Name: 無標的液体クロマトグラフィー-質量分析法ベースの小麦粒のメタボロミクス分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 10 s
Description: 学ぼう、小麦粒のメタボロミクス分析における無標的液体クロマトグラフィー-質量分析法の応用。第三の移動相を導入することで、より広範囲の代謝物を検出し、遺伝的・環境的・管理要因の相互作用を理解して収量と品質を予測する手法を解説します。

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著者らは、西オーストラリア州首相の農業・食糧フェローシップ・プログラム(西オーストラリア州政府の雇用・観光・科学・イノベーション省)とサイモン・クック教授(センター)を認めたい。デジタル農業、カーティン大学、マードック大学)。フィールドトライアルと穀物サンプルコレクションは、西オーストラリア州の地域ロイヤリティプログラムの政府によって支援されました。グラントリー・ステイナーとロバート・フレンチがフィールドトライアルに貢献したのを認めます。NCRISが出資するバイオプラットフォームオーストラリアは、機器の資金調達で認められています。

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<li>Francki, M. G., Hayton, S., Gummer, J. P. A., Rawlinson, C., Trengove, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+profiling+and+genomic+analysis+of+wheat+aneuploid+lines+to+identify+genes+controlling+biochemical+pathways+in+mature+grain%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Metabolomic profiling and genomic analysis of wheat aneuploid lines to identify genes controlling biochemical pathways in mature grain.</a> Plant Biotechnology Journal. 14 (2), 649-660 (2016).</li>
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<li>Broadhurst, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+and+considerations+for+the+use+of+system+suitability+and+quality+control+samples+in+mass+spectrometry+assays+applied+in+untargeted+clinical+metabolomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Guidelines and considerations for the use of system suitability and quality control samples in mass spectrometry assays applied in untargeted clinical metabolomic studies.</a> Metabolomics. 14 (6), 72(2018).</li>
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<li>Shahaf, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+WEIZMASS+spectral+library+for+high-confidence+metabolite+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The WEIZMASS spectral library for high-confidence metabolite identification.</a> Nature Communications. 7 (1), 12423(2016).</li>
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著者らは開示するものは何もない。

ここでは、小麦の分析のためのLC-MSベースの非標的メタボロミクス法を紹介する。この方法は、逆相勾配に第3移動相を導入することにより、4つの取得モード(逆相および脂質アメ有効逆相と正イオン化と正負イオン化を伴う)を2つのモードに組み合わせたものです。組み合わせアプローチは、イオン極性あたり約500の生物学的関連特徴を生み出し、その約半分は小麦品種間の強度が有意に異なった。異なる小麦品種の穀物中の代謝産物濃度の有意な変化は、変化した生化学を示し、これは穀物の品質および収量にとって重要な疾患耐性、ストレス耐性および他の表向きの形質に関連している可能性がある。例えば、メタボロミクスのアプローチは、新たな防御機構12を記述し、干ばつ許容度13における代謝産物の役割を提案するために用いられてきた。このプロトコルの将来の応用は、特定の環境および管理の実践のために望ましい遺伝的形質に特定の品種の生化学的プロファイルをさらにリンクすることができるかもしれない。これにより、選択した遺伝子型に最適な粒度と収率が得られます。
<p class="jove_...

