マウスの腹骨テグメンタル領域内の光遺伝学を用いた2つの異なるリアルタイムプレイス優先パラダイム

ここでは、特定の脳領域の遺伝的刺激のやりがいのある、または回避的な特性を評価するための詳細なプロトコルを提供します。この技術は、特定の細胞の刺激がやりがいのある場合、または回避的であれば、迅速に答えることができます。我々は、腹側テグメンタル領域を刺激するためのセットアップを記述するが、我々のプロトコルは、研究された異なる領域の観点から特定のパラメータを変更するために容易に適応することができる。

まず、シングルボードマイクロコントローラを使用してレーザー光源を制御します。コンピュータへの適切な接続ケーブルを使用して、マイクロコントローラボードにスクリプトをロードします。スクリプトには、TTL ボックスを介してトラッキング ソフトウェアから来る外部変調と、刺激パラメータを制御するレーザーへの出力が含まれます。

ネットワークケーブルを使用して、TTLボックスをボードに接続します。レーザーが外部変調で制御するように設定されていることを確認し、FC/PCケーブルを使用してレーザーをボードに接続します。適切なピンを基板のグランド部分に接続します。

レーザー光源を光ファイバに接続するには、まずレーザー光源を回転関節に接続します。パッチコードをロータリージョイントに接続します。装置の上の回転関節を安定させるが、記録領域の外側にある。

光ファイバ パッチ コードの長さが、マウスがアリーナで問題なく動くように適切であることを確認します。アリーナの設定を調整するには、ルーラーを使用して物理装置の特定の部分を測定します。ソフトウェアでは、測定した部品に対応する線を描きます。

[尺度を調整する縮尺を描画]タブで、既知の値を入力します。アリーナを設計し、マウスの動きが記録される領域を描きます。ゾーンを作成し、最終的にレーザーペア、レーザー非対、ニュートラルとして割り当てられるゾーンを描画します。

[設定の検証] ボタンを押して、設定を検証し、アリーナの外部のゾーンなど、競合するパラメータがないことを確認します。ハードウェア制御が有効になっていることを確認し、実験の時間を 30 分に設定し、リファレンス ボックスの設定で [繰り返し] オプションを選択します。コンパートメントをレーザーペアとして割り当て、マウスの入力が条件の設定の下でマイクロコントローラボードにトラッキングソフトウェアを介してTTL信号をトリガします。

ニュートラルコンパートメント優先アプローチの設定を変更するには、アリーナと時間の設定後、A および B コンパートメントの設定に関連する条件ボックスのゾーン A およびゾーン B のいずれかに中心点が存在する場合に、A ゾーンと B ゾーンの両方をレーザーペアとして割り当てます。検出設定を設定するには、マウスに似たダミーを使用します。ダミーを装置の1つの区画に入れ、動的減算で自動セットアップを使用します。

ダミーを取り外し、反対側のコンパートメントに置きます。ダミーが完全に検出されていることを確認します。レーザーペアのコンパートメントにダミーを置きます。

刺激が機能するかどうかを確認するには、以前に設定したトライアル制御設定を使用して取得を開始し、刺激が必要に応じてトリガーされるかどうかを確認します。次に、ダミーを未ペアまたは中性コンパートメントに入れ、刺激が停止しているかどうかを確認します。レーザーのノブを使用して、レーザーパワーを10ミリワットに設定します。

セラミックスリーブを使用して光ファイバーのパッチコードに光ファイバーインプラントを接続し、マウスを3区画装置のニュートラルコンパートメントに配置します。ソフトウェアによってマウスが検出されるまで待ちます。動物がメインコンパートメントに入るのを制限する垂直スライドドアを取り外します。

動物は、任意の障害なしに自由に探検することができます。リアルタイムの場所の選好実験全体が 8 つのセッションで行われます。腹側テグメンタル領域にAAVチャネルロドプシンEYFPウイルスを注射したDAT-Creマウスをドーパミン作動性ニューロンを標的とすることを試験した。

マウスはレーザーペアコンパートメントで平均約70%の時間を費やし、ペアになっていないコンパートメントとは対照的に10%の中性コンパートメントとは反対の行動表現型を、腹側テグメンタル領域にAAVチャネロドプシンEYFPを注射したVglut2-Creマウスで観察した。マウスは、刺激と組み合わせたコンパートメントを避け、ペア化されていない状態でより多くの時間を費やしました。条件付き応答の5日目と8日目に、マウスは以前にペアになったコンパートメントの明確な回避を示さなかった。

特定のニューロンのやりがいのある役割または回避的な役割をさらに実証するために、記述された方法は、オペロンパラダイム、または光遺伝学的サブティブティクスなどの他の方法で補完することができる。ウイルスの取り扱いやレーザー光源の使用時には注意してください。