Name: 細菌性アン トラシス および他のカプセル化病原体に対するワクチン開発における機能性抗体を評価するオソノ付着アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 47 s
Description: 学ぶオソノ付着アッセイを用いたBacillus anthracisなどのカプセル化病原体に対する機能性抗体の評価方法。BSL-1またはBSL-2環境で安全にワクチン効力と相関する抗体を検出できます。

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J.チュア、D.シャボット、A.フリードランダーは、原稿に記載されている手順を設計しました。J.チュアとT.プトモン・テイラーが実験を行った。D. Chabot はデータ分析を実行しました。J.チュアは原稿を書いた。
著者らは、優れた技術支援のためにカイル・J・フィットに感謝します。
この作業は、国防脅威削減庁の助成金CBMによって支援されました。VAXBT.03.10.RD.015、プラン番号921175。
意見、解釈、結論、勧告は著者のものであり、必ずしもアメリカ陸軍によって承認されるとは限りません。本書の内容は、必ずしも国防総省の見解や方針を反映したものではなく、商号、商用製品、または組織に関する言及も、米国政府による支持を意味するものではありません。

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著者らは、利益相反を引き起こす可能性のある商業的または他の関連付けを持っていません。

カプセル系ワクチンは、多数の細菌病原体に対して有効性が示されており、多くはヒト25、26、27での使用に対してライセンスされている。これらのワクチンは、カプセルを標的とする抗体を生成することによって働き、これらの研究の多くはOPKAを用いて、抗体13、14、16、28、29のオソノ貪食機能を示す。バイオセーフティの懸念と作業の容易さのために、我々はB.アントラシスカプセルコンジュゲートでワクチン接種された動物からの抗体を評価するOAAを開発しました。B. アントラシス上のカプセルの存在は、付着お...

認識、付着、内在化、および病原体の分解は、貪食症1に不可欠であり、1883年2、3年にイヤ・メチニコフによって最初に説明された宿主の自然免疫応答における顕著な経路である。食細胞性白血球は、免疫系の他の細胞と同様に、標的の選択において非常に差別的である。それらは、パターン認識受容体(PRR)4,5のレパートリーによって病原体関連分子パターンを介して「感染性非自己」と「非感染自己」を区別することができる。病原体の宿主認識は、補体および抗体6などの宿主オプソニンの結合と共に起こり得る。このプロセスは、オプソナイゼーションと呼ばれ、これらの分子で病原体をコーティングし、食作用細胞6上のオプソニック受容体(例えば、補体およびFc受容体)への結合時の内在化を増強する。病原体が食細胞に付着するためには、複数の受容体と同結合リガンドの集合的結合が必要である。そうして初めて、ホストセル内のシグナル伝達カスケードを付着して、内部化を開始することができます。
病原体のクリアランスと感染予防における貪食の重要性のために、細胞外病原体は生存を延長するためにこのプロセスを破壊する多くの方法を開発してきました。重要な1つの戦略は、その電荷によって抗貪食性であるアニオン性高分子(例えば、多糖またはポリアミノ酸)カプセルの製造であり、免疫原性が低く、そしてPR6,7から細菌エンベロープ上の分子を遮蔽する。クリプトコッカス・ネオフォルマンや肺炎球菌などの病原体は、糖類ポリマーで構成されるカプセルを有するのに対し、ブドウ球菌は表皮基内および一部のバチルス種がポリɣグルタミン酸(PGGA)7,8を産生する。しかし、他の病原体は、非感染性の自己に似たカプセルを生成します。例えば、B.セレウスの連鎖球菌性菌株および病原性株は、抗貪食性であるだけでなく、免疫系9,10によって異物として認識されないヒアルロン酸カプセルを有する。
カプセルをキャリアタンパク質に結合すると、それらを貧しいT依存性抗原から高い免疫原性T依存性抗原に変換し、高血清抗カプセル抗体力剤11,12を誘導することができる。この戦略は、S. 肺炎,血友病インフルエンザ ,および Neisseria 髄膜炎菌に対するライセンスワクチンに採用されています。抗カプセル抗体のオプソニック作用は、一般的にオソノ貪食性殺死アッセイ(OPKA)13、14、15、16によって評価されている。これらのアッセイは、機能性抗体が貪食を引き起こし、14を殺すことができるかどうかをテストする。しかし、B.アントラシス17を含む、第1層生物学的選択剤や毒素(BSAT)などの感染病原体とのOPKAの使用は危険であり、セキュリティリスクを伴う。これらのアッセイは、選択剤の広範な取り扱いを必要とする。選択剤の取り扱いは、制限されたバイオセーフティレベル3(BSL-3)の研究所でのみ行うことができます。これらの分野での作業は、従わなければならない多数の安全およびセキュリティ上の予防措置のために長引く操作手順を要求する。BSL-3の実験室はまた顕微鏡およびサイトメーターのようなOPKAの仕事のために使用される専門の装置と一般に装備されていない。そこで、不活化菌18,19の使用に基づく代替アッセイを開発した。我々はこれを、内部化とアッセイ出力としての殺害に依存しないオプソノ付着アッセイ(OAA)と呼ぶ。代わりに、オプゾン化不活化病原体の付着は、貪食の指標として使用される。OAAは、付着が先験的に起こり、内在化および細胞内殺滅と密接に絡み合っているので、OAAは適切な代替物である。バイオセーフティの観点から、OAAは、感染性薬剤の最小の取り扱いを必要とし、OPKAよりも実験的に短い期間であり、そして不活性化病原体のストックが産生および移送された後にBSL-2研究所で行うことができるので好ましい。
カプセルコンジュゲートでワクチン接種した非ヒト霊長類(NHP)の血清に見られる抗カプセル抗体のオプソニック機能を調べるOAAの利用を実証する[すなわち、B.アントラシスからナイセリア髄膜炎の外膜タンパク質複合体(OMPC)に結合したB.アントラシスからのPGGA]20。血清オプゾン化バチル酸は、付着マウスマクロファージ細胞株、RAW 264.7でインキュベートした。固定後、細胞単層及び接着性バチルを蛍光顕微鏡で画像化した。細菌の付着は、バチル菌を対照血清20と比較してカプセルコンジュゲートでワクチン接種したNHPから血清でインキュベートした場合に増加した。付着は炭疽菌チャレンジ20,21の生存と相関した。従って、OAAの使用は抗カプセル抗体の機能を特徴づけ、ワクチン候補の試験を大いに促進した。

