高速スキャン環状ボルタンメトリー(CIS-FSCV)による注入と刺激を組み合わせて、パジカルドーパミンの腹側テグメンタル領域受容体調節を評価する
2020年4月23日
このプロトコルの目標は、直接腹側テグメンタル領域受容体を操作して、第二次ドーパミン放出への寄与を研究することです。
このアプローチは、側坐核における特定の腹側被蓋領域、体性樹状突起受容体、および位相性ドーパミン放出の役割を解明するのに役立ちます。このアプローチの主な利点は、位相性ドーパミン放出に対する受容体機能制御に関する疑問を無傷の脳で解決できることです。炭素繊維微小電極とバイポーラ刺激装置の位置を最適化することは困難な場合があり、初心者へのアドバイスとして、背側線条体での記録を開始することがいくつかあります。
記録電極、参照電極、刺激電極など、複数のタイプの電極を使用および操作するため、これらの電極がいつ、どこに埋め込まれるかを視覚的にガイドすると役立ちます。ペダル反射に対する反応の欠如を確認した後、麻酔をかけたラットの頭皮を3つの連続したヨードポビドンと70%エタノールスクラブで洗浄します。.最後のスクラブの後、滅菌したニードルノーズピンセットと手術用ハサミを使用して、埋め込まれた電極のためのスペースを確保するのに十分な頭皮組織を切り取ります。
露出した頭蓋骨の表面を滅菌した綿の先端アプリケーターで優しく洗浄してから、3%過酸化水素を2〜3滴塗布して、ラムダとブレグマを特定します。次に、毎分約20, 000回転に設定された1ミリメートルのドリルビットを使用して、直径1.5ミリメートル、ブレグマの前方2.5ミリメートル、横方向に3.5ミリメートルの穴を開けます。外径1.59ミリメートル、長さ3.2ミリメートルのネジを穴の約半分まで埋め込み、ネジがしっかりと固定されるまで
埋め込みます。次に、左半球、ブレグマの前方1.5ミリメートル、およびブレグマの横方向に直径1ミリメートルの参照電極穴を開けます。埋め込みネジの頭の周りと下にワイヤーを巻き付けながら、約2mmの基準ワイヤーを穴に挿入します。次に、ネジを完全に埋め込み、参照電極を所定の位置に固定します。
右半球に、ブレグマに対して直径1.5ミリメートル、前方1.2ミリメートル、横方向に1.4ミリメートルの穴を開け、ピンセットを使用して硬膜を慎重に取り除きます。刺激電極については、ブレグマの後方5.2ミリメートルと外側1ミリメートルを中心に、前後2ミリメートルと内側外側5ミリメートルの正方形の穴を開けます。定位アームバーを使用して、バイポーラ刺激電極ガイドカニューレを硬膜から5mm下に下げます。
定位アームバーを使用して、炭素繊維微小電極を線条体の最も背側の硬膜から4mm下に下げ、基準ワイヤーと炭素繊維をポテンショスタットに接続します。次に、マイナス0.4〜1.4ボルト、毎秒400ボルトの三角波を60ヘルツで15分間印加し、続いて10ヘルツで10分間の刺激を加えます。刺激電極の位置を最適化するには、60ヘルツの周波数、24パルス、300マイクロアンペアの電流、および位相あたり2ミリ秒のパルス幅のバイポーラ電気波形を生成するように刺激装置を設定します。
刺激装置を硬膜の5mmから7.8mmまで0.2mm刻みでゆっくりと下げ、VTAを1回ずつ刺激します。刺激が背側線条体内の炭素繊維微小電極で位相性ドーパミン放出を生成するまで、バイポーラ刺激電極ガイドカニューレを下げ続けます。ドーパミンの放出が観察されたら、炭素繊維微小電極を硬膜から少なくとも6ミリメートル下まで下げて、側坐核の最も背側部分に下げます。
電極が所定の位置にあるとき、VTAを刺激し、ドーパミンピークのピーク振幅を記録し、次に炭素繊維微小電極を最大のドーパミン放出を生成する部位まで下げたり上げたりして、ドーパミン応答のピークが0.6ボルトの明確な酸化ピークとマイナス0.2ボルトの減少ピークとして表されることを確認します。カーボンファイバーと刺激電極ガイドカニューレの位置が最適化されたら、3分ごとに20〜30分間動物を刺激します。安定したベースラインを達成した後、バイポーラ刺激装置にあらかじめ装着されたガイドカニューレに手で内部カニューレを静かに下げ、さらに2〜3回のベースライン記録を取得して、カニューレの挿入が誘発信号の変化を引き起こさなかったことを確認します。
ベースライン反応が確立されたら、シリンジポンプとマイクロシリンジを使用して、0.5マイクロリットルの目的の薬物溶液を2分間かけてVTAに注入します。.注入後、除去する前に少なくとも1分間内部カニューレを所定の位置に置き、注入後の影響を測定するために3分ごとに応答を記録し続けます。これらの代表的なカラープロットで示されているように、生理食塩水の注入は刺激された相性ドーパミン放出を変化させません。
