Name: 高分子電解質複合体ミセルの組み立てと特徴付け (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: 学ぶ 高分子電解質複合体ミセルの組み立てと特徴付け。塩アニーリング法により低分散性のナノ粒子を再現性よく調製し、光散乱、小角X線散乱、電子顕微鏡で構造を解析する。治療用核酸の効率的な送達に応用可能です。

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シカゴ大学のソフトマター特性評価施設とアドバンスド電子顕微鏡施設のフィル・グリフィンとテラ・ラヴォワにそれぞれ感謝します。また、アルゴンヌ国立研究所の先端光子ソースのシャオビン・ズオとソエンケ・ザイフェルトに感謝し、NIST階層材料設計センター(CHiMaD)を支援します。ジェフ・ティンとマイケル・リュークハイデのこの作品への貢献に感謝します。

著者たちは開示するものは何もない。

上述のように、ここで提示されたプロトコルは、ポリアニオン成分としてオリゴヌクレオチドに焦点を当て、カチオン中性ブロック共重合体としてpLys-PEGに焦点を当てて書かれていますが、ポリ(アクリル酸)、ポリグルタミン酸、PEGポリ(ビニルベンジルトリメチルアンモニウム)などの様々なポリマーでテストしており、一般的にポリ電解質ペアに適用可能であると考えています。最適化が必要なパラメータの 1 つは、アニールに使用される塩濃度です。これは、DLSによって実験的にチェックすることができ、または、脂肪電解質単独で相分離の観察と比較して(中性ブロックなし)することができる。熱焼鈍は塩焼鈍が望ましくない場合に使用することができるが、得られる多分散度は7より大きい。より大きなナノ粒子は小さなナノ粒子よりも多くの光を散乱させ、核酸は骨格に電子密度のリン原子が存在するため、他の多くのポリマーよりもX線を散乱する方が効率的であるため、特性評価に使用される濃度も最適化する必要があります。また、いずれかの高分子電解質が働き条件に近いpKaを有する場合、緩衝液のpHをより厳密に制御する必要がある。
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逆に荷電性の高分子電解質が水溶液中に混合されると、それらの対イオンの放出によるエントロピーゲインは、高分子が豊富な凝縮相と高分子枯渇上清1、2、3、4、5に溶液の脱混合を引き起こし、高分子電解質錯体として知られている現象である。中性親水性ブロックが一方または両方の高分子電解質に結合している場合、ナノスケールの相分離が起こる(図1A)。得られた自己集合コアシェルナノ粒子は、様々にポリ電解質複合体ミセル(PCM)と呼ばれ、ポリイオン複合体ミセル、ブロックイオノマー複合体、または界面活性剤ミセル化にたとえよるコアミセル、システムのすべての構成要素が親水性6、7であるにもかかわらず。PCMのタンパク質や核酸などの親水性分子をカプセル化する能力、ならびにブロックコポリマーキャリアアーキテクチャによって提供される広範なツナビリティは、それらの治療分子を生体8、9、10、11、12、13で送達するための魅力的な候補となる。
細胞標的に治療用核酸を送達することは特に重要な課題であり、PCMにはいくつかの利点があります。治療用核酸(遺伝子DNA、mRNA、およびsiRNAなどのオリゴヌクレオチド)は、ヒトの健康を改善する大きな可能性を有するが、その電位14、15、16を実現するためには多数の生物学的および物理的障壁を克服しなければならない。裸の核酸は血清および細胞ヌクレアーゼによって分解され、急速に循環から取り除かれ、その強い負電荷は助けを借りずに細胞膜に浸透することを困難にする。これらの障壁を克服するための現在のアプローチは、疎水相互作用15、17、18を介して組み立てられた種々の脂質ナノ粒子へのヌクレアーゼおよび/またはカプセル化による損傷を防止するための高価な化学修飾を含む。これらの方法は局所的な注射および肝臓の標的化に有効であることが証明されているが、全身使用は毒性、免疫原性、および限られた生体分布16の重大な限界を提示する。対照的に、PCMは核酸の負の電荷を使用して相分離コア内でそれらを凝縮し、中性コロナは分解に対する立体障壁を提供し、リガンドを組み込んで標的化または内在化を強化するプラットフォーム11,19を提供する。インビトロおよび動物研究では、PCMは様々な核酸ペイロード20、21、22、23、24を効果的に送達できることが示されていますが、構成ポリマーの特性からサイズ、形状、安定性などのPCM特性を予測する能力の弱点は、より広い採用を妨げている。
