Name: クラミジア・トラコマティスにおけるフロキセカセットアレリック交換変異誘発によるマーカーレス遺伝子欠失 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-01-30T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 学ぶフロキセカセットアレリック交換変異誘発法によるChlamydia trachomatisのマーカーレス遺伝子欠失技術。隣接遺伝子への影響を最小限に抑えた標的欠失が可能で、細菌遺伝学研究に有用です。

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この研究は、国立衛生研究所(助成金A1065530とAl124649)からK.A.フィールズへの公衆衛生サービス助成金によって支えられていました。

1. 対象遺伝子に特異的な相同性アームを用いたpSUmC-4.0の設計と組立
<ol><li>同種組換えのための5'および3'相同性アームとして機能する欠失を目的とした遺伝子の上流および下流の~3kb領域を特定する(図1)。</li>
	<li>1)クラミジアゲノムDNAから3kb 5'ホモロジーアームを増幅し、2)Sall制限酵素部位で消化するとpSUmC-4.0に特異的な15~30 bpのオーバーハングを含むPCRプライマーを1)に設計します。pSUmC-4.0 と重なるプライマー領域の溶融温度が 55 °C、プライマー全体のヘアピン融解温度が <35 °C であることを確認します。</li>
	<li>1)クラミジアゲノムDNAから3kb 3'相同性アームを増幅するPCRプライマーを設計し、2)SbfI制限酵素部位で消化するとpSUmC-4.0に特異的な15~30 bpのオーバーハングを含む。pSUmC-4.0 と重なるプライマー領域の溶融温度が 55 °C、プライマー全体のヘアピン融解温度が <35 °C であることを確認します。</li>
	<li>DNAアセンブリ反応16の後にpSUmC-4.0ベクターへの各相同性アームの挿入を増幅するPCRスクリーニングプライマーを設計する。これらのプライマーを制限部位の外側にアニーリング〜500 bpに設計し、挿入が失敗した場合でもPCR産物を容易に可視化できるようにしました(図1)。</li>
	<li>PCRにより新たに抽出されたクラミジアゲノムDNAから3kb 5'および3'の相同性アームを1~2回の反応で増幅し、後のDNAアセンブリに十分な断片を生成します。特定の反応セットアップとサイクリング条件については、DNAポリメラーゼメーカーのプロトコルに従ってください。</li>
	<li>両方の PCR 産物のサイズが正しいこと、および反応に汚染バンドが含まれていないことを確認します。1%のDNAアガロースゲルで各PCR反応の5μLを実行します。</li>
	<li>フェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿によりPCR断片を精製し濃縮します。<ol>
<li>1.5 mLチューブで3'PCR反応をすべてプールし、ヌクレアーゼフリーのH2Oで最終体積200μLに持ち込み、5'PCR反応のためにこのプロセスを繰り返します。</li>
		<li>30~60秒のチューブと渦に200μLのフェノールを加え、各チューブをマイクロ遠心分離機(21,000 x g)で室温(RT)で20分間回転させます。</li>
		<li>各チューブの水相最上層を新しい1.5mLチューブに移し、各チューブに3M酢酸ナトリウムの体積の10分の1を加え、次いでフリックして混ぜます。</li>
		<li>各チューブに100%エタノールの3巻を加え、混ぜ合わせます。両管を-80°Cで20分間インキュベートします。</li>
		<li>RTで5分間>21,000 x gで各チューブを紡いでDNAをペレット化します。</li>
		<li>70%エタノールの100μLでDNAペレットを洗浄します。RTで5分間>21,000 x gで各チューブを回転させます。</li>
		<li>100%エタノールの100μLで再びDNAペレットを洗浄します。RTで5分間>21,000で各チューブを回転させ、上清を捨てます。</li>
		<li>ペレットを完全に空気乾燥させ、その後、混合するためにフリックすることによってヌクレアーゼフリーのH2Oの12 μLでDNAを穏やかに再懸濁させます。</li>