NMDAの注入は、刺激された位相性ドーパミン放出の強力な増加をもたらしますが、NMDA受容体の競合的拮抗薬であるAP5は、強力な減少をもたらします。非競合的ニコチン性アセチルコリン受容体 ?? 抗薬メカミラミンと非選択的競合ムスカリン性アセチルコリン受容体 ?? 抗薬スコポラミンの両方が、刺激された位相ドーパミン放出の大幅な減少を引き起こします。.このグラフでは、試験した薬剤の経時的な影響をまとめたものです。
注入カニューレは、バイポーラ刺激電極に注意深く挿入する必要があります。そうしないと、過度の損傷が発生し、位相性ドーパミン放出の人工的な変化につながる可能性があります。このアプローチにより、研究者は、位相性ドーパミン放出がin vivoで制御される特定の受容体メカニズムにより詳細に取り組むことができました。
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概要
本研究では、サブ秒単位のドーパミン放出における受容体の役割を調べるため、腹側被蓋野（VTA）の受容体を操作するプロトコルを提示します。特に、特定の細胞体樹状突起受容体と、それが側坐核における位相性ドーパミン放出に及ぼす影響の解明に焦点を当てています。本アプローチにより、無傷の脳モデルにおける受容体機能の検討が可能となります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 電気生理学
- 神経科学
- ドーパミンシグナリング
背景
- 腹側被蓋野は、ドーパミン放出の調節において極めて重要である。
- 受容体のメカニズムを理解することは、ドーパミン関連行動を解明する鍵となる。
- 本研究では、受容体を操作し、そのin vivoにおける機能を評価することを目的とする。
- 電極の配置および構成における課題が認められている。
研究目的
- ドパミン放出ダイナミクスにおける特定のVTA受容体の役割を調査すること。
- 無傷の脳環境内における受容体機能に関する知見を提供すること。
- 効果的な刺激および記録のための電極配置を最適化する手法を洗練させること。
使用方法
- ラットモデルにおけるカーボンファイバー微小電極を用いた電気生理学的記録。
- 本研究では、VTAおよびその周辺領域への記録電極および刺激電極の植込みを行っている。
- 重要な手順として、脳組織への損傷を最小限に抑えるための慎重な外科的手法が含まれる。
- 刺激プロトコルが詳細に記述されており、ドパミン放出量の測定に向けた電気波形および周波数に焦点が当てられている。
主な結果
- 位相的なドーパミン放出が観察され、受容体操作による影響を受けた。
- NMDAの注入はドーパミン放出を増加させたが、AP5やmecamylamineなどのアンタゴニストはそれを減少させた。
- ドーパミン反応における定量的で明確なスパイクが記録され、受容体特異的な効果が特性づけられた。
- 本研究により、ドーパミン動態の効果的な操作および観察のための手法が検証された。
結論
- このプロトコールは、in vivoにおけるドーパミン放出に対する受容体の影響を評価するための枠組みを提供します。
- これにより、ドーパミンシグナリングの根底にある神経メカニズムへの理解が深まります。
- 依存症研究および神経薬理学における意義は非常に大きいものです。
よくある質問
業界における実用的な重要性
この手法により、生体内（in vivo）における受容体介在性の位相性ドパミン放出制御を直接的に解析することが可能となり、神経精神疾患治療薬の探索におけるターゲットバリデーションのメカニズム的なリスク低減が図れます。VTA受容体機能と側坐核における定量可能なドパミンダイナミクスを関連付けることで、初期段階の治療仮説検証における予測の信頼性が向上します。本アプローチは、in vitroの受容体薬理学と無傷の脳生理学を橋渡しし、報酬系ターゲットにおけるトランスレーショナルな連続性を改善します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期創薬探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 体細胞樹状突起受容体による相性ドパミン放出の調節を解析し、生体内における治療標的を検証します。
- 運用上の価値： 薬理学的アゴニストおよびアンタゴニストを用いることで、無傷の脳回路における受容体特異的なメカニズムのデリスキングを可能にします。
