神経原性ニッチ由来の出生後マウス神経幹細胞から神経球培養を生成するためのプロトコルについて詳細に述べる。神経球は、脳組織から神経幹細胞を同定するために使用され、前駆細胞数の推定を可能にする。さらに、これらの3D構造は分化条件でメッキすることができ、ニューロン、オリゴデンドロサイトおよびアストロサイトを生じさせ、細胞運命の研究を可能にする。

出生後(P1-3)マウス神経起源ニッチからの神経球の分離と拡大

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including ...

神経球アッセイは、生理学的および病理学的文脈の両方において増殖、自己再生および多能性を含む神経幹/前駆細胞の固有の特性を研究するためのインビトロ技術で有用である。三次元構造のため、この技術は成人の神経新生を研究するための強力なツールです。また、神経幹細胞/前駆細胞のより高い収率を培養し、得るのにも有用である。この神経球アッセイは、アルツハイマー病やパーキンソン病や多発性硬化症などの脳障害の研究に適用することができます。神経球はまた、脂肪組織または腸などの他の脳領域またはシステムから得ることができる。フィリパ・リベイロとの手順をデモンストレーションすることは、私のグループの博士課程の学生、リタ・ソアレスです。出生後1日目から3頭のマウス脳を収穫するには、体の腹側部分を頭の基部に保持し、小さな尖ったはさみを使用して、頭の全長にわたって皮膚に正中線切開を行い、頭蓋骨を露出させる。頭蓋骨の基部に縦切開を行い、脳構造を損傷しないように、できるだけ浅い角度で矢状縫合糸に沿って切断し続けます。湾曲した鉗子を使用して頭蓋骨を側面に剥がし、脳を露出させ、脳の下に小さなへらをスライドさせて脳の基部に接続されている頭蓋神経と血管を切断します。抗生物質を補った冷たいHBSSのペトリ皿に脳を入れ、低倍率で解剖顕微鏡の下に皿を置きます。脳を後ろ面に配置します。小脳によって脳を保持しながら、 脳の腹側と嗅球から髄を除去するために細かい鉗子を使用します。脳を腹側の側面に回転させ、残りの髄を剥がします。その後、鉗子を使用して小脳を取り除き、湾曲した尖った鉗子を使用して、組織チョッパーの上に11マイクロメートルの細孔を持つフィルターペーパーの一部に脳を移します。SVZおよびDGマイクロディセクショニングの場合、脳を450マイクロメートルのコロナセクションに切り刻む。濡れた薄層を使用して、切断顕微鏡の下で冷たい抗生物質補充HBSSで満たされた新しいペトリ皿に切片した脳を収集し、側心室でスライスが到達するまで前部から後部の方法でコロナスライスを分離するために鉗子を使用します。細かい鉗子を使用して、側孔の側壁を囲む組織の薄い層を切断し、線条体の花脈腫と脳梁を除き、鉗子の先端を体頭梁のすぐ下に置き、もう一方の先端を側側心室の腹側領域に隣接する組織に配置してSVZを分離する。側面心室を囲む組織の小さなラインをカットし、補足されたHBSS溶液を含むサンプルチューブに解剖組織を収集します。すべてのスライスが鉗子でマイクロセクションされ、海馬の形成に達したら、DGがまだ認識できない海馬で最初のスライスを捨てる。DG を除去するには、まず海馬をスライスから分離し、顕微鏡を再び焦点を合わせ、DG の周囲の境界を視覚化します。DG を収穫するには、鉗子を使用して DG と CA1 領域の間を切り取り、続いて DG と CA3 領域の間で垂直に切り取ります。次に、その抗組織と隣接する組織を取り除き、収穫した組織を抗生物質補充HBSS溶液の別々のチューブに入れる。SVZおよびDGサンプルを解離するには、トリプシン-EDTA 0.05%をHBSS中のトリプシン-EDTA0.05%の5〜10%の最終濃度に加え、摂氏37度で約50分間インキュベーションします。