β-アレプチンの並列尋問2 PRESTOタンゴアッセイを用いたGPCR規模でのリガンドスクリーニングの募集

プレストタンゴプラットフォームは、リガンド誘導β逮捕2募集をプロファイリングする孤児の標的を含む、ヒトゲノム内のすべての非嗅覚GPCの並列かつ同時の尋問を実行するために考案されました。プレストタンゴプラットフォームは、Gタンパク質に依存しないβ-アレプチンの採用アッセイを使用して、GPCRゲノム全体を並列アプローチでプロファイリングする唯一のオープンソースリソースです。プロセッサのデモンストレーションは、私の研究室のジュネーブ・ラローシュ・リサーチ・アソシエイトと、私の研究室で博士号を取得したマネル・ジガールです。

手順を開始する前に、384の光学底板の適切な実験数の各ウェルにミリリットルポリL-リジン溶液あたり25マイクログラムの20マイクロリットルを追加し、30分〜2時間室温でプレートをインキュベートします。インキュベーションの終わりに、シンク上のプレートをフリックして余分なポリL-リジンを除去し、各井戸に40マイクロリットルの抗生物質抗ミキサイト溶液を加えます。その後、セルの播種に必要なプレートを摂氏37度でインキュベートし、残りのプレートを摂氏4度に置いて長期保存します。

一次スクリーニングのためにHTLA細胞を播種するには、1皿あたり0.05%トリプシンEDTAの6ミリリットルで培養物を処理する前に、PBSの10ミリリットルでコンフルエント150ミリメートルの細胞培養物を穏やかに洗い流す。細胞が剥離すると、同量のDMEMを含む50ミリリットルの円錐管に細胞懸濁液をプールする。遠心分離により細胞を回収する。

ペレットをDMEM濃度のミリリットル当たり5番目の細胞に10倍10倍に再懸濁し、プレートをシンク上でフリックして抗生物質抗ミキ酢液を除去する。プレートをタップして乾燥させ、各ウェルに45マイクロリットルの細胞を播種します。その後、プレートを摂氏37度、二酸化炭素45%を一晩置きます。

トランスフェクション用の384ウェルDNAソースプレートを調製するために、各プラスミドの1ミリリットル当たり50ナノグラムの1ミリグラムを配布し、GPRCタンゴ構築物を0.1X Tris-EDTAにそれぞれ関心のあるGPRCタンゴ構築物をコードし、96ウェルプレートの各ウェルウェルに配布する。マルチチャネルピペットを使用して、図示したように、96ウェルプレートの各ウェルから1つの384ウェルDNAソースプレートの個々のウェルに手動で10マイクロリットルのDNA溶液を移動させます。次に、40マイクロリットルの0.313モル塩化カルシウム溶液をDNAソースプレートの各ウェルに移し、各ウェルの内容物を穏やかに混合します。

穏やかな混合と384ウェルDNAソースプレートの各ウェルに2x HEPESバッファーの50マイクロリットルを追加します。384ウェルDNAソースプレートから播種されたHTLA細胞の各ウェルにDNAトランスフェクション混合物の10マイクロリットルを1分間転写した後、細胞培養インキュベーター内の細胞を一晩インキュベートする。翌日、トランスフェクションされた細胞培地をデカントし、細胞に直接触れないように注意して、各井戸に40マイクロリットルの飢餓培地をゆっくりと加える。

次に、細胞培養インキュベーターにプレートを戻す前に、目的の化合物の20マイクロリットルの化合物を含まない交互の列に20マイクロリットルの車両バッファーを加え、交互の列に3倍の濃度で、プレートを戻します。刺激後16〜24時間後にトランスフェクションされた細胞培地をデカントし、それぞれに20マイクロリットルの新しいグロー試薬を加え、光から保護された室温で5〜20分間インキュベーションする。その後、マイクロプレート発光カウンターのプレートを、井戸あたり1秒の積分時間で読み取ります。

二次スクリーニングのために、HTLA細胞を100ミリメートルの皿中に5倍10倍にして、6細胞の全細胞密度を1皿当たり11ミリメートルの完全な培地で37°Cで24時間培養する。翌日、GPCRの10マイクログラムのコンパニューDNAと500マイクロリットルのトリスEDTA塩化カルシウム溶液を渦巻きと混合し、続いて500マイクロリットルのHEPESバッファーを添加した。激しく振った後、室温で1分間溶液をインキュベートし、すぐに1ミリリットルの溶液を細胞に落とします。

穏やかに揺れ、沈殿物を均等に分配し、プレートを摂氏37度で24時間置きます。翌日、蛍光セルイメージャーでトランスフェクション効率を確認します。50% を超えるトランザクションが最適です。

0.05%トリプシンEDTAの3ミリリットルで細胞を取り外す前に、トランスフェクトされた細胞をversene溶液で静かにすすいする。遠心分離によって解離した細胞を収集し、飢餓培地濃度の1ミリリットル当たり5番目の細胞に4倍10〜5番目の細胞でペレットを再中断する。次に、ポリL-リジンコード384ウェルプレートの各ウェルに45マイクロリットルの細胞をシードし、少なくとも4時間細胞培養インキュベーターにプレートを入れます。

半分の丸太線量曲線応答プレートを準備するには、96ウェルプレートの最後の行を除くすべてのHEPESと抗生物質抗ミキサイトを添加したHBSSの270マイクロリットルを追加し、各高低薬物溶液の30マイクロリットルを行Hのウェルに追加します。に達します。回路図を参考に、96ウェルプレートの行AからGまでの低カラム希釈液の20マイクロリットルを、高カラム希釈液の20マイクロリットルを、以前に着席した384ウェルプレートのウェルBからHまでのウェルに混ぜ合わせます。その後、最低16時間、摂氏37度でプレートをインキュベートします。

刺激後16〜24時間後に、トランスフェクションされた細胞培地をデカントし、20マイクロリットルのグロー試薬を各ウェルに5〜20分間インキュベーションしてから、1回の統合時間でマイクロプレート発光カウンターのプレートを読み取る。この代表的な実験では、一次スクリーニングで尋問された168個のGPDRのうち、ドーパミン受容体D3およびオプシン5だけが潜在的な活性標的として候補となった。ドーパミン受容体D3は4.7の有意な対数2倍変化を生じ、オプシン5はわずかに低い応答を2.39で産生した。

比較すると、ドーパミン受容体D2は、一次スクリーンに対する陽性対照が4.58のlog2倍変化を生じた。二次スクリーニングからの応答曲線は、クロマチン顆粒抽出物が、ドーパミン受容体D3での活性ヒットとしての妥当性を確認するクインピロールに対して、半分の最大有効濃度値で同様のシグナルウィンドウを生成することを実証した。陰性対照と同様の平坦な用量曲線は、オプシン5のために産生されたが、クロマチン顆粒抽出物の可能な標的としてこの受容体を排除した。プレストタンゴは、細胞分布の変動性、トランスフェクション効率、連続薬物希釈は複合誤差をもたらし、データの精度に影響を与える可能性があります。

放射性リガンド結合法、生物発光共鳴エネルギー移動、環状AMPカルシウム、内在性の機能アッセイなどの直交的方法を用いて、リガンド受容体相互作用をさらに確認し、特徴付けることができます。