- 予測的価値： ドパミン放出の変化を定量化し、標的への信頼性の裏付けおよびポートフォリオの選別決定を支援します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 刺激誘発性ドーパミン放出を定量的なリードアウトとして用い、下流のアッセイ標準化に向けて検証済みの生物学的システムを準備する。
- 運用的価値： 研究間で一貫した化合物評価を行うために、再現可能な電極ベースの記録条件を確立する。
- 拡張性： 同一の動物モデルを用いて複数の受容体モジュレーターをスクリーニングするための、プラットフォームの再利用をサポートする。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性：疾患に関連するフェーズ的なドーパミンシグナリングを通じて、探索段階の受容体検証を前臨床段階へと連続的に結びつけます。
- メカニズムによるリスク低減：ドーパミン放出に対する受容体特異的な寄与を明確にし、標的とする作用機序の曖昧さを低減します。
- リスク調整後の推進：フェーズ的なドーパミンダイナミクスに対する受容体介在性の効果に基づき、go/no-go判断に情報を供します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ドーパミン放出に対する受容体活性の機能的なリードアウトを提供することで、ターゲットバリデーションからリード化合物の特定に至る創薬の連続的なプロセスに統合されます。
- 探索生物学：VTAへの直接注入および刺激により、位相性ドパミン調節における受容体機能の仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：安定したベースラインのドパミン応答と定量可能な注入後の効果を通じて、アッセイの準備状態を提供します。
- 分析：条件比較のための定量的アウトプットとして、ドパミンのピーク振幅および酸化還元ピークの測定を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：報酬処理に関連する完全な脳モデルにおいて受容体メカニズムを検証することで、前臨床研究へと繋げます。
- エンタープライズ再利用：電極植込みおよび記録セットアップを、複数の受容体標的に対して再利用可能な機能として位置づけます。
運用および企業への影響
- 科学的価値：受容体の操作とドーパミン放出ダイナミクスを関連付けることで、ターゲット検証における予測の信頼性を提供します。
- 運用的価値：最適化された電極配置および刺激プロトコルを通じて、標準化と再現性を確保します。
- 戦略的価値：早期のメカニズム的なリスク低減により、後期の生物学的リスクを減少させ、資本効率を向上させます。
- ポートフォリオへの影響：フェージック・ドーパミン・シグナリングに対する受容体特異的な影響に基づいた、リスク調整後のターゲット優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- 定位手術、電気生理学、およびカーボンファイバーマイクロ電極の取り扱いに関する専門知識が必要です。
- ポテンショスタット、定位固定装置のアームバー、および注入と刺激制御のためのマイクロシリンジポンプに依存します。
- 電極の植え込み座標および刺激パラメータについて、チーム間での標準化が必要です。
- VTA-側坐核経路以外の異なる脳亜領域を標的とする場合の適応検討が含まれます。
- 電極操作による潜在的な組織損傷による制限があり、最適化されていない場合はドーパミン信号に人為的な変動が生じる可能性があります。
バイオファーマに関するよくある質問
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:56
Electrode Implantation
3:12
Carbon Fiber and Stimulating Electrode/Guide Cannula Location Optimization
4:26
Combination Infusion and Stimulation Fast-Scan Cyclic Voltammetry (FSCV) Recording
5:18
Results: Representative Analyses of Stimulation-Evoked Phasic Dopamine Release
6:03
Conclusion
