小さな毛髪サンプルで11の薬剤耐性結核薬を定量化するための検証済みのLC-MS/MSパネル

患者の付着は非常に困難であり、薬物代謝は人によって異なるため、薬物レベルの客観的な測定は結核治療中の抵抗の出現を防ぐ上で重要であることが証明される可能性があります。遵守をより正確かつ容易に定量化できれば、医療従事者は薬剤耐性の開発を制限する治療計画を策定できる。我々は、単一のアッセイで小さな毛髪サンプル内の複数の結核薬のための最初の複数の分析物質量分析パネルを開発しました。

当社の多剤パネルは、患者1人につき1つの2ミリグラムサンプルのみを必要とし、サンプル量の損失を防ぐために固相抽出またはフィルタリングステップを使用しません。治療コースの早い段階で測定された薬物暴露の客観的措置は、治療レジメンにおける個々の薬物の問題に臨床医に警告する可能性がある。正確な薬物濃度の測定のために、毛髪サンプルは分析の日に粉砕されなければなりません。

毛髪サンプルを取得するには、書面によるインフォームド・コンセントを得た後、薄いラベル、2つの参加者ラベル、ハサミ、展開されたアルミニウム箔、アルコール拭き、ビニール袋などの材料を準備してください。はさみの刃をアルコール拭きできれいに拭きます。必要に応じて、頭の後ろに移動し、ヘアクリップを使用して髪の上部を持ち上げます。

頭の後ろから髪の毛の30本のストランドを収集し、あなたの手でかやぶきを分離します。頭皮にハサミを取り、髪のかやぶきをカットします。アルミ箔に毛のかやぶきを慎重に置きます。

毛のかゆみの遠位の端に薄いラベルを貼り、アルミ箔にしっかりとテーピングします。遠位の端は頭皮から最も遠い側です。かやぶき毛の上にアルミ箔の部分の上に折り畳み、アルミ箔の上に参加者ラベルを置きます。

折りたたんだアルミホイルをビニール袋に入れ、ビニール袋の上に別の参加者ラベルを貼ります。毛髪サンプルからの薬物抽出のために、各毛髪サンプルの2ミリグラムを個別にラベル付けされたビーズチューブに、2ミリグラムのブランクヘアサンプルを16個の追加のビーズチューブのそれぞれに計量します。計量後、すべてのビーズチューブをビードミルホモジナイザーに入れ、各サイクル間の15秒の休息期間で2つの30秒サイクルで毎秒6.95メートルの速度でサンプルを均質化します。

2番目の均質化の後、適切な内部標準ミックスの500マイクロリットルを各サンプルに加え、500マイクロリットルのメタノールをマトリックスブランクチューブに加えます。テーブルに従って適切な基準標準ミックスの量でキャリブレーションカーブチューブをスパイクし、2時間穏やかな揺れで37度の水浴にすべてのチューブを置きます。インキュベーションの最後に、各ビーズチューブから新しいラベル付きマイクロ遠心チューブに上澄み液を移し、500マイクロリットルのメタノールをビーズチューブに加えます。

ビードチューブをボルテックスし、対応するマイクロ遠心チューブにメタノール洗浄を移します。サンプルを遠心分離し、慎重に毛のペレットを邪魔することなく、新しいチューブに上清を転送します。チューブ内の液体を蒸発させて摂氏32度で乾燥し、1%のギ酸を含む高圧液体クロマトグラフィーグレード水200マイクロリットルでサンプルを再構成します。

ボルテックス後、液体サンプルを250マイクロリットルのインサートでアンバーバイアルに移します。液体クロマトグラフィータンデム質量分析の場合、まず、2.5マイクロメートルの粒子径と100オングストローム細孔径を有する2~100ミリメートルのカラムを、ポーラスコンパートメントに極端のエテリンクされたフェノールビーズを完全に取り付けます。この列に製造元が推奨するガード カートリッジが取り付けられていることも確認します。

MDR-TB LCMS メソッドの遷移に含まれる複合情報をコピーして貼り付けます。csv ファイルをマススペック ウィンドウのボックスに表示します。スプレッドシートでは、キャリブレーション曲線、品質管理、患者サンプル、キャリブレーション曲線、品質制御、患者サンプル、キャリブレーション曲線、品質制御のバッチシーケンスを作成します。

ランの開始と終了、およびキャリブレーション曲線、品質制御、患者サンプルの前後に、溶剤ブランク注射を追加します。次に、少なくとも8回の溶剤ブランク注入を較正曲線の注入に入れ、高い品質管理バイアルを入れて、検点の持ち越しを減らします。バッチが完了したら、定量ソフトウェアを開きます。

遷移をスクロールして、自動的に選択された保持時間が正確であることを確認し、ガウス 平滑化が 1.5 に設定されていることを確認します。次に、クリックすると、キャリブレーション曲線と回帰が表示され、待機タイプがx上に1つ設定されます。[OK] をクリックし、キャリブレーション カーブと品質管理サンプルを検証して、バッチが正常に実行されたことを確認します。

各量指定子の参照検体について、キャリブレーションポイントの少なくとも3分の2は、80~120%以内の精度を持つ必要があります。上記の条件がすべて満たされている場合は、バッチが渡され、サンプルを定量化できます。ツールバーの「編集」をクリックし、「表全体をコピー」をクリックします。

次に、表をスプレッドシートに貼り付け、2つのサンプル注入の計算された濃度の平均を使用して、各サンプルの報告された濃度を決定します。ここでは、すべての試験された11の薬剤耐性結核薬の確認されたレベルを有するクロマトグラムの図を示す。これらの図では、1つの特定の薬物について、カリフレータの1つに対して抽出されたイオンクロマトグラムが観察される。

量指定子と修飾子の遷移は、定量化器の面積と修飾子の面積の比率がサンプル全体で一定のままであるため、薬物の存在を定性的に確認するために使用されます。内部標準も監視され、各サンプル注入が正規化されていることを確認します。この分析では、南アフリカの西ケープ州から直接観察された治療条件下で薬剤耐性結核薬を服用している96人の患者の総研究集団のうち15の毛髪サンプルの便利なサンプルを評価し、各分析物の最低および最高レベルにわたる薬剤耐性結核薬の代表的なレベルを決定した。

固相抽出または濾過工程がない場合は、上清を蒸発管に移す際には注意してください。チューブに移されたものは、最終的に列に注入される可能性があります。ビーズラプターのローターは、しっかりとねじ込んだりロックしたりしないと飛び去ることができるので、操作する前にローターを再確認してください。

HIVの分野における抗レトロウイルス薬とは対照的に、結核薬薬物動態、付着および臨床結果の関係はほとんど研究されていない。私たちは、いくつかの結核薬が髪によく蓄積されないと仮定しています。これらの薬物の代謝物を標的にすることは、患者の遵守のより良い理解を提供するかもしれない。