我々のグループや他の分野の他の人々による最近の研究は、構造特性を開発することによってこの問題に対処し始めており、いくつかのケースでは、核酸と様々なカチオン中性ポリマー7、25、26、27から形成されたPCMのための構造特性と機能の関係を構築しています。これらの研究から生まれた2つの一貫したテーマは、PCMアセンブリのための十分に制御された再現可能なプロトコルを開発することの重要性と、得られるナノ粒子を特徴付けるために複数の技術を使用することの利点です。高電解質、特に核酸のような高い電荷密度を有するものは、互いに非常に強く相互作用し、混合時にキネティックに閉じ込められて容易に見え、その結果、手順の小さな変動に対して高感度で、バッチからバッチへの高い多分散性と再現性の悪さを示すPCM製剤が生じる。PCMは、部品の原子レベルの構成に応じて幅広い形状とサイズを採用することも示されており、特にダイナミック光散乱(DLS)などの一般的な技術では粒子形状に関する仮定が必要なため、個々の特性評価技術でこの多様性を捉えるのが非常に困難です。
本稿では、オリゴヌクレオチドとカチオン中性のジブロックコポリマーに焦点を当てて、PCMの材料設計と選択について議論する。次に、PCM アセンブリ中の運動トラップを回避するために、高い塩濃度を使用し、低速透析を行う塩アニールプロトコルについて説明します。高電解質は、静電的なアトラクションがスクリーニングされる高塩条件で混合され、その後、塩濃度をゆっくりと低下させ、熱アニーリングの遅い冷却プロセスに似た、高分子電解質が最も精力的に有利な構成に落ち着くことを可能にする。このプロトコルを使用して、オリゴヌクレオチドPCMs7、26の非常に低い多分散性と高い再現性を定期的に達成することができます。最後に、外部形態から内部構造まで、幅の広いスケールでPCMを特徴付ける4つの個別の測定技術(DLS、マルチアングル光散乱(MALS)、小角X線散乱(SAXS)、透過電子顕微鏡(TEM)の4つの異なる測定技術を説明します。私たちは、これらのプロトコルにより、より多くの研究者がこれらの興味深いナノ粒子の能力を効果的に探求することを可能にすることを期待しています。
ポリマーの選択と調製 PCM特性は、構成ポリマーの物理的および化学的特性に強く影響を受け、設計プロセスにおける重要なステップとしてポリマーを選択します。核酸PCMの最もよく特徴付けられるブロックコポリマーは、ポリ(リジン)-ポリ(エチレングリコール)(pLys-PEG)のような線形二重ブロックであるが、PCMは高いスループット28で生成することができる多電解質と様々な親水性中性荷電ポリマーの間で形成することができる。荷電群の選択はミセル26のイオンペアリングおよび形状の安定性に強く影響し、PCMサイズは、充電ブロック5、7、26(図2)の長さに伴って増加することが示されており、PCM特性は所望のアプリケーションの要件に合わせて調整することが可能である。線形ディブロックの場合、荷電ブロックは少なくとも10の電荷を持ち、所望のpHで強く充電されるべきであることがわかりました。より長い荷電ブロックは、siRNAなどのオリゴヌクレオチドを用いたPCM形成を促進し得るが、これは短いブロック21との複合体化が困難である。我々は、最大200のブロック長でPCM形成を観察することに成功しており、文献はより長いポリマーを記述している。ニュートラルブロック24の選択では柔軟性が高いが、経験上、ナノ粒子形成ではなく凝集に至る非常に短いニュートラルブロック、および最小中性の長さが帯電したブロック長で増加することが示されている。pLys-PEGの場合、〜50未満のpLysの長さには少なくとも3,000~5,000のPEGMWが必要であり、チャージブロックがさらに増加するにつれて長い長さが必要です。ニュートラルブロック長の増加により、中性ポリマーの立体混雑によるPCMサイズ、特にシェルの厚みが増加します。
