レーザーカットステンシルを用いたシンプルリソグラフィフリーシングルセルマイクロパターニング

フォトリソグラフィとソフトリソグラフィに関連する多くの障害を克服するステンシルベースのリソグラフィフリー単細胞マイクロパターン法について説明します。ステンシルは再利用可能であり、プロセスは安価でカスタマイズ可能です。この方法は、非エンジニア研究者が様々な生理学的および病理学的文脈における細胞形状および領域誘発メカノ伝達を研究するための新しい道を開いた。

さらに、このプロトコルは、皿の中で高スループットの薬物スクリーニングおよび疾患のモデル化のために利用することができる細胞の数千のマイクロパターニングを可能にする。視覚的なデモンストレーションは2つの重要なステップの注入を促進する:ヒドロゲルからのカバースリップの剥離、ステンシルを置く前に十分にヒドロゲルを乾燥させる。原稿に記載されているように、ポリアクリルアミドヒドロゲル溶液を新しい50ミリリットルプロピレン遠心分離チューブで調製します。

次に、5%光イチニエータ溶液を調製し、100%エタノールの700マイクロリットルに成分を溶解する。成分は水溶性ではないので、ボルテックスで完全に溶解するようにしてください。1ミリリットルの最終体積のためのPBSの300マイクロリットルを追加します。

氷に取り組んで、薄い基膜マトリックスタンパク質溶液を氷冷DMEM F12培地または1X PBSで最適希釈比にします。後で使用するために氷の上に保管してください。基底膜マトリックスを使用する場合は、常に氷の上で作業し、冷却ピペットチップやチューブで氷冷溶液を使用するようにしてください。

UVベンチランプを生物安全フードに設置します。次に、先に作製した殺菌パラフィンフィルムを置く。パラフィンフィルムが完全に乾燥していない場合は、真空吸引システムを使用して残留液を除去します。

オートクレーブ鉗子を使用して、各ペトリ皿のパラフィンフィルム6に6つのオートクレーブカバーリップを置きます。UV架橋可能なポリアクリルアミド最終溶液を調製するために、フォトイチシエーター溶液をポリアクリルアミドヒドロゲル前駆体溶液で希釈する。0.22マイクロメートルの細孔サイズの50ミリリットルのフィルター単位を使用して溶液を殺菌する。

その後、200マイクロリットルのUV架橋可能なポリアクリルアミド最終溶液を、ペトリ皿の6つのガラスカバーリップのそれぞれに分配します。オートクレーブ鉗子を使用して、慎重に2つのカバーリップの間に溶液の層をトラップ第2のカバースリップでカバースリップをカバーします。蓋を閉じていないUVベンチランプの下にカバースリップを含むペトリ皿を置きます。

非白色表面の白紙の被覆は、UV強度損失を最小限に抑えるために重要です。紫外線からの保護のために、アルミニウムホイルでランプをカバーする。ポリアクリルアミドヒドロゲルを5分間フォトポリマー化します。

カミソリの刃を使用して、カバーリップの各ペアを慎重に分離します。6つのヒドロゲルカバースリップ複合材料を含む貯蔵所をPBSで満たします。5分間リンスした後、ペトリ皿のパラフィンフィルムにヒドロゲルカバースリップ複合材を戻します。

マイナス80°Cの貯蔵からスルフォ-SANPAHのチューブを得る。1,200マイクロリットルの予冷PBSをチューブに加え、上下にピペットで混ぜます。希釈したスルフォ-SANPAHの200マイクロリットルをペトリ皿のパラフィンフィルムに分配します。

ハイドロゲルカバースリップコンポジットをスルフォ-SANPAHの上に置き、ハイドロゲルをスルフォ-SANPAHに接触させる。次に、UVランプの下にヒドロゲルカバースリップ複合材料を置き、それらを5分間露出してSulfo-SANPAHを活性化させます。Sulfo-SANPAH がオレンジ色から茶色に変わり、正常に活性化および組み込みが成功したことを示している場合は、10 分以内に次の手順に進みます。

使い捨てのポリプロピレンの貯蔵所に新鮮なPBSを補充しなさい。活性ヒドロゲルカバースリップ複合材料をリザーバに移し、それらを短時間すすいで、非結合スルフォ-SANPAHを除去します。ペトリ皿のパラフィンフィルムにヒドロゲルカバースリップ複合材料を置き、滅菌糸状拭きで慎重にダブります。

各ヒドロゲルカバースリップコンポジットの上にステンシルを置きます。ステンシルとコンポジットの間に密閉を確保するには、オートクレーブの糸くずのないワイプでダビングして余分な水分を取り除きます。各ヒドロゲルカバースリップ複合材料の上に200マイクロリットルを置く希釈された基質膜マトリックスタンパク質溶液を慎重に分配する。

37°Cで一晩構造をインキュベートします。翌日、複合材料を6ウェルプレートに移します。マトリックスタンパク質溶液がステンシルの上に保持されているかどうかを観察することで、ヒドロゲルとステンシルの間の密閉シールを簡単に検証できます。

密閉シールを形成する失敗は、穴を通してタンパク質溶液の迅速な漏出につながります。PBSに完全に浸漬します。オートクレーブピンセットを使用して、ヒドロゲルを引き裂くことなく、慎重にハイドロゲルからステンシルを取り外します。

井戸からPBSを取り出し、DMEMで井戸を補充します。プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。インキュベーターからプレートを取り出した後、DMEMを調べてください。

DMEMが曇っていない場合、ヒドロゲルカバースリップ複合材料は、細胞めっきに使用する準備ができています。ステンシルは、正方形と長方形の配列を含む製造されました。マトリックスタンパク質のステンシルおよび島から作成したマイクロパターン化ヒドロゲル基質が得られた。

細胞島も得られた。例えば、ヒト誘導多能性幹細胞由来心筋細胞の島。マトリックスタンパク質濃度は、適切なパターンを生成する上で不可欠な役割を果たしました。

最適濃度は、タンパク質の均質な分布につながった。最適でないマトリックスタンパク質溶液濃度は、最適ではないパターニングにつながった。ステンシルの前面を使用することが重要です。

ステンシルの裏側を使用する場合、レーザー切断の方向によりマトリックスタンパク質アイランドのサイズが大きくなります。ステンシルの裏側を使用しても矩形パターンの幅に大きな影響を与えなかったが、高さが大幅に増加し、意図したアスペクト比の低下を招いた。ステンシルベースのパターニングをシリコンエラストマー基板に適用した。

シリコンエラストマー基質上のパターン化された心筋細胞を、低倍率で心臓トロポニンTの免疫細胞化学と高倍率での肉体タンパク質α-アクチニンによって可視化した。ステンシルベースのパターニングは、異なる剛性を有するヒドロゲル上で2つの心筋細胞を並べてパターン化するためにも適用された。ヒトが誘導する多能性幹細胞とそれに対応する分化プロトコルの発見により、この研究のための理想的なインビトロヒトモデルが、腫瘍発生と病因を研究する上で理想的なモデルとなっています。

しかし、IPSシステムを用いる大きな制限は、細胞と相互作用する特定の生化学的組成と剛性を有する微小環境に構造がないことである。パターニングは、牽引力顕微鏡と免疫細胞化学アッセイと組み合わせて、心筋細胞の構造と機能を特徴付けることができます。IPS由来細胞型の分析は、我々の場合、心筋細胞、より生理学的形態における、培養皿における挑戦的な心筋細胞を研究する機会を開く。

この技術は、高内容スクリーニングプレートや他の多くのシステムにも適用できます。形状および基板は、アプリケーションに容易に調整することができる。