<table><tbody><tr><td>0.20 以上mシリンジフィルター(25mm、再生セルロース)</td><td>コーニング、コーニング、NY</td><td>431222</td><td></td></tr><tr><td>10 mLシリンジ(Luer-Lokチップ)</td><td>BD、フランクリンレイクス、ニュージャージー</td><td>州302995</td><td></td></tr><tr><td>15&micro; 96ウェルブラックプレート(イメージング用プレート#1)</td><td>In Vitro Scientific、サニーベール、CA</td><td>P96-1-N</td><td></td></tr><tr><td>16%パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡科学、ハットフィールド、ペンシルバ</td>ニア<td>州15710</td><td></td></tr><tr><td>75 cm四方組織培養処理フラスコ</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>寒天(粉末)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>A1296</td><td></td></tr><tr><td>Baby Rabbit Complement</td><td>Cedarlane Labs, Burlington, NC</td><td>CL3441</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Yeast Extract</td><td>BD, Sparks, MD</td><td>288620</td><td></td></tr><tr><td>BBL Brain Heart Infusion (BHI)</td><td>BD, Sparks, MD</td><td>211059</td><td></td></tr><tr><td>血液寒天(羊の血液を含むTSA)プレート</td><td>Remel、Lenexa、KS</td><td>R01198</td><td></td></tr><tr><td>細胞スクレー</td><td>パーSarstedt、ニュートン、ノースカロライナ</td><td>州83.183</td><td></td></tr><tr><td>Costar 96ウェル細胞培養プレート(希釈用プレート#2&3)</td><td>コーニング、コーニング、NY</td><td>3596</td><td></td></tr>カバー<tr><td>ガラス</td><td>電子顕微鏡科学、ハットフィールド、PA</td><td>72200-10</td><td></td></tr><tr><td>Difco栄養ブロス</td><td>BD、Sparks, MD</td><td>234000</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose</td><td>Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>11965-092</td><td>contains 4500 mg/L glucose, 4 mM L-glutamine, Phenol Red</td></tr><tr><td>EVOS FL Auto Cell Imaging System (fluorescence microscope)</td><td>Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>AMAFD1000</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, South Logan, UT</td><td>SH30071.03</td><td>ガンマ線照射せず、熱不活化されていない</td></tr><tr><td>フルオレセインイソチオシアネート</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>F143</td><td></td></tr><tr><td>HCS Cell Mask Orange Cell Stain</td><td>Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td><td>H32713</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer (Improved Neubauer)</td><td>Hausser Scientific, Horsham, PA</td><td>3900</td><td></td></tr><tr><td>インドインク溶液</td><td>BD、スパークス、メリーランド</td><td>州261194</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン(200 mM)</td><td>Gibco、サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサムMA</td><td>25030081</td><td>サプリメント培地と追加の2mM L-グルタミン</td></tr><tr><td>ニコンエクリプスTE2000-U(倒立複合顕微鏡)</td><td>ニコンインスツルメンツ、メルビル、ニューヨーク</td><td>TE2000</td><td></td></tr><tr><td>PBSカルシウムまたはマグネシウムなし</td>ロン<td>ザ、ウォーカーズビル、メリーランド</td>州<td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン溶液、100x</td><td>Hyclone、GE Healthcare Life Sciences、サウスローガン、ユタ州</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿 (100 x 15 mm)</td><td>Falcon、コーニング、ダーラム、ノースカロライナ州</td><td>351029寒</td><td>天プレート</td></tr><tr><td>用 RAW 264.7 マクロファージ細胞株 (Tib47)</td><td>ATCC、マナッサス、バージニア州</td><td>ATCC TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>スライド</td><td>VWR、ラドナー、ペンシルバニア</td><td>州 16004-422</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液 (0.4%)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 700 Laser Scanning Microscopy (共焦点顕微鏡)</td><td>Carl Zeiss Microimaging, Thornwood, NY</td><td>4109001865956000</td><td></td></tr></tbody></table>

