マウスの腹骨テグメンタル領域内の光遺伝学を用いた2つの異なるリアルタイムプレイス優先パラダイム
February 12th, 2020
ここでは、マウスの光遺伝学を用いた場所優先パラダイムに関する2つの簡単なステップバイステッププロトコルを紹介します。これら 2 つの異なる設定を使用して、好みと回避の動作は、高い空間的および時間的選択性を持つ同一装置内で、簡単な方法で確実に評価できます。
ここでは、特定の脳領域の遺伝的刺激のやりがいのある、または回避的な特性を評価するための詳細なプロトコルを提供します。この技術は、特定の細胞の刺激がやりがいのある場合、または回避的であれば、迅速に答えることができます。我々は、腹側テグメンタル領域を刺激するためのセットアップを記述するが、我々のプロトコルは、研究された異なる領域の観点から特定のパラメータを変更するために容易に適応することができる。
まず、シングルボードマイクロコントローラを使用してレーザー光源を制御します。コンピュータへの適切な接続ケーブルを使用して、マイクロコントローラボードにスクリプトをロードします。スクリプトには、TTL ボックスを介してトラッキング ソフトウェアから来る外部変調と、刺激パラメータを制御するレーザーへの出力が含まれます。
ネットワークケーブルを使用して、TTLボックスをボードに接続します。レーザーが外部変調で制御するように設定されていることを確認し、FC/PCケーブルを使用してレーザーをボードに接続します。適切なピンを基板のグランド部分に接続します。
レーザー光源を光ファイバに接続するには、まずレーザー光源を回転関節に接続します。パッチコードをロータリージョイントに接続します。装置の上の回転関節を安定させるが、記録領域の外側にある。
光ファイバ パッチ コードの長さが、マウスがアリーナで問題なく動くように適切であることを確認します。アリーナの設定を調整するには、ルーラーを使用して物理装置の特定の部分を測定します。ソフトウェアでは、測定した部品に対応する線を描きます。
[尺度を調整する縮尺を描画]タブで、既知の値を入力します。アリーナを設計し、マウスの動きが記録される領域を描きます。ゾーンを作成し、最終的にレーザーペア、レーザー非対、ニュートラルとして割り当てられるゾーンを描画します。
[設定の検証] ボタンを押して、設定を検証し、アリーナの外部のゾーンなど、競合するパラメータがないことを確認します。ハードウェア制御が有効になっていることを確認し、実験の時間を 30 分に設定し、リファレンス ボックスの設定で [繰り返し] オプションを選択します。コンパートメントをレーザーペアとして割り当て、マウスの入力が条件の設定の下でマイクロコントローラボードにトラッキングソフトウェアを介してTTL信号をトリガします。
ニュートラルコンパートメント優先アプローチの設定を変更するには、アリーナと時間の設定後、A および B コンパートメントの設定に関連する条件ボックスのゾーン A およびゾーン B のいずれかに中心点が存在する場合に、A ゾーンと B ゾーンの両方をレーザーペアとして割り当てます。検出設定を設定するには、マウスに似たダミーを使用します。ダミーを装置の1つの区画に入れ、動的減算で自動セットアップを使用します。
ダミーを取り外し、反対側のコンパートメントに置きます。ダミーが完全に検出されていることを確認します。レーザーペアのコンパートメントにダミーを置きます。
刺激が機能するかどうかを確認するには、以前に設定したトライアル制御設定を使用して取得を開始し、刺激が必要に応じてトリガーされるかどうかを確認します。次に、ダミーを未ペアまたは中性コンパートメントに入れ、刺激が停止しているかどうかを確認します。レーザーのノブを使用して、レーザーパワーを10ミリワットに設定します。
セラミックスリーブを使用して光ファイバーのパッチコードに光ファイバーインプラントを接続し、マウスを3区画装置のニュートラルコンパートメントに配置します。ソフトウェアによってマウスが検出されるまで待ちます。動物がメインコンパートメントに入るのを制限する垂直スライドドアを取り外します。
動物は、任意の障害なしに自由に探検することができます。リアルタイムの場所の選好実験全体が 8 つのセッションで行われます。腹側テグメンタル領域にAAVチャネルロドプシンEYFPウイルスを注射したDAT-Creマウスをドーパミン作動性ニューロンを標的とすることを試験した。
マウスはレーザーペアコンパートメントで平均約70%の時間を費やし、ペアになっていないコンパートメントとは対照的に10%の中性コンパートメントとは反対の行動表現型を、腹側テグメンタル領域にAAVチャネロドプシンEYFPを注射したVglut2-Creマウスで観察した。マウスは、刺激と組み合わせたコンパートメントを避け、ペア化されていない状態でより多くの時間を費やしました。条件付き応答の5日目と8日目に、マウスは以前にペアになったコンパートメントの明確な回避を示さなかった。
特定のニューロンのやりがいのある役割または回避的な役割をさらに実証するために、記述された方法は、オペロンパラダイム、または光遺伝学的サブティブティクスなどの他の方法で補完することができる。ウイルスの取り扱いやレーザー光源の使用時には注意してください。
概要
この記事では、オプトジェネティクスを用いたマウスの場所選好パラダイムのための2つのプロトコルを提示し、空間的および時間的選択性の高さで選好と回避行動を評価できるようにします。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 行動分析
- オプトジェネティクス
背景
- 脳刺激の報酬的および嫌悪的特性を理解することは神経科学において重要です。
- オプトジェネティクスにより、神経活動を正確に制御できます。
- 場所選好パラダイムは、刺激に対する行動反応を評価するために一般的に使用されています。
- この研究は腹側被蓋野とその報酬処理における役割に焦点を当てています。
研究の目的
- マウスの行動に対するオプトジェネティック刺激の影響を評価するためのプロトコルを開発すること。
- 特定の神経刺激が選好と回避にどのように影響するかを評価すること。
- 異なる脳領域に適応できる柔軟なセットアップを提供すること。
使用された方法
- レーザー刺激を制御するための単板マイクロコントローラの利用。
- マウスの動きを正確に追跡するための実験エリアの校正。
- マウスの行動と同期するTTL信号の実装。
- 異なるマウス遺伝子型で複数のセッションにわたる行動反応の評価。
主要な結果
- DAT-Creマウスはレーザーとペアになった区画を好み、その時間の70%をそこで過ごしました。
- Vglut2-Creマウスはレーザーとペアになった区画を回避しました。
- 行動反応はテストの異なる日に変化しました。
- この方法は他の技術と組み合わせてさらに検証することができます。
結論
- このプロトコルは、特定の神経刺激が行動に与える影響を研究するための信頼性の高い方法を提供します。
- 結果は遺伝的背景に基づいて異なる行動表現型を示しています。
- さらなる研究により、追加の方法論を用いてこれらの発見を拡張することができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Assessing the rewarding or aversive properties of neuronal stimulation is critical for target validation in neuroscience-driven drug discovery. Real-time place preference paradigms enable rapid, causal interrogation of specific neural circuits, supporting mechanistic de-risking of therapeutic hypotheses. This approach provides quantitative behavioral readouts that inform go/no-go decisions in early discovery workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables causal testing of whether stimulation of a defined neuronal population produces reward or aversion phenotypes.