農業における遺伝子、環境、管理慣行の相互作用を理解することで、製品の収量と品質をより正確に予測し、管理することができます。植物代謝物は、ゲノム、環境(気候、降雨など)などの要因の影響を受け、農業環境では作物の管理方法(肥料の適用、殺菌剤など)が影響を受けます。ゲノムとは異なり、メタボロームはこれらの要因の影響を受けるため、メタボロミクスデータは特定の時点でこれらの相互作用の生化学的指紋を提供する。メタボロミクスベースの研究には通常、生物の生化学の深い理解を達成し、生理学に関連して摂動(非生物的または生物的ストレス)への応答メカニズムを説明するのを助けるという2つの目標のうちの1つがあります。そして第二に、バイオマーカーを研究中の摂動と関連付ける。どちらの場合も、この知識を持つことの結果は、歩留まりのサイズと品質を向上させるという目標を達成するためのより正確な管理戦略です。
植物のメタボロムは、様々な物理化学的特性を有する数千1個の小分子を含むと予測されている。現在、メタボロミクスプラットフォーム(主に質量分析と核磁気共鳴分光法)は、単一の分析でメタボローム全体を捕捉することはできません。メタボロミクス研究者にとって、メタボロムの可能な範囲を可能な限り多く提供するこのような技術(サンプル調製、代謝産物抽出および分析)の開発は、メタボロミクス研究者にとって重要な目的です。小麦粒の以前のターゲットを持っていないメタボロミクス分析は、複数のクロマトグラフィー分離と取得極性および/またはインストゥルメンテーションからのデータを組み合わせて、より大きなメタボロームカバレッジを実現しました。しかし、これは、各モダリティのために別々に調製し、取得するサンプルを必要としました。例えば、ベレグギアら2は、非極性分析体のGC-MS分析に加えて、極性分析体のGC-MS分析のための誘導体化サンプルを調製した。Dasら 3は、分析のカバレッジを改善するために GC-と LC-MS の両方の方法を使用しました;ただし、この方法では、一般に、上記のサンプル準備と 2 つの独立した分析プラットフォームが必要になります。GC-MS5 2、3、43および4LC-MS3を用いた小麦穀物の以前の分析は、GC-MSの50〜412(同定された55)機能、GC-MSおよびLC-MSを組み合わせた409、LC-MS脂質分析5のための数千の機能をもたらした。2少なくとも2つのモードを1つの分析に組み合わせることで、拡張されたメタボロームカバレッジを維持することができ、生物学的解釈の豊かさを高める一方で、時間とコストの両方で節約を提供します。
逆相クロマトグラフィーによる広範な脂質種の効率的な分離を可能にするために、現代のリピドミクス方法論は、溶出溶媒6中のイソプロパノールの高い割合を一般的に使用し、クロマトグラフィーによって解決されない可能性のある脂質クラスに無変性を提供する。効率的な脂質分離のために、開始移動相はまた、分子の他のクラスを考慮する典型的な逆相クロマトグラフィー法よりも有機組成物7においてはるかに高い。勾配の開始時の高い有機組成物は、これらの方法を分子の他の多くのクラスにあまり適さない。最も顕著なのは、逆相液体クロマトグラフィーは、二分溶媒勾配を採用し、クロマトグラフィーの溶出強度が増加するにつれて、ほとんど水性組成から始まり、有機含有量が増加する。この目的のために、我々は、単一の分析内で代謝産物の脂質と非脂質クラスの両方の分離を達成するために、2つのアプローチを組み合わせることを目指した。
ここでは、第3移動相を用いたクロマトグラフィー法を紹介し、単一サンプル調製物と1つの分析カラムを用いた従来の逆転相とリピドミクスに適したクロマトグラフィー法を組み合わせることを可能にする。我々は、これまで主に臨床メタボロミクス研究で実施された品質管理措置およびデータフィルタリングステップの多くを採用してきました。これらのアプローチは、高い技術的再現性と生物学的関連性を持つ堅牢な特徴を決定するのに有用であり、これらの基準を満たしていないものを除外します。例えば、我々は、プールされたQCサンプル8、QC補正9、データフィルタリング9、10の10反復分析と欠損特徴11の偽装について説明する。9