	</ol></li>
	<li>製造のプロトコルに従って、Sallの1単位およびSbfIの1つの単位との20 μLの反応でpSUmC-4.0のベクトルの500 ngを消化する。約3時間または一晩反応をインキュベートして、ベクターの完全な消化を確実にする。</li>
	<li>フェノール/クロロホルム抽出とエタノール沈殿(ステップ1.7.1~1.7.9)により消化した骨格を精製し濃縮します。</li>
	<li>消化された pSUmC-4.0 ベクターと 5' および 3' の相同性アーム PCR 製品を、0.01 pMol pSUmC-4.0 ~ 0.09 pmol の各相同アームの比率で組み合わせます。製造のプロトコルに従ってDNAアセンブリ反応で断片を組み立てます。</li>
	<li>DNAアセンブリ反応の1 μLで電気管大腸菌の50μLを変換します。1プレートあたり150 μLを広げる100 μg/mLスペクチノマイシンを含むLB寒天プレートに、形質転換大腸菌をプレートします。プレートを37 °Cで一晩インキュベートします。</li>
	<li>翌日、蛍光上転向顕微鏡を用いて緑色および赤色蛍光のスクリーンコロニーをスクリーニングした。寒天板1個につき合計5~30個のコロニーが予想される。</li>
	<li>5~10個のコロニーを選び、100μg/mLのスペクチノマイシンを補充したLBブロス4mLを接種します。250rpmで振とうとともに一晩37°Cで培養物をインキュベートする。</li>
	<li>一晩の大腸菌培養物を用いて、小規模なDNA精製を行う。ヌクレアーゼフリーH2Oの50 μLでDNAを溶出させる。</li>
	<li>PCR スクリーニングプライマー(ステップ 1.4 で設計)を使用して各々の相同性アームをpSUmC-4.0ベクターに挿入し、各挿入を増幅します。DNAアセンブリが成功した場合、5'および3'アーム領域の両方の1%のDNAアガロースゲルで〜4kbのPCR産物を観察する必要があります。~1 kb の PCR 産物は、挿入の欠如を示します。 注: 二重フラグメントアセンブリ反応で相同性アームの挿入が失敗した場合は、2つのアセンブリリアクションを実行して、5'アーム、3'アームを個別に挿入します。5'アームで組み立てる前に、Sallだけでベクトルを消化し、SbfIでベクトルを消化して3'アームを組み立てます。</li>
	<li>変換ダム-/dcm-両方の相同性アームで組み立てられたpSUmc-4.0の200 ngを持つ有能な大腸菌。プレートあたり25 μLを広げる100 μg/mLスペクチノマイシンを含むLB寒天プレートに形質転換細菌をプレートします。プレートを37 °Cで一晩インキュベートします。合計20~200のコロニーが予想されます。</li>
	<li>ステップ 1.13 で説明したように、赤と緑の蛍光コロニーのプレートをスクリーニングします。</li>
	<li>赤と緑のコロニーを持つ100 μg/mLのスペクチノマイシンを含むLBスープ100mLを接種して、大規模なDNA精製のための培養液を設定します。250rpmで振とうして一晩37°Cで培養液をインキュベートする。</li>
	<li>大規模なDNA精製を用いて培養を収穫し、DNAを精製する。<ol>
<li>精製したプラスミドDNAをNF-H2Oの100μLに再懸濁する。少なくとも2μg/μLの全DNA収率は、C.トラコマティス変換に最適です。</li>
		<li>C. トラコマティスを変換する前に、5' および 3' の相同性アーム領域をシーケンスして正しいアセンブリを pSUmC-4.0 に変換します。</li>
	</ol></li>
</ol>2. pSUmC 4.0 + アレリック交換による遺伝子欠失のための相同性アームズによるC.トラコマティスの変態
<ol><li>種子マッコイ細胞は、クラミジアを培養するために標準的に使用されるマウス線維芽細胞を、成長培地#1を用いて2つの6ウェルプレート(1 x 106細胞/ウェル)にする。単層がコンフルエントになるまで5%のCO2で37°Cでプレートをインキュベートします(約24時間)。</li>
	<li>1.5 mLチューブで、2のMOIで6ウェルプレートの12ウェルに感染するのに十分であるC.トラコマティスWTセロバーL2素体(EB)の体積を追加します。30 分の 20,000 x gで EJB をペレットし、上清を破棄します。</li>