細菌性アン トラシス および他のカプセル化病原体に対するワクチン開発における機能性抗体を評価するオソノ付着アッセイ

Opsono-Adherence Assay to Evaluate Functional Antibodies in Vaccine Development Against Bacillus anthracis and Other Encapsulated Pathogens

オソノ付着アッセイは、細菌病原体のプロの食細胞への付着を列挙する機能的アッセイです。アギャンスは食細胞性および殺死に必要であるため、アッセイはオソノ貪食性殺死アッセイの代替方法である。オソノ付着アッセイの利点は、不活性化病原体と哺乳類細胞株を使用するオプションであり、複数の実験で標準化が可能です。アッセイにおける不活性化病原体の使用はまた、バイオセーフティレベル3感染因子および他の有害な病原体との作業を容易にする。我々の研究では、オソノ付着アッセイは、抗体の機能的能力を評価するために使用され、炭疽菌カプセルベースのワクチンで免疫された動物のセラから、固定 バチルスアントラシス の固定されたアテンスをマウスマクロファージ細胞株RAW 264.7に付着誘導する。マクロファージに付着したバチルの画像を捕捉するために、自動蛍光顕微鏡を用いた。接着性の増加は、血清中の抗カプセル抗体の存在と相関していた。高い血清抗カプセル抗体濃度を示した非ヒト霊長類は炭疽菌の挑戦から保護された。従量的に、オソノ付着アッセイは、セラにおける抗原特異的抗体の生物学的機能を解明し、ワクチン候補および他の治療薬の有効性を評価し、免疫の可能な相関として役立つものとして使用することができる。

本セクションでは、OAA実験中に収集された代表的な顕微鏡写真と、OAAを使用して抗体の生物学的機能を調べることができることを示す結果を示します。ここで、アッセイは炭疽菌ワクチン候補の有効性を評価するためにうまく使用された。バチルスのカプセル化の状態を確認することは重要であり、カプセル化がほとんどまたはまったくない場合、宿主細胞に付着し、高いバックグラウンドを産生する。 図1 は、カプセル化を調べるためにインドのインクで否定的に染色された B.アントラシス ・エイムズの画像である。OAA では、隣接する複数の視野を照らし、共焦点顕微鏡を使用する場合は複数のスタックまたはセクションを使用する必要があります。したがって、バチルが薄暗くも、写真漂白剤でもなく、あまりにも早く過ぎないことを確認する必要があります。 図2 はFITCで標識されたバチルの画像である。 図3 は、細胞単層に結合した B.アントラシス ・エイムズの最大投影画像...

オソノ付着アッセイは、ワクチン開発における抗体のオプソニック機能を評価するオソノ貪食性殺死アッセイの代替方法である。

The opsono-adherence assay is a functional assay that enumerates the attachment of bacterial pathogens to professional phagocytes. Because adherence is ...