<table><tbody><tr><td>13C6-ソルビトール</td><td>メルク Sigma-Aldrich</td><td>605514</td><td></td></tr><tr><td>2-アミノアントラセン</td><td>メルク Sigma-Aldrich</td><td>A38800-1 g</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>FSBA955-4</td><td>Optima LC-MS グレード</td></tr><tr><td>ギ酸アンモニウム</td><td>メルク Sigma-Aldrich</td><td>516961-100 mL</td><td>>99.995%</td></tr><tr><td>Analyst TF</td><td>Sciex</td><td></td><td>バージョン 1.7</td></tr><tr><td>AnalyzerProソフトウェア</td><td>SpectralWorks Ltd.</td><td></td><td>手順7.2で使用するデータ処理ソフトウェア。バージョン5.7</td></tr><tr><td>AnalyzerPro XDソートウェア</td><td>SpectralWorks株式会社</td><td></td><td>手順7.5で使用するデータ処理ソフトウェア。バージョン1.4</td></tr><tr><td>ザ</td><td>ルトリウスのバランス。Precision Balances Pty. Ltd. (プレシジョンバランス)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>d6-トランスケイ皮酸</td><td>Isotec</td><td>513962-250 mg</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>Ajax Finechem Pty. Ltd.</td><td>A2471-500 mL</td><td>99%</td></tr><tr><td>凍結乾燥機 (Freezone 2.5 Plus)</td><td>Labconco</td><td>7670031</td><td></td></tr><tr><td>Glass Schott ボトル (100 mL、500 mL、1 L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガラスバイアル (2 mL) およびスクリューキャップ蓋 (スリット済み)</td><td>Velocity Scientific Solutions</td><td>VSS-913 (バイアル)、VSS-SC91191 (蓋)</td><td></td></tr><tr><td>Sciex TripleToF</td><td>Sciex</td><td>p/n 4456736</td><td></td></tr> <tr><td>用取り付けキットイソプロパノール</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>FSBA464-4</td><td>オプティマ LC-MS グレード</td></tr><tr><td>ラボ用ブレンダー</td><td>ワーリング 商用</td><td></td><td>モデル HGBTWTS3</td></tr><tr><td>ロイシン-エンケファリン</td><td>ウォーターズ</td><td>p/n 700008842</td><td>チューニングソリューション</td></tr><tr><td>メタボアナリスト</td><td><a href="https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml" target="_blank">https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/faces/home.xhtml</a></td><td></td><td>ハイスループットメタボロミクスのためのWebベースの分析パイプライン。無料のWebベースのツール。バージョン4.0。</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FSBA456-4</td><td>Optima LC-MS グレード</td></tr><tr><td>ミコナゾール</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>M3512-1 g</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心分離機 (Eppendorf 5415R)</td><td>エッペンドルフ (Crown Scientific Pty. Ltd. 販売)</td><td></td><td>5426 No. 0021716</td></tr><tr><td>微量遠心チューブ (2 mL)</td><td>SSIbio</td><td>1310-S0</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Office Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peak View ソフトウェア</td><td>Sciex</td><td></td><td>バージョン 1.2 (64 ビット)</td></tr><tr><td>ピペットチップ (200 uL, 100 uL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MBP2069-05-HR (200 uL), MBP2179-05-HR (1000 uL)</td><td></td></tr><tr><td>ピペット (200 uL, 1000 uL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラスチック遠心チューブ (15 mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NUN339650</td><td></td></tr><tr><td>Progenesis QI</td><td>Nonlinear Dynamics</td><td></td><td>Samll 分子探索解析ソフトウェア。バージョン 2.3 (64 ビット)</td></tr><tr><td>Sciex 5600 トリプル ToF 質量分析計</td><td>Sciex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スクリューキャップ溶解チューブ (2 mL) セラミックビーズ付き</td><td>Bertin Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ギ酸ナトリウム</td><td>Merck Sigma-Aldrich</td><td>456020-25 g</td><td></td></tr><tr><td>組織溶解器/ホモジナイザー</td><td>Bertin Technologies</td><td></td><td>シリアル0001620</td></tr><tr><td>メスフラスコ (10 mL、50 mL、100 mL、200 mL、1 L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>IKA Works株式会社(Crown Scientific Pty. Ltd.が販売)</td><td></td><td>001722</td></tr><tr><td>ウォーター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>FSBW6-4</td><td>Optima LC-MS グレード</td></tr><tr><td>ウォーターズ・アクイティ LC システム、クオータナリーポンプ搭載</td><td>ウォーターズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>・ウォーターズ・アクイティ UPLC 100mm HSST3 C18 カラム</td><td>ウォーターズ</td><td>製品 p/n 186005614</td><td></td></tr></tbody></table>

無標的液体クロマトグラフィー-質量分析法ベースの小麦粒のメタボロミクス分析

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

遺伝子間の相互作用、農業における環境と管理を理解することで、製品収量と品質をより正確に予測し、管理することができます。メタボロミクスデータは、特定の時点でこれらの相互作用の読み取りを提供し、生物の生化学的状態を有益にします。さらに、個々の代謝産物または代謝産物のパネルは、収量および品質予測および管理のための正確なバイオマーカーとして使用することができる。植物のメタボロムは、生理学的特徴とバイオマーカー発見に生化学的洞察の機会を提供する様々な物理化学的特性を有する何千もの小分子を含むことが予測される。これを利用するために、メタボロミクス研究者にとって重要な目的は、単一の分析で可能な限り多くの物理化学的多様性を捉えるためです。ここでは、フィールド成長小麦の分析のための液体クロマトグラフィー質量分析ベースの未標的メタボロミクス法を提示する。この方法は、液体クロマトグラフ四級溶媒マネージャーを使用して第3移動相を導入し、従来の逆相勾配と脂質を受け入れ可能な勾配と組み合わせたものです。穀物調製、代謝物抽出、器械分析およびデータ処理ワークフローについて詳細に説明する。質量精度と信号再現性が良好で、この方法はイオン化モードごとに約500の生物学的関連特徴を生み出した。また、小麦品種間の代謝産物および脂質特徴シグナルが有意に異なって決定された。