	<li>CaCl2バッファーの600μLでEJBを静かに再サスペンディングし、24 μgのpSUmC-4.0 + 相同性アームをチューブに加えてクラミジア変換を開始します。フリックして溶液をそっと混ぜます。RTforでチューブを30分でインキュベートし、10分ごとに混ぜるようにフリックします。</li>
	<li>ハンクスのバランスの取れた塩溶液(HBSS)の24 mLに変換液を加え、穏やかにピペッティングして混合します。接種の2 mLを6つのウェルプレートの各ウェルにコンフルエントマッコイ細胞の各ウェルに移し、20°Cで1時間900xgで遠心分離によって感染する。 </li>
	<li>接種を取り外し、2 mL/well RPMI成長メディア#2に置き換えます。プレートを5%CO2で37°Cでインキュベートします。</li>
	<li>7 時間以上を経過しても 12 時間を超え、メディアを選択メディア #1の 2 mL/ウェルに置き換えます。感染時から48時間、37°Cでインキュベーションを続ける。</li>
	<li>収穫し、マッコイ細胞の新鮮な単一層に細菌を通過します。<ol>
<li>セルスクレーパーを使用して、マッコイ単層をそっと削り取り、細胞をメディアに持ち上げます。各ウェルから2 mLチューブに材料を移します。4 °Cで30分間の微小遠心分離機で、細胞材料を20,000 x gでペレット化します。</li>
		<li>上清を取り除き、廃棄します。穏やかにピペッティングして、1 mLのHBSSで細胞ペレットを再懸濁する。</li>
		<li>細胞の破片を4°Cで5分間200 x gでペレット化する。上清をコンフルエントマッコイ細胞の新鮮な井戸に移します。2 mL/ウェルの総体積に対して、各ウェルに1 mLのHBSSを追加します。</li>
		<li>20°Cで1時間900xgで遠心分離により感染する。感染直後の#1、接種を選択媒体に置き換えます。</li>
	</ol></li>
	<li>赤と緑の含まれていることが感染後24時間の上蛍光顕微鏡(24hpi)を使用して検出されるまで、3つ以上の通路のためにマッコイ細胞の新鮮な単層(セクション2.7)に細菌を受け継ぎ続けます。</li>
	<li>赤と緑の含まれていることが検出されたら、選択メディア#2を使用して単層(セクション2.7)を通過し続けます。</li>
	<li>緑色のみの含まれる物が検出されるまで単層を通過し続ける 24 hpi (通過#3以降) これは、pSUmC-4.0ベクターの損失と、ゲノム中へのloxP選択カセットの取り込みを示す。</li>
	<li>パスエイジングによって豊かにする緑のみのインクルージョンの1つの井戸を選択してください。収穫し、また、スクロース- リン酸グルタミン酸バッファー (SPG) に緑のみの含む含む含むを含む他の井戸を凍結します。<ol>
<li>緑のみの含まれる物を濃縮するには、ステップ2.7で行われた6ウェルプレートの1つのウェルから単層を通過させますが、細胞の破片をペレット化した後(ステップ2.7.3)、上清を12 mLのHBSSで円錐状に移します。この接種を使用して、ウェルあたり2 mLを加えて2つの6ウェルプレートに感染させ、20°Cで60分間900 x gでプレートを回転させます。</li>
		<li>追加の井戸を凍結するには、ステップ2.7.1のように単層を収穫しますが、HBSSの代わりにSPGの1 mLでペレットを再懸濁します。細胞の破片(ステップ2.7.3)をペレットし、上清を1.5mLのクライオチューブに移します。材料を-80°Cで凍結します。</li>
	</ol></li>
	<li>緑のみのインクルージョンを 0.5 ~ 1.0 (検出後に 1 ~ 2 箇所) に濃縮した後、ステップ 2.11.2 で説明されているように、単層を SPG に収穫します。1.5 mLのチューブで50μLのアリコートを取得し、-80°Cで凍結します。</li>
	<li>標準滴定プロトコル17に従って、封入、形成単位/μLを決定するティターグリーンのみの細菌。</li>
</ol>3. 限定希釈によるloxPフランクセレクションカセットを含む緑のみのC.トラコマティス欠失変異のクローナル分離
<ol><li>成長培地#1に、McCoy細胞50μL~2,000個の細胞/井戸を用いて384ウェル組織培養プレートを播種します。〜24時間またはコンフルエントまで5%のCO2で37°Cでインキュベートします。</li>