この原稿は、凍結乾燥した高純度のpLys-PEGおよび既知の量のオリゴヌクレオチドからPCMを調製するためのプロトコルを提示するが、他のシステムにも容易に適応可能であるべきである。ポリアルギニンやポリグルタミン酸をはじめ、ポリアクリル酸やポリ(ビニルベンジルトリメチルアンモニウム)などの合成ポリ電解質を挙げ、いくつかの荷電ポリペプチドを用いて試験を行いました。また、多電荷の量論比を持つPCMの準備についても説明していますが、これは容易に変更できます。私たちは、充電濃度単位(c.c.)で作業するのが最も簡単であり、完全に充電されていないポリマーにも自然に対応しています。いずれかのポリマーが十分に特徴付けされていない場合は、ポリマーの長さ/質量を正確に決定し、透析による電荷中和に必要な量を超えて余分な塩が存在しないことを確認する必要があります。任意の保持水の存在は、濃度が計算されたときにも考慮する必要があります。核酸濃度は、260 nmでの吸光度によって簡便に定量することができ、c.cを計算する際には末端リン酸塩の有無を考慮する必要があります。
ポリアニオンとしてオリゴヌクレオチドを使用する場合、ハイブリダイゼーション状態および化学構造は、自己集合性に対する傾向および得られたPCM5、7、26の特性を決定するのに役立つ。これらを最適化すると、配信にPCMを使用する場合の生物学的有効性の要件の範囲内で、所望の構造を形成する可能性が高くなります。ハイブリダイゼーションの分析に役立つツールには、核酸の MATLAB 関数、NUPACK29、および IDT オリゴ アナライザーがあります。1)に結合する強さを理解するために候補配列を分析することを推奨します。2)同じシーケンスの別のコピー(自己ダイマー);そして3)系に存在する他のオリゴヌクレオチドに対する。特定の配列のDNAおよびRNA融解温度は、近傍法30,31を用いて計算することもできる。核酸の熱アニーリング(ステップ2.3)は、個々のヌクレオチド中の残留二次構造を変性させ、平衡折りたたみを促進します。
PCM の特性評価と分析 静的・動的光散乱、電子や中性子の小さな角度散乱、電子顕微鏡など、ナノ粒子を特徴付けるための幅広い技術が利用可能です。本稿では、小角X線散乱法と2つの電子顕微鏡技術の2つの光散乱技術に関するプロトコルを提供する。
DLSは、サンプルのブラウン運動から一角度で散乱強度の時間的変動の自己相関を測定します。このデータをフィッティングすることで、球体ミセルの流体力学半径と多分散性を提供できます(図3)。マルチアングル光散乱(MALS)は、多くの角度で静的散乱強度を測定します。この角度依存性はナノ粒子の形状を表しますが、可視光の場合は約50nmを超える長さスケールに制限され、より小さなナノ粒子に対する有効性が制限されます。どちらの手法も屈折率の不一致に基づいており、主にナノ粒子の外側の寸法を記述しています。
小角X線散乱(SAXS)は、散乱プローブとしてX線を使用し、その短波長は、〜0.1〜100nmの範囲にわたって測定を可能にします。観察された散乱強度対角度(従来は運動量移動q)にフィッティングすることで、PCMの形態(サイズと形状)および内部構造に関する情報が提供されます。絶対強度キャリブレーションが可能で、散乱強度をゼロ角度に外挿できる場合、PCM質量と凝集数も32と推定でき、SAXSは非常に汎用性の高い貴重な方法です。小角中性子散乱(SANS)は、長さのスケールの同様の範囲にわたって敏感であるが、専門施設でのみ利用可能であり、この記事33、34、35で明示的に議論されません。
