Name: 動脈内血圧モニタリングと気管切開による換気を用いたマウスの脳死誘導 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: 学ぶマウス脳死誘導モデル。動脈内血圧モニタリングと気管切開による換気を用いて、脳死後の全身炎症反応と臓器移植への影響を評価する方法です。免疫マーカー発現と血圧変動を解析し、移植成績向上に寄与します。

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動物実験は、米国医学研究会が定める実験動物の治療の原則と、米国科学アカデミーが作成した実験動物のケアと使用ガイドに従って行われ、国立衛生研究所が発行した(NIH出版第86-23号、改訂版)。すべての実験は、オーストリアの文部科学省(BMWF-66.011/0071-II/3b/2012)によって承認されました。
1. 動脈カテーテル法
<ol><li>局所的な慣行(例えばブプレノルフィン)に従ってケタミンおよびキシラジン10および鎮痛薬の腹腔内注射でマウスを麻酔する。 後肢を鉗子でつまんで、麻酔の正しい深さを確認します。 注:この研究では、8-12週齢の雄C57BL/6Nマウスを使用しました(体重20〜25g)。著者らは、同じ年齢の男性BALB/cを不成功にテストしたが、他の株を試していない(議論参照)。</li>
	<li>電気カミソリを使用して、関心のある領域(頭、首)の髪を削除します。傷の汚染を防ぐために、ゆるい髪が残らないようにしてください。その後、70%エタノール/クロルヘキシジン/ベタジンで外科分野を消毒し、外科医に向かう頭部でマウスの上に立たします。</li>
	<li>はさみを解剖して子宮頸管中線切開を行います。</li>
	<li>下顎腺と首の筋肉組織を解剖し、一般的な頸動脈を露出させるためにそれらを分離します。鉗子を介して主に鈍い解剖を使用してください。</li>
	<li>3を置く 8-0右の一般的な頸動脈の下の絹の合字。</li>
	<li>近位合字にクランプを置き、流れが中断されるように動脈に緊張をもたらします。</li>
	<li>最も遠位の合字を閉じます。</li>
	<li>切開の頭蓋面に小さな、前形の皮膚の穴を通して動脈カテーテルを挿入します。カテーテルの内腔が大きすぎると、血流を減らすために絞り、変形します。3 つの合字をすべて固定します。</li>
	<li>脱臼を避けるために皮膚にカテーテルを固定します。これを行うには、あらかじめ形成された皮膚穴の領域の皮膚にカテーテルを接続する縫合線(例えば、5-0モノフィラメント、非吸収性)を使用します。</li>
</ol>2. 気管切開術
<ol><li>鉗子を使用して気管前筋肉をぶっきらぼうに解剖する。</li>
	<li>2つの8-0を配置する気管の下の絹の合字。</li>
	<li>一方的な換気を避けるために、マイクロハサミをできるだけ近く使用して気管切除します。2つの気管軟骨の間の水平切断線を使用します。</li>
	<li>換気チューブを挿入し、両方の準備された合字で固定します。 注: 気管の近位端は結紮する必要はありません。</li>
	<li>ランニング縫合糸で皮膚を閉じる(例えば、6-0モノフィラメント、非吸収性)。</li>
	<li>150/分の周波数と200 μLの潮の容積でマウスを換気します。</li>
</ol>3. 脳死誘導
<ol><li>マウスを動かしやすい位置に配置します。</li>
	<li>外科用ハサミと鉗子を使って頭蓋骨から皮膚を取り除いて皮膚を保持します。</li>
	<li>左頭頂皮質の上に1mm口径の穴パラメディアリーを掘削します。内側のコンパクトな骨と硬膜を破る前に掘削を停止します。</li>
	<li>鈍い鉗子を使用して頭蓋骨の最終的なティッシュブリッジを貫通し、鋭い縁を取り除く。</li>
	<li>バルーンカテーテルを挿入し、頭蓋腔内に完全に収まるようにします。バルーンに生理が詰まっていて、すべての空気が避難していることを確認してください。</li>
	<li>注射器ポンプの助けを借りて、10-15分(0.8-1.2 mLの総容積)の期間の間に0.1 mL /分から始める。 注:マウスは、ミオクローヌス、マイドリア症、さらなる発作活動および腺ガスプスを示します。</li>
	<li>マウスの尾が硬くなり、建てられたら、マウスの脳が死んだと発音します。 注:BDは、特徴的な初期血圧ピーク(クッシング反射)、脳幹反射および自発的な呼吸の欠如によって確認される。定期的な無呼吸検査は、マウスが酸素不足のために循環が不安定になる可能性があるため、実験中には避けるべきである。</li>
	<li>バルーンカテーテルの膨張を止める。</li>
	<li>低体温症を避けるために、マウスの上に加熱毛布を置きます。</li>
</ol>4. BD期間中
<ol><li>血圧を定期的に監視し、文書化します。長期の降圧相を有するマウスを除外する(平均動脈圧[MAP]<50 mmHgの場合は>30分)。</li>
	<li>0.1 mLの生理液を30分ごとに注入し、マウスの血圧を安定させます。 注:合計0.8mLの生理液は、この研究の各マウスに投与された。</li>
	<li>BD持続時間の4時間後、マウスの臓器/組織を収穫する。実験の最後にマウスの心臓部が鼓動していない場合は、実験からマウスを除外します。</li>
</ol>5. シャム手順
<ol><li>ステップ 1.1-3.3 を実行します。 メモ: 内側のコンパクトなボーンを開かないでください。バルーンカテーテルを挿入したり膨らませたりしないでください。</li>
	<li>マウスの近くに滞在し、継続的に動物を観察します。麻酔の正しい深さを確認するために鉗子で後肢を繰り返しつまみます。マウスが目覚めの兆候を示す場合は、皮下(開始用量の約1/2)に追加の麻酔を適用し、私たちの経験では、麻酔後約2-3時間後に起こります。</li>
	<li>BDマウスと同じ量の静脈内生理的生理を適用する。 注:シャムマウスは、換気の停止後に自発的な呼吸を取り戻します。BD マウスは使用できません。無呼吸検査はモデルを確立する間に行われるべきですが、実験中は不必要な生理的ストレスのために避けるべきです。</li>
</ol>