	<li>HBSSで緑のみの細菌のアリコートを希釈して、20mLあたり50個のEBを達成します。希釈した接種を貯水トレイに移します。<ol>
<li>プレート全体を廃棄物容器にしっかりと向けてフリックして、384ウェルプレートからメディアを取り出します。マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに50μLのC.トラコマチス接種を加えます。20°Cで1時間900xgで遠心分離により感染する。 メモ:単層が取り外されるほど強くフリックしないように注意してください。細胞が過剰にコンフルエントであれば、より簡単に切り離されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>フリックで接種を取り外し、50 μL/ウェル成長メディア#2で交換します。5%CO2で 37 °C でプレートをインキュベートします。 注:この段階では、ゲノムへの選択カセットの統合は安定しているので、スペクチノマイシンを用いた抗生物質の選択は不要になりました。</li>
	<li>プレートを5~12日間インキュベートした後、蛍光の反転顕微鏡または高含量スクリーニングプラットフォームを使用して、緑色蛍光包接物を用いて個々のウェルを同定します。</li>
	<li>p-10チップで単層を削り、井戸の内容物全体を2 mLのHBSSを含むチューブに移すことによって、緑色のみのインクルージョンで井戸を収穫します。2 mLの接種を穏やかに混ぜ合わせ、感染用の6ウェルプレートの新鮮なコンフルエントマッコイ単層に塗布します。 注: 包含を持つ個々のウェルを識別する場合、最初の包含からの拡張により、包含がクラスター内に含まれます。ウェルに複数のクラスターがある場合、複数の EB が最初にこの井戸に感染した可能性があります。これらの井戸は収穫されるべきではなく、場合によっては、連続希釈によるクローン分離の複数のラウンドが必要な場合があります。</li>
	<li>20°Cで1時間900xgで遠心分離することにより6ウェルプレートに感染する。接種を2 mL/ウェル成長メディア#2に交換します。48時間5%のCO2で37°Cでインキュベート。</li>
	<li>手順 2.11 ~ 2.13 を繰り返して、クローンの集団を強化、フリーズ、および強化します。</li>
	<li>先に説明したように、qPCRを用いてクローン分離されたC.トラコマティスから標的遺伝子の欠失を確認する。</li>
</ol>4. pSU-Creを用いたC.トラコマティスFRAEM変異体の変換により、loxPフランクセレクションカセットの除去を開始
<ol><li>前に説明した 6 ウェルプレート(ステップ 2.1~2.8)で、クローン分離されたC.トラコマティスFRAEM変異体、pSU-Cre ベクター、選択メディア#3を使用して、変換プロセスを繰り返します。 注: 正常な変換は、赤と緑の蛍光を含めることによって示されます。<ol>
<li>赤のみのインクルージョンが検出されるまで単層を通行するには、蛍光上転覆顕微鏡を用いて、選択カセット(2〜3本の通路)の喪失を示す。赤のみの包含が~0.5のMOIに富むまで、単層の通過を続けます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>前に説明した 384 ウェルプレートの希釈を制限することにより、赤のみのインクルージョンを限定します(ステップ 3.1~3.8)。ただし、すべてのステップに対して選択メディア #3を使用してください。</li>
	<li>MOI 0.1まで通過することによってクローン集団を豊かにする。一旦濃縮されたら、pSU-Creベクター(約3〜4節)の損失を開始するために、#2成長培地でセクションメディアを交換します。</li>
	<li>非蛍光菌をクローン分離する(ステップ3.1~3.8);ただし、明視野顕微鏡でプレートを手動でスキャンして、インクルージョンを検出します。細菌を濃縮し、凍結する(ステップ2.11–2.12)。</li>
	<li>定量的リアルタイムPCRを用いた変異株のスクリーン、ウェスタンブロッティング、および全ゲノムDNAシーケンシング(12)。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは開示する利益相反はない。