- Operational Value: Provides real-time, quantitative behavioral readouts with high temporal resolution to support hypothesis interrogation.
- Predictive Value: Supports target confidence by linking neuronal activation to measurable behavioral outputs relevant to neuropsychiatric indications.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Establishes a standardized, reproducible behavioral assay for screening neuromodulatory targets using optogenetic stimulation.
- Quantitative Output: Generates time-in-compartment metrics that serve as dependent variables for evaluating stimulation effects across genotypes or conditions.
- Scalability: Protocol can be adapted to different brain regions and stimulation parameters, enabling cross-target screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Ventral tegmental area stimulation models mesolimbic pathway function, relevant to reward-related disorders and addiction therapeutics.
- Translational Continuity: Real-time behavioral readouts bridge acute neuromodulation studies with longer-term conditioned place preference assessments.
- Mechanistic De-risking: Helps distinguish direct neuronal effects from compensatory network responses, reducing ambiguity in target mechanism.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase, where circuit-level target validation precedes lead identification and preclinical efficacy testing.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by determining if optogenetic activation of specific neurons drives reward or aversion behaviors.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility for evaluating neuromodulatory targets across different genetic or pharmacological conditions.
- Analytics: Provides quantitative dependent variables (time spent in laser-paired, unpaired, neutral compartments) for statistical comparison of stimulation effects.
- Translational Research: Connects acute neuronal stimulation effects to behavioral phenotypes with relevance to preclinical models of reward processing.
- Enterprise Reuse: Framework can be standardized across labs and adapted to various brain regions, promoting platform-level reuse in neuroscience discovery.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers mechanistic insight into neuronal causality, reducing false positives in target selection.
- Operational Value: Enables high-throughput behavioral assessment with automated tracking and real-time stimulation control.
- Strategic Value: Improves confidence in target modulation strategies, supporting better resource allocation in early discovery.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets based on behavioral validation of circuit-specific effects.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optogenetics, viral vector delivery, and stereotaxic surgery for precise neuronal targeting.
- Depends on integrated hardware including microcontrollers, lasers, rotary joints, fiber optics, and behavioral tracking software.
- Necessitates cross-team standardization between neuroscience, engineering, and data analysis groups for consistent setup and calibration.
- Must account for variability in opsin expression, fiber placement, and laser power delivery across subjects.
- Limited to acute behavioral effects; does not assess chronic adaptation or compensatory mechanisms without complementary longitudinal studies.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:36
Setting up the Control of the Laser Source
1:44
Setting Up the Experiment for the RT-PP (Real-Time Place Preference) Approach and NCP (Neutral Compartment Preference) Approach
3:13
Performing an Experiment Using Laser Stimulation
4:24
Results: Real-Time Place Preference Experiment
5:18
Conclusion