近年、ベンチトップSAXS機器の登場が見られますが、これらの低コントラストサンプルのデータを高速に収集できるため、シンクロトロン源はPCMの特性評価に適していることがわかります。ユーザーの視点から高度なフォトンソース(米国アルゴンヌ国立研究所)でビームライン12-ID-BでPCM SAXSデータを取得するための簡単なプロトコルを提供します。このプロトコルは、ほとんどのシンクロトロン源に適用可能であるべきですが、実験を提案する前に現地スタッフと相談することを強くお勧めします。また、Irena36、イゴールプロのために書かれたマクロの自由なセットを使用して、データの削減と分析プロトコルを提供します。Irena には、SAXS データをモデル化するための多彩なフォーム ファクタが含まれており、PCM の複雑な散乱プロファイルを記述できるマルチコンポーネント モデルを構築できます (代表的な結果を参照してください (図 4参照)。Irenaには、オンラインで利用可能な包括的なドキュメントとチュートリアルもあります。以下の手順を試す前に、これらのチュートリアル、特に「2つの主要な散乱母集団を持つSAXSデータのモデリング」に精通することをお勧めします。
放射線の損傷はX線散乱の問題ですが、それを最小限に抑えるためにいくつかの対策を講じることもできます。特に、密閉キャピラリーではなく、データ取得中に流れるシリンジポンプとPCMサンプルを備えたフローセル設定を使用することをお勧めします。これにより、背景の減算も大幅に簡略化されます。また、サンプルの単一の体積が見るフラックスを制限し、暴露データの比較を可能にするために、1つの長いサンプルではなく、流れるサンプルの複数の暴露を取ることを提案します。
一般的に解釈にフィッティングを必要とする散乱技術とは対照的に、透過電子顕微鏡(TEM)は、試料を電子ビームを通過させ、シンチレーションスクリーン上に画像を投影することによって、ナノ粒子の実際の空間視覚的な画像を提供する(図5)。この記事では、2 つの TEM 手法のプロトコルを紹介します。Cryo TEMは、ミセルサンプルを薄い層の水晶体に凍結し、最小の異物で構造コンフォメーションを維持し、半径内のミセル≤〜10〜100nmに最適です。マイナス染色剤TEMは、グリッドの表面で乾燥した後、試料を取り囲むために重金属塩(例えばウラン)を使用する。密な汚れは、サンプルよりも多くの電子を散乱させ、コントラストを加え、サンプルの負の画像を生成します。Cryo TEMは、高品質の画像に推奨されます。しかし、それはより高価で、時間がかかり、十分なコントラストを提供しない可能性があります。これが懸念される場合は、陰性染色サンプルを使用する必要があります。それぞれの例を図 5に示します。
これらの技術のそれぞれは、異なる強みと制限を持つナノ粒子のわずかに異なる側面を報告します。光散乱は容易に利用でき、多くの場合、最も高速なアプローチですが、サイズと形状の解像度にかなりの制限があります。SAXS は、かなり高いスループットで、長さのスケールの広い範囲にわたって情報を提供できますが、データを取得するための特殊な装置と、それを解釈するためのモデリングが必要です。TEM イメージは解釈が簡単ですが、コントラストが制限され、本質的にスループットが低くなります。我々の経験では、複数の技術を用いて特性化を行うと、PCM特性について得られる情報が大幅に増加し、各々から得られたデータセットの解釈が簡素化されるということが分かってきた。例えば、SAXSとTEMは主にPCMの高密度コアを調べる一方、光散乱はナノ粒子の全体的な寸法を報告する。従って、それらを組み合わせることによって、コアおよびコロナサイズの両方の測定が可能になる。実空間画像を取得する TEM の機能は、根拠の真実データを提供して、あいまいな SAXS データをモデリングするための適切なフォーム ファクターを選択できるようにします。この資料では、4 つの手法すべてに対するプロトコルについて説明し、これらのプロトコルを使用して不明なサンプルを特徴付けるプロセスの例については、「説明」セクションで説明します。