FLAEMによるC.トラコマティスにおけるマーカーレス遺伝子欠失の発生に関してここで説明するプロトコルは、非必須遺伝子の標的欠失を可能にし、カセット誘発性極性作用を排除する。このプロトコルは、pSUmC 4.0自殺ベクターに挿入された5'および3'の相同性アームの慎重な設計、C.トラコマティスの効率的な変換、および分離された変異株の慎重なスクリーニングに依存する。この方法によるゲノム解析が成功すると、非蛍光性の細菌が、標的遺伝子欠失部位に単一のloxP瘢痕配列を含む。さらに、この方法は、同じC.トラコマティス株内の遺伝子の逐次標的化に適応される可能性を有する。
5' と 3' の相同性の腕と自殺のベクトルへの挿入の慎重な設計はクローニングプロセスの最初の、最も重大なステップである。3 kb の相同性アームが最も効率的なアレルの組換えを提供することが分かってきました。これらの武器の挿入は、大きく、時には作業が困難なベクトルを生成しますが、より短い腕で成功が少なく、成功のための最小値を表す〜2 kbです。Sallお...

クラミジア・トラコマティスは、細菌性感染症の主な原因であり、人間の健康に大きな負担を表しています。毎年1億人以上の人々がC.トラコマティス1に感染しています。女性の感染の約70%は、骨盤炎症性疾患、子宮外妊娠、および/または不妊症などの有害な生殖健康への影響にもかかわらず、無症候性である。病気の後遺症は、C.トラコマティス感染によって開始される免疫病理学に直接関連している2.効力のあるワクチンはまだ開発されていません。したがって、細菌の病原性因子および他の細菌遺伝子産物の機能を理解することは、重要かつ緊急の研究課題である。
細胞内細菌として、宿主細胞の侵入、細胞内複製、子孫の放出、および宿主免疫応答の回避は重要なプロセスである。C.トラコマティスは、細胞内発達のために、インクルージョンと呼ぶ、寄生虫膜結合液胞を形成する。この包接および他の多くの重要なプロセスの確立は、III型分泌システム(T3SS)3を介したエフェクタータンパク質の分泌によって達成される。これらの分泌されたエフェクターの機能を解明することは、C.トラコマティスの遺伝的難治性のために長年にわたって制限されていた。大腸菌とは異なり、クラミジアには多くの古典的なクローニング技術は適用されません。いくつかの大きな制限は、変換効率、sacBなどのカウンターセレクションレポーターの欠如、プラスミドのメンテナンスを含みます。大腸菌プラスミドは、一般に複製の起源および適切な選択圧力を有して無期限に維持することができるが、C.トラコマティスプラスミドは、L2セロバー4内の天然pL2プラスミド上に見られる維持のために追加の8つのオープンリーディングフレーム(pgp1-8)を必要とする。
近年、クラミジアのユニークな生物学に対応する複数の遺伝的ツールが生成されていますが、まだ限界5、6、7があります。エチルメタンスルホン酸(EMS)治療による化学変異は、ミスセンス突然変異を導入することができ、または(より少ない頻度で)ヌクレオチド遷移を生じ、ナンセンス突然変異を生じさせる早期停止コドンを導入し得る。トランスポゾン挿入は遺伝子破壊に有効ですが、クラミジアの研究における現在の技術は手間がかかり、時間がかかる9.EMS治療とトランスポゾン変異発生法の両方がランダムな突然変異を生成し、変異株を分離するために厳格なスクリーニング方法を必要とします。グループIIイントロンの挿入によって遺伝子を破壊する方法(例えば、TargeTron)は、指示された変異発生を可能にする。ただし、この方法は効率によって制限され、挿入部位が常に適切に予測されるわけではありません。
蛍光報告された対立遺伝子交換(FRAEM)は、抗生物質耐性および蛍光レポーター11を提供する選択カセットの挿入と相まって標的遺伝子欠失に使用される戦略である。しかし、FRAEMは、特にポリシストロニックオペロン内の遺伝子を標的とする場合、カセット誘発性の極性作用が下流遺伝子に及ぼす可能性によって複雑化する。フロキスカセットアレリック交換変異型(FLAEM)は、FRAEM選択カセット12で以前に観察されたカセット誘発性極性作用を緩和するために開発された新しい遺伝的アプローチである。FLAEMは、Cre-loxPゲノム編集を利用して、選択カセットを除去し、下流遺伝子の発現を回復させます。抗生物質耐性および緑色蛍光タンパク質(GFP)を含む選択カセットは、横並びのloxP部位で再設計される。これらのloxP部位は、Cre recombinaseの存在下で再結合し、ゲノム13からのカセットの切除をもたらす。この戦略は、欠失12、14のためにtmeAを標的とする場合のカセット誘導極性の影響を緩和することが示されている。
FRAEM法およびFLAEM法は、pgp6の誘導式を通じて条件付きで維持することができる同じ自殺ベクトルpSUmC 4.0を利用する。pgp6の発現は、プラスミド保持に必要であることが以前に示されており、したがってプラスミド維持11、15を制御するために活用される。C.トラコマティスが無水テトラサイクリン(aTc)を加えた培地で増殖してpgp6発現を誘導すると、ベクターは維持される。aTc がない場合、ベクトルは失われます。標的遺伝子欠失は、選択カセットに対する遺伝子の対立遺伝子交換を通じて達成される。標的遺伝子の上流と下流の3kb領域は、組換えのための相同性アームとして機能する。これらの腕は選択カセットに隣接するpSUmC 4.0ベクトルにクローン化される。C.トラコマティス変換と再結合事象の成功は、蛍光報告によって観察される。ベクターバックボーン上のmCherryの発現と選択カセット内のgfpの生成赤と緑の蛍光包括体。培養培地からaTcが除去されると、グリーンのみのインクルージョンは、自殺ベクターの喪失と細菌ゲノムへの選択カセットの統合との正常な組み換え事象を示す。
FLAEMは、新たに作成された変異株へのCreリコンビナーゼ発現ベクターpSU-Creのその後の変換を介してFRAEMの延長を表す。Cre recombinaseは、loxP部位と選択カセットの切除との再結合を容易にする。再結合事象は、蛍光報告を介して示される。pSU-Cre ベクトルはmCherryをコードします。したがって、正常な変換は、gfp-発現インクルージョンに赤蛍光を加えることによって示される。カセットに対する選択的圧力がない場合の培養は、loxP部位でのCre媒介的再結合をもたらし、かつカセットの損失は、赤色のみの含有物によって示される。pSUmC-4.0 と同様に、pGP6の誘導式は条件付きで pSU-Cre を維持するために使用されます。aTcおよび抗生物質の選択が除去されると、プラスミドは硬化し、結果として生じるマーカーレス欠失株は非蛍光である。この方法はカセット誘発性極性効果の問題に取り組む。