<ol><li>Hart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OPTN%2FSRTR+2017+Annual+Data+Report%3A+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">OPTN/SRTR 2017 Annual Data Report: Kidney.</a> American Journal of Transplantation. 19 (Suppl 2), 19(2019).</li>
<li>The Quality Standards Subcommittee of the American Academy of Neurology. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practice+parameters+for+determining+brain+death+in+adults+%28summary+statement%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Practice parameters for determining brain death in adults (summary statement).</a> Neurology. 45 (5), 1012-1014 (1995).</li>
<li>Terasaki, P. I., Cecka, J. M., Gjertson, D. W., Takemoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+survival+rates+of+kidney+transplants+from+spousal+and+living+unrelated+donors%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+Medicine%22%5BJournal%5D)">High survival rates of kidney transplants from spousal and living unrelated donors.</a> New England Journal Medicine. 333 (6), 333-336 (1995).</li>
<li>Pratschke, J., Neuhaus, P., Tullius, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+can+be+learned+from+brain-death+models%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+International%22%5BJournal%5D)">What can be learned from brain-death models?</a> Transplant International. 18 (1), 15-21 (2005).</li>
<li>Wilhelm, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+heart+by+donor+brain+death+accelerates+acute+rejection+after+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Activation of the heart by donor brain death accelerates acute rejection after transplantation.</a> Circulation. 102 (19), 2426-2433 (2000).</li>
<li>Pomper, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+a+mouse+model+of+brain+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Introducing a mouse model of brain death.</a> Journal of Neuroscience Methods. 192 (1), 70-74 (2010).</li>
<li>Ritschl, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+brain+death+leads+to+differential+immune+activation+in+solid+organs+but+does+not+accelerate+ischaemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Donor brain death leads to differential immune activation in solid organs but does not accelerate ischaemia-reperfusion injury.</a> Journal of Pathology. 239 (1), 84-96 (2016).</li>
<li>Atkinson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor+brain+death+exacerbates+complement-dependent+ischemia%2Freperfusion+injury+in+transplanted+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Donor brain death exacerbates complement-dependent ischemia/reperfusion injury in transplanted hearts.</a> Circulation. 127 (12), 1290-1299 (2013).</li>
<li>Oberhuber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+with+tetrahydrobiopterin+overcomes+brain+death-associated+injury+in+a+murine+model+of+pancreas+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Treatment with tetrahydrobiopterin overcomes brain death-associated injury in a murine model of pancreas transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 15 (11), 2865-2876 (2015).</li>
<li>Floerchinger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+immune+responses+in+a+reproducible+mouse+brain+death+model%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory immune responses in a reproducible mouse brain death model.</a> Transplant Immunology. 27 (1), 25-29 (2012).</li>
<li>Steen, P. A., Milde, J. H., Michenfelder, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+barbiturate+protection+in+a+dog+model+of+complete+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">No barbiturate protection in a dog model of complete cerebral ischemia.</a> Annals of Neurology. 5 (4), 343-349 (1979).</li>
<li>Cooper, D. K., Novitzky, D., Wicomb, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathophysiological+effects+of+brain+death+on+potential+donor+organs%2C+with+particular+reference+to+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Royal+College+of+Surgeons+of+England%22%5BJournal%5D)">The pathophysiological effects of brain death on potential donor organs, with particular reference to the heart.</a> Annals of the Royal College of Surgeons of England. 71 (4), 261-266 (1989).</li>
<li>Herijgers, P., Leunens, V., Tjandra-Maga, T. B., Mubagwa, K., Flameng, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+organ+perfusion+after+brain+death+in+the+rat+and+its+relation+to+circulating+catecholamines%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Changes in organ perfusion after brain death in the rat and its relation to circulating catecholamines.</a> Transplantation. 62 (3), 330-335 (1996).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