Opsono-Adherence Assayは、ワクチン接種後に動物で産生される機能性オポソニック抗体の存在を分析し、これはいくつかの認可されたヒトワクチンの有効性と相関することが示されています。このアッセイは、生物学的選択剤やその他の感染性病原体との使用に適しており、不活化BSL-3薬剤を移した後、BSL-1またはBSL-2ラボで実施できます。炭疽菌カプセルを含む細菌カプセルに対する抗体は、感染の動物モデルで有効であることが実証されています。Opsono-Adherenceアッセイは、動物に感染することなく抗体を機能的に評価します。炭疽菌のカプセル化された毒性株を扱うときは、すべての機関の安全およびセキュリティ手順に従ってください。このビデオでは、バイオセーフティレベル2の条件下で不活化株を使用しています。この手順は、テキストプロトコルに記載されているように、RAW 264.7細胞の調製から開始します。オプソノアドヒアランスアッセイのために細胞をプレートするには、フラスコを新しい培地と交換し、細胞スクレーパーを使用してフラスコから細胞を穏やかに掻き取ります。ピペットで上下に動かして細胞の塊を分割し、細胞のカウントを容易にします。96ウェル0.15ミクロン厚のガラス平底プレートにウェルあたり14, 000個の細胞をプレートします。細胞を3日間増殖させ、OAAを実行する1日前に使用済みの培地を交換します。3日間のインキュベーション後、細胞数はウェルあたり約50, 000細胞になるはずです。アッセイを開始するには、胞子ストックから炭疽菌のマスタープレートを調製し、NBY寒天プレート上で分離します。デモンストレーションの目的で、羊の血液寒天プレートを使用しました。37°Cで1日インキュベートしてから、ブロスで培養します。次に、通気孔のある250ミリリットルのフラスコに30ミリリットルの培養ブロスを、桿菌のいくつかのコロニーで接種します。ブロスカルチャーを125 RPM、摂氏37度、20%CO2、湿度で18〜24時間振とうします。インドインクによるネガティブ染色を使用して、十分なカプセル化を確保し、固定前にバチルスが短鎖にあることを確認します。これを行うには、顕微鏡スライドで5マイクロリットルの細菌懸濁液と2マイクロリットルのインドインクを混合します。次に、1ミクロンまたは1.5ミクロンの厚さのカバーガラスを、気泡を作らないように懸濁液の上に置きます。光学顕微鏡で40倍から100倍の油対物レンズを使用して細菌懸濁液を観察します。厚いカプセルは墨を除外しています。各細菌を取り巻くクリアランスゾーンを観察することにより、バチルスがカプセル化されていることを確認してください。また、バチルス菌の鎖が短いことを確認してください。コロニー形成ユニット(CFU)を決定するには、PBS溶液で1〜10マイクロリットルの培養物を連続希釈し、ヒツジの血液寒天プレートで培養希釈液をプレート化します。摂氏37度で12〜18時間インキュベートします。CFUをカウントし、培養物1ミリリットルあたりの細菌数を決定します。桿菌が十分にカプセル化され、希釈され、播種されていることを確認した後、残りの細菌培養物を30ミリリットルの培養物に10ミリリットルの16%パラホルムアルデヒドを加えて、最終濃度4%のパラホルムアルデヒドで固定します。ボリュームを50ミリリットルの円錐管に移します。その後、周囲温度のシェーカーで7日間ゆっくりと攪拌します。無菌性をテストするには、4ミリリットルまたは10%容量の固定細菌懸濁液を50ミリリットルの円錐管に移します。懸 ?? 液をPBSに加えて洗浄し、最低3000 Gで45分間ペレット化します。.次に、上澄みを取り除き、ふわふわのペレットが邪魔されないようにします。この洗浄を少なくとも2回繰り返した後、固定サンプルを4ミリリットルのPBSに再懸濁します。洗浄中にすべての固定剤を除去して、固定剤が生存率試験を妨げないようにする必要があります。必要に応じて、洗濯の回数を増やしてください。生存率試験では、40ミリリットルの細菌増殖培地に4ミリリットルの洗浄懸濁液を接種し、摂氏37度で7日間インキュベートします。7日前後に分光光度計で600ナノメートルの光学密度を確認し、濁度を測定します。ブロス培養物で7日間インキュベートした後、少なくとも100マイクロリットルのブロスを寒天プレートにプレートし、さらに7日間インキュベートします。濁度の増加やプレート上の成長が見られない場合、元の培養物は無菌と見なされ、BSL-2ラボに移される可能性があります。移管の承認については、機関のガイドラインに従ってください。不活化細菌ストックをPBSで3回洗浄し、固定剤を取り除きます。FITC溶液を最終濃度75マイクログラム/ミリリットルで加えます。混合物を摂氏4度で18〜24時間ゆっくりと攪拌します。以前と同様にバクテリアを洗い、余分なFITCを取り除きます。