<table><tbody><tr><td>アガロース</td><td>KSE サイエンティフィック</td><td>BMK-A1705</td><td>分子生物学グレード</td></tr><tr><td>アンヒドロテトラサイクリン塩酸塩</td><td>ACROS 有機物</td><td>233131000</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 バッファー</td><td></td><td></td><td>10 mM トリス pH 7.4、50 mM 塩化カルシウム二水和物</td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>シグマ</td><td>C7902-500G</td><td>細胞培養に適しています</td></tr><tr><td>シクロヘキシミド</td><td>Sigma</td><td>7698-1G</td><td></td></tr><tr><td>dam-/dcm- 有能な E. coli</td><td>New England BioLabs</td><td>C2925H</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>ATCC</td><td>4-X</td><td>滅菌ろ過細胞培養試験</td></tr><tr><td>済み グルタミン酸</td><td></td><td>Sigma G8415-100G</td><td>L-グルタミン酸</td></tr><tr><td>増殖培地 #1</td><td></td><td></td><td>RPMI 1640培地に10 %(vol/vol)の熱不活化ウシ胎児血清(FBS)を添加しました。</td></tr><tr><td>Growth Media #2</td><td></td><td></td><td>RPMI 1640培地に10 % (vol/vol) の熱不活化ウシ胎児血清 (FBS) と 1 & micro;g/mL シクロヘキシミド</td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液 (HBSS) (1x)</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>熱不活化ウシ胎児血清 Qualified One Shot (FBS)</td><td>Gibco</td><td>A38402-02</td><td></td></tr><tr><td>McCoy Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-1696</td><td></td></tr><tr><td>Monarch Plasmid Miniprep Kit</td><td>New England BioLabs</td><td>T1010S</td><td>Small scale DNA purification</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S3139-250G</td><td>リン酸ナトリウム 一塩</td></tr>基性 <tr><td>Na2HPO4Sigma</td><td></td> <td>S5136-500G</td><td>リン酸二塩基性</td></tr><tr><td>ナトリウム NEB 10-β エレクトロコンピテント E. coli 細胞</td><td>ニューイングランド BioLabs</td><td>C3020K</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA アセンブリ クローニングキット</td><td>NewEngland BioLabs</td><td>E5520S</td><td>Gibson Assembly Kit</td></tr><tr><td>Penicillin G ナトリウム塩</td><td>Sigma</td><td>P3032-10MU</td><td>細胞培養に適したバイオ試薬</td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12162</td><td>大規模 DNA 精製</td></tr><tr><td>Q5 ホットスタート High-Fidelity DNA ポリメラーゼ</td><td>New England BioLabs</td><td>M0515</td><td>フラグメント PCR ポリメラーゼ</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培地 (1x)</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td>2mM L-グルタミンを含む</td></tr><tr><td>Sall-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3138S</td><td></td></tr><tr><td>Sbfl-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3642S</td><td></td></tr><tr><td>Selection Media #1</td><td></td><td></td><td>RMPI 10 % FBS, 1 & micro;g/mL シクロヘキシミド、500 &micro;g/mL スペクチノマイシン、および 50 ng/mL 無水テトラサイクリンを DMSO</td></tr><tr><td>選択培地 #2</td><td></td><td></td><td>RMPI 10 % FBS, 1 & micro に溶解;g/mL シクロヘキシミド、500 &micro;g/mL スペクチノマイシン</td></tr><tr><td>選択培地 #3</td><td></td><td></td><td>RPMI 10 % FBS, 1 &micro;g/mL シクロヘキシミド、50 ng/mL aTc、および 0.6 &micro;g/mL ペニシリン</td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム緩衝液</td><td>シグマ</td><td>S7899-100ML</td><td>3M</td></tr><tr><td>SOC 成長培地</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>B9020SVIAL</td><td></td></tr><tr><td>スペクチノマイシン二塩酸塩五水和物、細胞培養グレード</td><td>アルファ エーザー</td><td>J61820</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>シグマ</td><td>S1888-1KG</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>に適したバイオ試薬スクロース-リン酸-グルタミン酸緩衝液 (SPG)</td><td></td><td></td><td>スクロース37.5g、Na2HPO4、0.18 g NaH2PO4、0.36 glutamic 酸、500 ml 組織培養グレードの水</td></tr><tr><td>Tris</td><td>AMRESCO</td><td>0497-5KG</td><td>超高純度グレード</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (1x)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>0.25%</td></tr><tr><td>ウォーター</td><td>シグマ</td><td>W3500-500ML</td><td>無菌ろ過、BioReagent、細胞培養に適しています</td></tr></tbody></table>