BDは、多臓器提供者における同種移植片の質の危険因子であり、多くの病態生理学的変化を伴い、in vivoモデルを使用してのみ十分に評価することができる。血行力学的変化、サイトカイン嵐、ホルモン変化、臓器移植片の質と生存に対する最終的な影響は、vitro4では分析できない。基本的な移植と免疫学的研究の大半は、マウスモデルでのみ広く利用可能な洗練された診断ツールに依存しています。マウスモデルは、BD,関連研究7、8、98において、すでに様々な7新しい洞察を導いている。
20世紀には、BD研究の最初のモデルがヒヒ、イヌ、ブタ11、12で開発されたのに対し、12最初のラットモデルが13を記述され...

移植は現在、末期臓器不全の唯一の治癒治療である。これまで、脳死(BD)患者は臓器提供の主な情報源となってきましたが、循環死後の生活寄付と寄付は貴重な選択肢です。BDは不可逆性昏睡(既知の原因を有する)によって定義される、脳幹反射および無呼吸2の欠如。残念なことに、BD器官は、ヒト白血球抗原(HLA)ミスマッチおよび低温虚血時間3とは無関係に、長期移植片生存期間において劣った結果を示す。一方、この抗原非依存性危険因子に関する鋭意研究は、BDの結果として媒介される病態生理学的変化の3つの主要な側面をもたらす、血行力学的、ホルモン、および炎症性4を生じる。
現在までに、げっ歯類の実験BDモデルは、主にラットを用いて行われてきた。BDに続く固体器官に対する免疫学的影響に関するより大きな洞察を得るために、我々は現在マウスモデルのみが遺伝的または免疫学的要因に関する包括的な調査を可能にするので、BDのマウスモデルを確立することを目指した。このコンテキストでは、マウス システムは、より多くの分析ツールを提供します。
ここで説明するBD誘導の原理は、頭蓋骨の下に挿入されたバルーンカテーテルの膨張によって誘発される頭蓋内圧の増加に基づいている。頭蓋内圧の増加は、大脳、小脳、および脳幹,5,6の灌流を遮断することによってBDの生理学的メカニズム5を模倣する。末梢器官の十分な灌流を保証するために、血圧測定は処置の間に義務付けられている。この目的のために同時に用いられるカテーテルは、液剤置換によって血圧を安定化させるために生理食物投与に役立つ。BDは自然呼吸の停止を伴うため、十分な換気が確保されなければならない。電気毛布は生理学的な中心体温を維持する。
要約すると、このモデルは、BD誘発傷害、白血球移動7、賛辞活性化8、虚血性再灌流傷害9、および他の要因に及ぼす影響に関する詳細な研究を可能にする。

