マウス副腎のマルチプレックス免疫染色のためのマイクロウェーブおよび蛍光色素-Tyramide - 同じ宿主種からの非共役一次抗体を使用

免疫染色は、目的のタンパク質の位置を特定するために生物医学研究で広く使用されています。マルチプレックス免疫染色は、異なる一次抗体を使用して同じサンプル上の複数の標的を検出することができます。この方法の利点は、同じ宿主種からの2つ以上の非標識一次抗体を使用して免疫染色を可能にする抗体交差反応性を排除するために一般的に利用可能な緩衝液を使用することです。

この手順のデモンストレーションは、大学院生のソフィア・ジェンと、私の研究室の客員研究員であるQiongxia Lyuです。染色前に、示されているように、各溶液に5分間浸漬したホルマリン固定パラフィン埋め込みスライドを脱ワックスし、水分補給します。2回目の蒸留水浸漬後、蓋付きピペットチップボックスの底に275ミリリットルのクエン酸ナトリウム溶液をスライドに入れ、700ワットの電子レンジに75%の電力で8分間置きます。

処理の最後に蓋を開け、コップリン瓶に新鮮なPBSTを5分間洗浄してスライドを洗浄する前に、溶液を室温まで冷却します。非特異的結合部位を遮断するには、最後の洗浄後、各スライドから余分なPBSTを振り、適切なブロッキング溶液の十分な体積でスライドを覆う。加湿チャンバ内の室温で30分後、各スライドから過剰なブロッキング溶液を振り、各サンプルに目的の第1一次抗体の250マイクロリットルを加える。

サンプルが乾燥するのを防ぐために、スライドはパラフィンフィルムの一部で覆われてもよい。加湿室で摂氏4度で一晩インキュベーションした後、スライドを新鮮なPBSTで3回洗浄して1回5分間洗浄します。余分なPBSTを振り払い、室温で加湿したチャンバーで1時間のインキュベーションのために適切な二次抗体溶液の250マイクロリットルで各スライドを素早く覆います。

インキュベーションの最後に、スライドを示すように新鮮なPBSTで3回洗浄し、各スライドに250マイクロリットルの新鮮なレンサビジンワサビのペルオキシダーゼを加えます。室温で30分後、スライドを新鮮なPBSTで3回洗います。その後、余分なPBSTを振り払い、各スライドを250マイクロリットルの新鮮なフルオロフォア-チラミド溶液で覆います。

1分後、新鮮なPBSTでスライドを沈下し、続いて新鮮なPBSTで3回の2分間の打ちを行います。最後の洗浄後、1対1のグリセロールからPBSへの溶液を数滴塗布し、蛍光顕微鏡による蛍光シグナルの有無を確認します。第1抗体複合体を取り除くために、抗体標識スライドを少なくとも8分間、クエン酸ナトリウム溶液を沸騰させる275ミリリットルに入れる。

処理の最後に蓋を開け、溶液を室温まで冷たませてから、PBSTで3回PBSTで洗浄を5分間洗浄します。目的の第2の標的タンパク質を染色するには、示されているように非特異的結合を遮断した後、各サンプルを摂氏4度で250マイクロリットルの目的の第2一次抗体で標識する。翌朝、各スライドを適切な二次抗体溶液250マイクロリットルで覆う前に、1回の洗浄ごとに新鮮なPBSTでスライドを5分間5分間洗浄し、室温で1時間インキュベーションします。

インキュベーションの最後に、スライドを示すように新鮮なPBSTで3回洗浄し、各スライドに250マイクロリットルの新鮮なレンサビジンワサビのペルオキシダーゼを加えます。目的の第2の標的タンパク質のシグナルを開発するために、3回のPBSTの使用後、異なる蛍光スペクトルでジラミドを結合したフルオロフォアでスライドを治療する。チラミド信号の発達を止めるには、スライドをPBSTに沈下する。

その後、適切な核染料でサンプルを染色します。蛍光顕微鏡によるイメージングの場合、各核色素標識スライドをカバースリップに適切な取り付け媒体の滴で取り付けます。4Xの目的を使用して、スライド上の組織を見つけます。

イメージングの目的を10Xに切り替え、光光源で100~400ミリ秒に調整します。その後、ステージを移動せずに各チャンネルの画像を取得します。各チャンネルの画像を結合して、多重蛍光画像を形成することができます。

第1および二次抗体染色の間に剥がれなければ、チロシンヒドロキシラーゼの第2染色は、目的の第1標的タンパク質からのシグナルを拾い上げ、例えば副腎皮質内のこのサンプルで偽陽性のチロシンヒドロキシラーゼ染色を生じる。第1の免疫染色からワサビペルオキシダーゼ中の抗体交差反応性を除去するために、1分間および8分間のマイクロ波介在ストリッピングを行い、クリーンな二重染色結果をもたらす。陰性制御サンプルでは、有意な信号は拾われません。

沸騰クエン酸バッファーでの 8 分間のストリッピングは、副腎で一般的に使用される多くの抗体に対する抗体交差反応性を排除するのにも十分です。いくつかのケースでは、弱い偽陽性シグナルはまだ検出可能であり、マイクロ波治療に20分の増加はまだ完全に抗体交差反応性を除去しない可能性があります。蛍光イメージングの間、チャネルを切り替える際にステージを動かさないことが重要です。

ただし、各チャンネルの鮮明な画像を得るためにフォーカスを再取り付けする必要があるかもしれません。各チャンネルについて、露光時間を調整して、画像内の露出過大なピクセルや領域が存在しない信号が適切に露出されるようにしてください。染色手順の間、脱ワックスからスライドを水分補給し続けることが重要であり、スライドは同じストリッピング方法を数回使用して剥がして多重染色を可能にする。