<table><tbody><tr><td>70 mm 円濾紙</td><td>Whatman</td><td>1001-070</td><td>グリッド準備中のウィッキング用濾紙</td></tr><tr><td>カーボン フィルム TEM グリッド</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>CF200-Cu</td><td>TEM グリッド</td></tr><tr><td>DAWN</td><td>ワイアット テクノロジー</td><td>DAWN</td><td>MALS 機器</td></tr><tr><td>DNA オリゴヌクレオチド</td><td>統合 DNA ナノテクノロジーズ インク</td><td></td><td>カスタム オリゴヌクレオチド</td></tr><tr><td>レイシー カーボンTEM grid</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>LC200-Cu</td><td>TEM grid</td></tr><tr><td>Methoxy-poly(ethylene glycol)-block-poly(l-lysine hydrochloride) PEG5k - PLKC50</td><td>Alamanda Polymers Inc</td><td>mPEG5K-b-PLKC50</td><td>Example block copolymer</td></tr><tr><td>Milli-Q</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td>Ultrapure water</td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>核酸濃度</td></tr><tr>の測定に<td>ネガアクションピンセット</td><td>デュモン</td><td>N7</td><td>グリッド準備用ピンセット</td></tr><tr><td>パラフィルム「M」</td><td>ビーミス社</td><td>PM996</td><td>ラボフィルム</td></tr><tr><td>クワンティフォイル ホーリー カーボン TEM グリッド</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>Q210CR1.3</td><td>TEM グリッド</td></tr><tr><td>研究 ゴニオメーターとレーザー光散乱システム</td><td>ブルックヘブン・インスツルメンツ</td><td>BI-200SM</td><td>DLS/MALS 機器</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer G2 2K 0.5 mL</td><td>Thermo Scientific Pierce Protein Biology</td><td>87723</td><td>透析カートリッジ</td></tr><tr><td>小容量キュベット</td><td>ブルックヘブン・インスツルメンツ</td><td>BI-SVC</td><td>DLS/MALS用キュベット</td></tr><tr><td>Solarus 950 アドバンストプラズマシステム</td><td>Gatan</td><td>Solarus 950</td><td>TEMグリッド用プラズマシステム</td></tr><tr><td>Talos TEM</td><td>FEI</td><td></td><td>クライオサンプルに使用</td></tr><tr><td>Tecnaiスピリット TEM</td><td>FEI</td><td>スピリット</td><td>TEM 乾燥サンプルに使用される</td></tr><tr><td>ギ酸ウラニル</td><td>SPI-Chem</td><td>16984-59-1</td><td>TEM</td></tr><tr><td>Vitrobot</td><td>FEI</td><td>Vitrobot</td><td>クライオグリッド調製用ガラス化ロボット</td></tr></tbody></table>