最終洗浄後、バチルス菌を同じ開始容量でPBSに再懸濁し、バチルス菌をマイナス20°Cで保存して使用してください。非ヒト霊長類由来の少量の試験血清を摂氏56度で30分間、ヒートブロックまたはPCR装置で熱不活化します。FITC標識細菌をPBSで2回落下させ、15,000倍Gで3〜5分間ペレット化することにより洗浄します。同じ開始ボリュームのPBSに再サスペンドします。96ウェル丸底プレートで、テスト血清を細胞培地で連続希釈します。別の96ウェル丸底プレートで、希釈したテスト血清10マイクロリットルを各ウェルに加えます。次に、再構成したばかりの赤ちゃんウサギの賛辞を10マイクロリットル加えます。プレート番号3に、感染の多様性が20になるように、適切な量のFITC標識桿菌を追加します。例えば、50, 000細胞あたり20桿菌の50, 000倍を含む容量で。プレート番号3の各ウェルに、合計105マイクロリットルの適切な量の細胞培地を注ぎます。プレート3番を摂氏37度で、5%CO2の存在下で30分間インキュベートし、湿潤でバチルス菌をオプソニン化します。接着細胞を含むプレート1を摂氏37度のヒートブロックに置きます。マルチチャンネルピペッターを使用して使用済み培地をウェルから取り出し、プレート番号3から100マイクロリットルのオプソナイズバクテリアにすばやく交換して、ピペッティング中にウェルに気泡が発生しないようにします。細胞単層を乱さないように、ウェルの側面にボリュームを追加します。プレート1番を摂氏37度、CO2濃度5%、湿度30分間インキュベートして接着します。摂氏37度のヒートブロックの上に150マイクロリットルのPBSで各ウェルを5回洗い、付着していない桿菌を取り除きます。ウェルの側面にピペットで移動し、洗浄中に細胞が誤って分散しないようにします。各ウェルに150マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドを加え、細胞を1時間固定します。PBSで細胞を2回洗浄した後、10ミリリットルのPBSに2マイクロリットルのハイコンテントスクリーニングオレンジ細胞染色液を混合します。次に、この染色液150μLを加えて細胞を固定し、常温で30分間インキュベートします。プレート番号1をステージに置き、明視野または位相コントラストを使用して細胞に焦点を合わせます。[Acquisition]タブで、プレート設定として[96ウェル形式]を選択します。次に、[チャネル設定] を選択します。次に、タイルモードへの設定を選択します。取得する画像の数を示します。取得モードを白黒またはモノクロに変更し、ビニングを少なくとも2つずつ設定します。オートフォーカスまたはフォーカスモジュールをオンにします。オートフォーカス機能を実行する頻度を示します。次に、Z-Stack 機能をオンにします (利用可能な場合)。細胞単層および付着性桿菌の厚さを捕捉するZスタックの数を示します。画像を保存するファイルフォルダを指定します。次に、自動イメージングプログラムを実行します。テキストプロトコルで説明されているように、データ収集と分析を実行します。炭疽菌のエイムズ株をインディアインクで陰性染色し、カプセル化を調べました。カプセル化がほとんどまたはまったくないと、抗体なしで宿主細胞に付着し、高いバックグラウンドを生成するため、カプセル化の状態を確認する必要があります。桿菌の蛍光強度と光退色特性を共焦点顕微鏡を用いて調べた。バチルス菌はイメージング中に長時間光にさらされるため、バチルスの蛍光が時間の経過とともに大幅に衰退しないことを確認することが重要です。ここでは、細胞単層に付着する炭疽菌の最大投影画像を示します。これらは、オプソノアドヒアランスアッセイでカウントされ、スコアリングされた代表的な視野です。カプセル結合抗血清とインキュベートした桿菌の付着の増加は、桿菌をオプソニン化する抗カプセル抗体の存在によるものです。10マイクログラムと50マイクログラムのカプセルコンジュゲートをワクチン接種した非ヒト霊長類の血清力価は、コンジュゲートとカプセルのみの力価よりも有意に高いです。.私たちは、フローサイトメトリーと非接着細胞であるヒト好中球を用いて、光音速活性を測定するとともに、細菌表面のカプセルを定量する同様のアッセイを開発しています。このビデオを見れば、オプソノアドヒアランスアッセイについて十分に理解できるはずです。BSL-3病原体の取り扱いは非常に危険であることを忘れないでください。機関のガイドラインと安全上の注意に厳密に従う必要があります。

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JoVE Journal

Immunology and Infection

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