<table><tbody><tr><td>動脈カテーテル(BDネオフロン26G)</td><td>BD</td><td>391349</td><td></td></tr><tr><td>血圧トランスデューサー(APT300)</td><td>Harvard Apparatus Inc.</td><td>73-3862</td><td></td></tr><tr><td>Fogarty Arterial Embolectomy Catheter N&deg; 3</td><td>Edwards Lifesciences Corporation</td><td>120403F</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>FST</td><td>11271-30</td><td></td></tr><tr><td>Homeothermic Blanket Systems with Flexible Probe</td><td>ハーバード・イスプラクティヴュ</td>ー・インク<td>55-7020</td><td></td></tr><tr><td>Ketansol</td><td>Graeub</td><td>6680110</td><td></td></tr><tr><td>マイクロハサミ</td><td>FST</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>ニードルホルダー</td><td>FST</td><td>12060-02</td><td></td></tr><tr><td>Prolene 5-0</td><td>Ethicon</td><td>8698H</td><td></td></tr><tr><td>ポンプ 11 エリート インフュージョンのみ シングル</td><td>ハーバード デバイス インク</td><td>70-4500</td><td></td></tr><tr><td>はさみ</td><td>FST</td><td>14075-11</td><td></td></tr><tr><td>定位顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>トランスポアテープ</td><td>3M</td><td>1527-1</td><td></td></tr><tr><td>アンダーパッド</td><td>Molinea.A</td><td>274301</td><td></td></tr><tr><td>マウス用ベンチレーター (MiniVent Model 845)</td><td>Harvard Apparatus Inc.</td><td>73-0043</td><td></td></tr><tr><td>キシラゾール</td><td>・グラウブ</td><td>7630109</td><td></td></tr></tbody></table>

動脈内血圧モニタリングと気管切開による換気を用いたマウスの脳死誘導

Brain Death Induction in Mice Using Intra-Arterial Blood Pressure Monitoring and Ventilation via Tracheostomy

循環死後の生活献金と寄付の両方が臓器移植の代替機会を提供する一方で、ドナー脳死後の寄付(BD)は依然として固形移植の主要な源泉となっている。残念ながら、脳機能の不可逆的な喪失は、血行力学的およびホルモン修飾を含む複数の病態生理学的変化を誘発することが知られており、最終的に全身的な炎症反応を引き起こす。生体内でこれらの効果を体系的に調査できるモデルは不足しています。BD誘導のマウスモデルを発表し、BDが同種移植片の品質に及ぼす壊滅的な影響の調査に役立つ可能性があります。気管切開術を介して一般的な頸動脈および信頼できる換気を介して動脈内血圧測定を実施した後、BDはバルーンカテーテルを用いて頭蓋内圧を着実に増加させることによって誘導される。BD誘導の4時間後、臓器は分析のために、またはさらなる移植処置のために収穫され得る。我々の戦略は、マウスモデルにおけるドナーBDの包括的な分析を可能にし、固体臓器移植におけるBD関連の効果を詳細に理解し、臓器予備調整を最適化する道を開く可能性がある。

マウスBDモデルは成功した成功率90%以上で100回以上実行されました。さらに、心臓と腎臓の介入後臓器移植は安全に行われ7.
BDは、このモデルを用いてさらに調査され得る様々な病態生理学的変化を誘発する。図1に示すように、血圧は最初の高血圧のピークを示し、続いて長期の降圧相を示す。低血圧の有害な生理学的影響を避けるために、血圧が長時間不十分なマウス(MAP&lt;30分以上50mmHg)を除外した。
もう一つの確立された観察は、BD誘導が免疫系の活性化につながるということです。4時間のBD持続時間の後、mRNAレベルでの免疫マーカーの臓器特異的アップレギュレーション(図2)</stro...