植物のメタボロメは、そのゲノムと環境の組み合わせ、さらに農業環境、作物管理体制の影響を受けます。我々は、小麦品種間の遺伝的差異が代謝産物レベルで観察され得、ここでは、500以上の測定化合物が穀物単独の品種間で有意に異なる濃度を示すことを実証する。良好な質量精度(&lt;10 ppm誤差)および内部標準の信号再現性(&lt;20%RSD)は、Figure 2負と正のイオン化モードの両方について観察された(表3)。記載されたサンプル調製および液体クロマトグラフィー質量分析ベースの解析により、負イオン化モードで900畳み込んだ特徴と、正のイオン化モードでの&gt;1300デコンボルト特徴が得られた。サンプル調製法および分析方法がアーティファクト特徴を導入したかどうかを判断するために、調製ブランク(図3)を含め、したがって、データマトリックスから排除されたすべての非生物学的影響を決定した。負モードでは421個、正モードでは835...

小麦粒代謝物および脂質の非標的分析法を紹介する。このプロトコルは、アセトニトリル代謝産物抽出法と逆相液体クロマトグラフィー質量分析法法を含み、正および負のエレクトロスプレーイオン化モードでの取得を伴う。

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

代謝産物は、ゲノム環境や管理手法などの要因の影響を受けます。これらの要因間の相互作用を理解することで、製品の収量と品質をより正確に予測し、管理することができます。従来の2つではなく第3の移動相を組み込むことによって、この技術はより広い範囲の代謝産物の分離および検出を可能にする。メタボロミクスは、生物学の任意の領域に適用することができます。まず、生物の生化学の理解を深め、生理学に関連して、生物的または生物的ストレスに対するそれらの反応を説明するのを助ける。第二に、バイオマーカーを研究中の摂動と関連付ける。イソプロピルアルコールは粘性溶媒であるため、低フレア速度で導入する必要があり、組成を98%に増やす前に十分な平衡時間を使用すると、クロマチックグラフィックシステムが過加圧したり、誤差を返したり、分析カラムを損傷したりする可能性があります。穀物の調製を開始するには、実験室用ブレンダーを使用して穀物を粉砕します。ブレンダーを高速で20秒間実行してから、繰り返します。ベースからブレンダージャーを取り外します。ブレンダージャーの側面をタップして、粗く粉砕した粒をサンプルの表面に持ち込みます。粗粉砕粒は廃棄するか、保存することができます。ブレンダーから細かく粉砕された穀物を2ミリリットルのプラスチックマイクロ遠心管に移します。抽出と同じ日に、原稿に記載されているように抽出溶媒を調製する。次に、200ミリグラムの細挽き穀物を2ミリリットルのマイクロ遠心分離管に計量する。チューブ内の穀物に500マイクロリットルの抽出溶媒を加えます。さらに、空のチューブに500マイクロリットルの抽出溶媒を加えてブランクを作製します。ホモジナイザーを使用し、6,500RPMにセットし、溶媒と穀物を20秒間混合する。その後、さらに 20 秒間繰り返します。その後、チューブを摂氏4度、16倍、100倍Gで5分間遠心分離する。上清を2ミリリットルのプラスチックチューブに移し、ペレットを保持します。ペレットの抽出プロセスを2回繰り返します。3つの上清を組み合わせ、約1.5ミリリットルの総抽出量を生成し、渦によって混合する。品質管理に使用するすべての穀物抽出物のプールサンプルを作るために、各穀物抽出物の55マイクロリットルを2ミリリットルのチューブと渦に移します。次いで、このプールされたサンプルの50マイクロリットルのアリコートをガラスバイアルに移す。各穀物サンプル抽出物の50マイクロリットルのアリコートをガラスバイアルに移す。書かれた原稿に記載されているように、液体クロマトグラフィー質量分析に必要な溶液を準備する。LCMS分析の日に、1ミリリットルの5%アセトニトリルを調製し、1ミリリットルのロイシン・エンケファリン当たり200ナノグラムを含有する。この溶液の950マイクロリットルを、粒抽出物の50マイクロリットルアリコートを含むガラスバイアルに加えます。渦をかいてバイアル中の内容物を混ぜます。まず、原稿とメーカーのユーザーガイドに記載されているように、機器のキャリブレーションを設定します。次に、移動相および洗浄溶媒を含むLCMSグレードの溶媒を使用してLC流体システムをパージし、洗浄する。LC方式の開始条件を使用してLCシステムを平衡化し、カラム圧が安定していることを確認します。計測器シーケンステーブルを設定します。サンプルシーケンスの最初にナトリウムのフォーマットを注入して、機器のキャリブレーションを確認します。最初に溶剤と予備ブランクを分析し、次にシステムコンディショニング用のプールされた品質管理サンプルを分析し、次に無作為化サンプルリストを分析します。技術複製として、品質管理サンプルを定期的に実行します。シーケンスの最後に 2 つの品質管理サンプルを実行します。シーケンスの実行中に、内部標準質量精度と信号再現性の両方を含むデータ品質を確認します。信号の再現性を確認するには、オーバーレイスペクトルの目視検査で十分です。4つの内部標準は、穀物抽出物を調製するために使用される溶液に含まれていた。LCMSでは、正と負のイオン化モードの両方で、良好な質量精度と内部標準の単一再現性が観察されました。ブランクの分析に基づいて、負のモードで421の信号と正のモードで835の信号がアーティファクトであると判断された。これらのシグナルは、穀物サンプル中の平均単一強度の5%以上の強度でブランクに存在していた。アーティファクトの除去とデータのさらなるフィルタリングの後、ネガティブモードは483の機能を返し、ポジティブモードは523の機能を返しました。約250の特徴は生物学的に関連しており、小麦品種の強度が大きく異なっていました。このプロトコルでは、準備ブランク、内部標準、プールされたサンプルを含めるなどの品質管理対策が重要です。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