クラミジア・トラコマティスにおけるフロキセカセットアレリック交換変異誘発によるマーカーレス遺伝子欠失

Markerless Gene Deletion by Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

クラミジア・トラコマティスは、歴史的に遺伝的に操作することが困難であった細胞内病原体である。C.トラコマティスが特権的な細胞内ニッチを作成し維持するために使用するメカニズムを解明する上で決定的な進歩は、遺伝的ツールの欠如のために限られている。幸いなことに、最近、遺伝子操作技術のいくつかの新しい進歩がありました。これらの中には、蛍光報告されたアレリック交換変異誘発(FRAEM)の開発がある。この方法は、抗生物質耐性と緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードするセレクションカセットの挿入と結合した標的遺伝子欠失を可能にする。下流の遺伝子に対する極性作用の可能性があるため、ポリシストロニックオペロン内の遺伝子を標的とする場合、この戦略への依存は複雑になる可能性があります。フロクサセットアレリック交換変異型(FLAEM)は、ここで説明するプロトコルを、カセット誘発極性の影響を緩和するために開発された。FLAEMは、アレリック交換による標的欠失後の選択カセットを除去するためにCre-loxPゲノム編集を利用する。得られた株は、1つ以上のコード配列のマーカーレス遺伝子欠失を含む。この技術は、遺伝子機能の直接評価を容易にし、C.トラコマティスにおける遺伝子操作のためのツールのレパートリーを拡大する。

FLAEMを用いたC.トラコマティスにおけるマーカーレス遺伝子欠失の方法は、慎重なクローニングおよび形質転換技術に依存する。成功したアレル酸再結合は、重要な第一歩であり、pSUmC-4.0クローニングベクターへの相同性アームの同定と挿入を必要とします(図1)。マーカーレス遺伝子欠失のための必須の第2のステップは、Cre-loxゲノム編集による蛍光レポーターおよび抗生物質選択カセットの除去であり、図2に表される。これらの各手順を実行するために使用するベクトルは、図 3に示されています。図4は、野生型C.トラコマティスで始まる時にマーカーレス欠失変異体を生成する変換戦略の概略図を示す。
代表的なデータは、tmeAが遺伝子欠失を目的とする図5</strong...

ここで説明する、フラミジア・トラコマティスにおける標的化されたマーカーレス遺伝子欠失の方法であり、フロキサセット対立遺伝子交換変異誘発、FLAEMを用いた。

Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular pathogen that has been historically difficult to genetically manipulate. Definitive progress in ...

凝集カセットのアレリック交換変異誘発は、遺伝子欠失が遺伝子産物の機能を理解するために利用できる貴重なツールであるため、重要な方法です。この技術の主な利点は、下流の遺伝子に極性効果を与えることなく標的遺伝子欠失を可能にすることです。5つの素数および3つの相同性組換え用の主要相同性アームとして機能する欠失をターゲットとする遺伝子の約3キロベース領域を直接上流および下流に特定し、テキストプロトコルに示すようにプライマーを割り当てます。1つまたは2つの反応で、抽出したばかりのクラミジアゲノムDNAから3キロベース5素数および3つのプライムホモロジーアームを増幅し、後のDNAアセンブリに十分な断片を生成します。テキストプロトコルに記載されているPCR断片を精製し濃縮した後、製造業者のプロトコルに従って1つのセル1単位とSBF1単位の20マイクロリットル反応で500ナノグラムのpSUmC-4.0ベクターを消化する。消化および精製されたpSUmC-4.0ベクターと5つの素数および3つの主要相同性アームPCR産物を、各ホモロジーアームの0.01ピコモールベクターと0.09ピコモールの比で組み合わせます。メーカーのプロトコルに従ってDNAアセンブリ反応で断片を組み立てます。DNAアセンブリ反応の1マイクロリットルで50マイクロリットルの電気コンビニテント大腸菌を変換します。変換された大腸菌を1ミリリットルスペクトルマイシンあたり100マイクログラムを含むLB寒天プレートにプレートします。一晩で摂氏37度でプレートをインキュベートします。翌日、蛍光反転顕微鏡を用いた緑色および赤色蛍光のコロニーをスクリーニングする。寒天プレートあたり合計5〜30コロニーが期待されています。選択したコロニーの一晩の液体培養インキュベーションに続いて、各挿入を増幅するPCRスクリーニングプライマーを用いてベクターに各相同性アームの挿入を確認する。種子マッコイ細胞は、典型的には、テキストプロトコルに記載されているように2つの6ウェルプレートにクラミジアを培養するために使用されるマウス線維芽細胞である。1.5ミリリットルチューブに、C.トラコマティス野生型血清膜L2素体、または2のMOIで6ウェルプレートの12の井戸に感染するのに十分な量で、EBを追加します。20,000グラムを超えるべきエブを30分間ペレットし、上清を捨てます。600マイクロリットルの塩化カルシウムバッファーで、EB を穏やかに再懸濁させることによりクラミジア変換を開始します。次に、12マイクログラムのpSUmC-4.0と相同性アームをチューブに加え、フリックして溶液を軽く混ぜます。10分ごとに混合するためにフリック30分間室温でチューブをインキュベートします。24ミリリットルのHBSSに変換液を加え、穏やかにピペットで混ぜます。6ウ