固体臓器移植の文脈において、その病態生理学的効果が臓器や連続移植片に及ぼす影響を評価するために、脳死誘導のマウスモデルを提示する。

While both living donation and donation after circulatory death provide alternative opportunities for organ transplantation, donation after donor brain ...

ドナーの脳死後の寄付は固形臓器移植の主な原因であるが、脳機能の不可逆的な喪失は全身的な炎症反応につながる病態生理学的変化を誘発する。脳死誘導のこのマウスモデルは、脳死調節の経路を研究するために、多種多様な分析ツールとノックアウトモデルを使用することを可能にする。ペダル反射反応の欠如を確認し、上腹部の毛髪を除去した後の動脈カテーテル法では、露出した皮膚を70%エタノールで消毒し、解剖ハサミを使用して皮膚に中線切開を行います。鉗子を使用して、鈍い下顎腺と首の筋肉組織を解剖し、一般的な頸動脈を露出させるために組織を分離する。3を置く 8-0右の共通頸動脈の下にシルク合字を配置し、近位合字にクランプを配置します。動脈に緊張をもたらし、流れが中断され、最も遠位の合字を閉じる。切開の頭蓋面に小さな整形皮膚穴を通して26ゲージ動脈カテーテルを挿入する。内腔が大きすぎて逆流を減らし、3つの縫合糸でカテーテルを固定する場合は、カテーテルを鉗子で絞り、次に5-0モノフィラメントを使用して、前形成された皮膚の穴の近くの皮膚にカテーテルを固定します。気管切開術を行うために、鉗子を使用して口管前の筋肉を解剖し、2つの8-0を置く気管の下の絹の合字。一方的な換気を避けるために2つの気管軟骨の間に換気チューブを挿入し、両方の準備された合字でチューブを固定し、6-0モノフィラメント非吸収性ランニング縫合糸で皮膚を閉じ、毎分150の周波数と200マイクロリットルの潮量でマウスを換気します。実験動物の脳死を誘発するには、マウスを起こしやすい位置に配置し、皮膚を鉗子で保持し、外科的はさみを使用して頭蓋骨から皮膚を取り除く。左頭頂皮質の上に1ミリメートル口径の穴の周りを掘削し、頭蓋骨の最終的な組織ブリッジを貫通するために鈍い鉗子を使用します。鋭いエッジを取り除いた後、すべての空気を避難させた生理焼け目であらかじめ充填されたバルーンカテーテルを挿入します。カテーテルが完全に頭蓋腔内にある場合は、注射器ポンプを使用して、10〜15分の期間にわたって1分間に約0.1ミリメートル/分でカテーテルを膨らませます。脳死が起こったら、バルーンカテーテルの膨張を止め、低体温症を避けるためにマウスの上に加熱毛布を置きます。脳死が確認された後、定期的に血圧を監視し、記録し、30分ごとに100マイクロリットルの生理食塩水を注入して動物の血圧を安定させる。脳死の4時間後、心臓を鼓動せずに動物を排除し、標準的なプロトコルに従って目的のマウスの器官および組織を収穫する。脳死誘導後、血圧は最初の高血圧のピークを示し、続いて長期の降圧相を示す。もう一つの確立された観察は、脳死誘導が免疫系の活性化につながるということです。実際、このモデルにおける脳死の4時間後、免疫マーカーの器官特異的なアップレギュレーションがmRNAレベルで観察される。脳死の事前定義された期間の後、臓器は、その直接分析のため、またはその後の臓器移植のために収穫され得る。このモデルは、脳死誘発傷害の影響に関する詳細な研究を可能にし、すでに補完活性化および白血球移動に関する新しい洞察を明らかにしている。

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神経科学

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マウスにおける急性肺障害を誘発するために圧力制御された換気

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周術期およびクリティカルケア関連の急性腎障害のための強力なモデルが提示される。それはほとんど臨床AKIの組織学的および機能的な変更を複製することが可能である心停止により誘発される全身の血流低下を使用する。...

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人工呼吸器マウスとラットの呼吸運動の3Dシネ磁気共鳴画像法

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