高分子電解質複合体ミセルの組み立てと特徴付け

Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles

高分子電解質複合ミセル(PCM)、水溶液中の荷電ポリマーの自己集合によって形成されるコアシェルナノ粒子は、高分子相互作用の物理学を探索するための強力なプラットフォームを提供し、また、有望なソリューションを提供します。治療オリゴヌクレオチドを生体内に送達するという差迫した問題。PCMの予測構造特性関係の開発は、ナノ粒子自己集合中に強力な運動トラップが存在するため、困難であることが証明されています。本稿では、PCM構築のためのポリマーを選択するための基準について説明し、繰り返し可能な、低多分散性ナノ粒子の組み立てを可能にする塩アニールに基づくプロトコルを提供します。また、光散乱、小角X線散乱、電子顕微鏡によるPCM特性解析についても議論する。

上述の特性評価方法を説明するために、オリゴヌクレオチドから組み立てられたPCMの代表的な結果を示し、様々な長さと化学のブロックコポリマーをブロックする(図1)。図 2は、PCM コア サイズ (SAXS および TEM、図 4、図 5から決定される) が、帯電ブロックの長さによってどのように変化したかを示しています。図3は、比較的長いブロックコポリマーと短鎖オリゴヌクレオチドから形成された球状PCMのDLSデータおよびフィッティング結果を示す。図 4は、存在する複数の空間相関 (外部サーフェス、コア内散乱、ヘリックス間順序付け) のモデルを組み合わせることによって、SAXS の複雑な強度スペクトルを正確に適合させる方法と、MALS を使用して散乱測定を長い長さに拡張する方法を示してい...

我々は、設計、組み立て、および高分子電解質複合ミセル、高分子電解質および親水性荷電ブロックコポリマーによって形成されるコアシェルナノ粒子の設計、組み立て、および特徴付けのための代表的なデータを提供する。

Polyelectrolyte complex micelles (PCMs), core-shell nanoparticles formed by self-assembly of charged polymers in aqueous solution, provide a powerful ...

この方法は、逆に帯電したポリマーの自己集合体から形成されるナノ粒子である高電解質錯体ミセルの設計、組立、および特徴付けの全経路を記述する。高分子電解質自己集合に関する大きな課題は、運動トラップを回避し、ナノ粒子を特徴付けることです。我々が説明する塩焼鈍技術は、大きさと形状の両方で分散性の低いミセルの再現性のあるアセンブリを可能にし、光散乱、小角X線散乱、電子顕微鏡などの特性評価方法を記述する。治療用核酸の送達は、ナノメディシンにとって長年の課題です。これらの高分子電解質複合体ミセルは、中性高分子コロナがヌクレアーゼおよび免疫応答からそれらを保護するミセルのコアにそれらを隔離するために、核酸の強い負電荷を利用します。組み立て方法は、あらゆるタイプの荷電ポリマーに適用可能である必要があります。我々は、いくつかのポリアニオンとポリカシオンでそれらをテストし、特性化方法は、界面活性剤ナノ粒子および他の疎水性駆動システムを含む任意の自己組み立てナノ粒子に適用可能であるべきである。オリゴヌクレオチド溶液を摂氏70度で5分間インキュベートすることから始めます。インキュベーション後、室温で15分間冷却し、核酸を熱的にアニールし、次に20ミリモルを投入した濃度のジブロック共重合体の40マイクロリットルを加える。溶液をすぐに渦液にし、室温で5分間インキュベートする。塩アニールを行うために、オリゴヌクレオチド溶液に塩化ナトリウム溶液を加え、1モルの最終濃度を最大速度で10秒間ボルテックスします。混合物を室温で10分間インキュベートし、透析カートリッジに装填して進めます。装填する前に、永久的なマーカーでカートリッジをラベル付けし、少なくとも2分間緩衝液に浸して膜を水和する。反時計回りにねじってキャップを取り外し、ゲルローディングピペットチップを使用してサンプルをロードします。膜を軽く絞って余分な空気を取り除き、キャップを交換します。カートリッジを1X PBS 0.5モル塩化ナトリウム透析浴槽に入れ、両方の膜が浴に露出して浮遊していることを確認します。24時間後、カートリッジを1X PBSに移し、さらに24時間浸します。最終的な透析の後、槽からカートリッジを取り出し、キャップを取り外し、ピペットチップを入れたゲルでサンプルを取り外してサンプルを回収します。サンプルを清潔な1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに入れ、使用できる状態になるまで冷蔵します。原稿の指示に従ってDLS機器でサンプルを準備し、少なくとも1分間データを取得し、取得時間全体にわたってカウント率が一定であることを確認します。自己相関データを調べます。長い時間のベースラインは平坦で、自己相関曲線は最小限の散乱で滑らかでなければなりません。データのノイズは、より多くのデータを取得することで改善できます。Irenaを使

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