トリプシンの全体の使用またはあまりにも長いインキュベーション時間は、細胞死の増加につながることができます, 負の細胞の成長に影響を与えます.組織が一緒に凝集したら、4回連続の洗浄のための酵素溶液を、洗浄ごとに新鮮な補充されたHBSSの1ミリリットルに置き換えます。最後の洗浄後、消化した組織を1ミリリットルの無血清培地で再中断し、1ミリリットル当たり10ナノグラムの表皮成長因子と、1本の塩基性線維芽細胞成長因子当たり5ナノグラムを補う。次に、均質な細胞溶液が得られるまでP1000ピペットで7~10回穏やかなピペットで組織を機械的に解化します。解別されたDGまたはSVG細胞の密度を決定するには、各懸濁液中の細胞を造液計で数える。細胞を神経球に拡大するには、成長因子を補った無血清培地中の1ミリリットル当たり10~4番目の細胞で個々の細胞集団を希釈し、細胞懸濁液の5ミリリットルを未コーティングの直径60ミリメートルのペトリ皿に播種する。その後、SVZ細胞を6〜8日間インキュベートし、DG細胞を摂氏37度で10〜12日間培養し、一次神経球形成を行います。神経球の大部分が直径150~200マイクロメートルの場合、培養物から細胞懸濁液を収穫し、遠心分離によって神経球を採取する。別の遠心分離で細胞を収集する前に、メーカーの指示に従ってマウスの化学的解離キットで神経球パレットを再中断します。上清を成長因子で補った無血清培地1ミリリットルに置き換え、ペレットを約10回穏やかに評価してみてください。解離した神経細胞を数え、新しい60ミリリットルのペトリ皿に成長因子を補った無血清培地で、ミリリットル密度あたり2倍の10〜4番目の細胞で細胞を再播種します。次に、細胞を細胞培養インキュベーターに、必要に応じて6〜8日または10〜12日間戻し、二次神経球を得る。神経球アッセイを用いて得られたSVGおよびDG神経球は、未分化Sox2陽性、ネスチン陽性細胞から構成される。特に、SVG由来の神経球は、DGの対応よりも大きな寸法を有する。重要なのは、分化条件下で、SVGおよびDG由来の神経幹/前駆細胞が神経球から移動し、細胞の擬似単層を形成する。両方の神経性領域において、自己再生を示す対称的な分裂に対応するSox2二重陽性、二重陽性、ダブルコルチン二重陰性細胞対の存在を観察することができる。細胞ペアは、Sox2陽性、ネチン陽性、およびダブルコルチン陰性、および他の細胞Sox2陰性、ネチン陰性、およびダブルコルチン陽性が非対称分裂を示す。Sox2ダブルネガティブ、ネスチンダブルネガティブ、およびダブルコルチン二重正細胞対は、分化を示す対称的な分裂に対応する。全体として、受死はインビトロで2日目の細胞死亡率を変化させる。Neurito遺伝子導入は、分化の開始時にSVGおよびDG神経幹/前駆細胞の分化から得られたニューロンで評価することができる。観察されたように、神経突起の長さと影響は分化とともに増加する。増殖細胞の割合が高いのはDGと比較してSVGで観察される。成熟したニューロンに分化増殖前駆物質の割合は、両方の神経原性ニッチで類似しているが.両細胞タイプとも、未熟なニューロン、成熟中性子、オリゴデンドロサイト前駆細胞、成熟したオリゴデンドロサイト、およびアストロサイトに分化することができる。神経球を得た後、免疫細胞化学、カルシウムイメージング、ウェスタンブロット、RT-PCRを含むいくつかの方法を行い、神経幹細胞/前駆細胞の茎と多能性を研究することができます。神経圏アッセイは、神経幹/前駆細胞の増殖と分化の両方に関与する分子および細胞プロセスをさらに評価するために、遺伝的および疾患モデルに適用することができる。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

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