超高速液体クロマトグラフィーと質量分析(UPLC-MS)を組み合わせたノンターゲット代謝物プロファイリングは、代謝を調査するための強力な技術です。...

超高速液体クロマトグラフィー - 質量分析（UPLC-MS）による血清中の大規模非標的メタボロームプロファイリング

非標的メタボロミクスは、代謝プロファイルのスナップショットを生成する仮説を提供します。このプロトコルは、細胞、血清、または組織からの代謝物の抽出と分析を紹介します。代謝物の範囲は、液 -...

ウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー - 高分解能質量分析（UPLC-HRMS）を使用した生物源から非標的メタボロミクス

代謝物プロファイリングは、健康と病気における代謝の研究に貴重な資産となっている。極性切り替えと迅速なデューティサイクルの高分解能質量分析に連結された正常相化液体クロマトグラフィーを利用して、我々は、高感度、精度、および解像度を有する生物学的物質の極性代謝物を分析するためのプロトコルを記載している。...

敏感な、大規模定量的メタボロームのための戦略

液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッ カロミセス・セレビシエ の定量的メタボロミクス

プロトコルは、複雑な溶解物ベースの無細胞系における代謝反応を研究するための屈折率または質量分析検出に結合された高速液体クロマトグラフィー法を記述する。...

リセートベースの無細胞システムにおける代謝物プロファイリングのためのリキッドクロマトグラフィー結合と屈折率または質量分析法検出

ここでは、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS-MS)を使用して、水耕条件下で小麦中のイミダクロプリドの吸収、転座、および分布を決定するためのプロトコルを示します。その結果、イミダクロプリドはコムギに吸収され、コムギの根と葉の両方でイミダクロプリドが検出された。...

コムギ中のイミダクロプリドの吸収、転座、分布の決定

オオムギのメタボローム解析の方法を紹介します。この分析法では、代謝物の分画と誘導体化、およびガスクロマトグラフィー/質量分析(GC/MS)による分析を行います。メタボローム解析を使用して、間作と干ばつストレスが穀物に及ぼす影響を判断できます。...

ガスクロマトグラフィー/質量分析法によるオオムギのメタボローム解析

このプロトコルは、最近発表された欧州委員会規則(EU)2023/915に準拠して、食品中の麦角アルカロイドの存在を決定するための検証済みの液体クロマトグラフィー-イオン移動度-高分解能質量分析法を提供します。...

液体クロマトグラフィートラップイオン移動度分析飛行時間型質量分析による食品マトリックス中の制御された麦角アルカロイドの検出

ここでは、液体クロマトグラフィーおよび質量分析を介して、 黄色ブドウ球菌およびそれらのその後の分析からの代謝産物を抽出するためのプロトコルを記載します。...

代謝産物分析のためのタンデム液体クロマトグラフィー - 質量分析に基づくアプローチ<em&gt;黄色ブドウ球菌</em

RNA 結合蛋白質を識別し、紫外線による光架橋と質量分析法を用いた生細胞におけるその RNA...

質量分析を用いた識別 RNA 結合領域のための試料作製

学ぼう、小麦粒のメタボロミクス分析における無標的液体クロマトグラフィー-質量分析法の応用。第三の移動相を導入することで、より広範囲の代謝物を検出し、遺伝的・環境的・管理要因の相互作用を理解して収量と品質を予測する手法を解説します。

無標的液体クロマトグラフィー-質量分析法ベースの小麦粒のメタボロミクス分析

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