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

既製のアクセプター株、と呼ばれる着陸パッド株に興味のある外来DNAを統合するための迅速かつ効率的な方法が記載されている。メソッドは、ΦC31インテグラーゼの結合と表現を通して、与えられた菌株の人工着陸パッドの座にDNAカセットの部位特異的に統合することができます。...

サイト固有の細菌染色体工学：ΦC31インテグラーゼを介したカセット取引所（IMCE）

体系的、大規模合成遺伝子（遺伝子遺伝子またはエピスタシス）対話画面が遺伝的冗長性と経路のクロストークを探索するために使用することができます。ここで、我々は上位性の関係を解明するとの遺伝的相互作用ネットワークを探索するために開発されeSGAと呼ばれるハイスループット定量合成遺伝子配列のスクリーニング技術を記述...

細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング<em&gt;大腸菌</em&gt;合成遺伝子配列を用いて

Source: Saragliadis, A., et al. Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the phage-mediated transfer of donor DNA carrying an excisable antibiotic resistance cassette into Escherichia coli. The integrated cassette replaces the target gene via homologous recombination, resulting in a stable gene deletion.

Generating Gene Deletions in E. coli via Phage-Mediated Transfer of an Excisable Antibiotic Cassette

我々は、化学変異誘発および全ゲノムシーケンシングに基づいてクラミジアの遺伝的分析を実行する方法を説明します。さらに、感染細胞内のDNA交換のためのシステムは、遺伝子マッピングのために使用することができることについて説明する。この方法は、変換システムおよび分子遺伝学的ツールを欠く微生物システムに広く適用することができる。...

フォワード遺伝的アプローチで<em&gt;クラミジアトラコマチス</em

ここで他の大腸菌の欠失変異株を作るための基盤として、既存の抗生物質抵抗カセット削除構造の使用のためのプロトコルを提案する.このような欠失変異体を動員し、P1...

物品税課税対象の抗生物質耐性カセット P1 伝達による大腸菌の遺伝子の削除を生産

細菌病原体は、重要な生物学的プロセスを標的とする宿主にタンパク質を分泌する。細菌エフェクタータンパク質を標的とする宿主経路を同定することは、分子病因に対処する鍵となる。ここで、毒性細菌エフェクタータンパク質を標的とする宿主経路を解明するために改変酵母サプレッサーおよび毒性スクリーンを用いる方法について説明する。...

酵母毒性およびサプレッサースクリーンを用いた細菌エフェクタータンパク質を標的とする宿主経路の同定

クラミジア・トラコマティスにおける発生変異体の同定と分離に対する生細胞前方遺伝的アプローチ

ここでは、特定の糖転移酵素または糖転移酵素を含む領域における アエロモナ...

細菌の運動性における細菌の糖転移酵素の役割を解明するためのヌル変異体の生成

オリゴヌクレオチドは、特に両方でトランスフェクトされた標的遺伝子の一塩基の置換サイトに使用することができます...

ロックされた核酸修飾オリゴヌクレオチドによるトランスフェクションおよび蚊細胞における標的遺伝子の変異

骨髄移植は、骨髄由来細胞の遺伝子型を変更する方法を提供します。目的の遺伝子が骨髄由来細胞と非骨髄由来細胞の両方で発現されている場合は、骨髄移植では、非骨髄由来細胞の遺伝子型を変更することなく、異なる遺伝子型に骨髄由来細胞を変更することができます。...

骨髄移植によるマウス大腸炎における免疫および非免疫細胞からの遺伝子発現の機能的役割を差別化

学ぶフロキセカセットアレリック交換変異誘発法によるChlamydia trachomatisのマーカーレス遺伝子欠失技術。隣接遺伝子への影響を最小限に抑えた標的欠失が可能で、細菌遺伝学研究に有用です。

クラミジア・トラコマティスにおけるフロキセカセットアレリック交換変異誘発によるマーカーレス遺伝子欠失

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