Name: 成人心臓線維芽細胞と筋線維芽細胞の分離と特徴付け (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: 学ぶ、マウス心臓から線維芽細胞と筋線維芽細胞を高純度に分離する方法。免疫蛍光、RT-PCR、蛍光細胞分選を用いて傷修復と線維症における細胞機能を解析する技術です。

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著者らは、αSMA-GFPマウスに対するイヴォ・カラジッチ博士に感謝したいと考えています。本論文で報告された研究は、国立衛生研究所の国立総合医学研究所(NIH)が、NIHの国立生物医学イメージング・バイオエンジニアリング研究所の賞番号R01GM118300(S.S.)の下で支援を受けました。賞番号R21EB019509(P.P.Y.)、および賞番号17SDG33630187(S.S.)の下で米国心臓協会の科学者育成助成金の下で。フローサイトメトリー分析は、ヴァンダービルト・イングラムがんセンター(P30 CA68485)とヴァンダービルト消化器疾患研究センター(DK058404)が支援するVUMCフローサイトメトリー共有リソースで行われました。

<ol><li>Ivey, M. J., Tallquist, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+Cardiac+Fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Journal%22%5BJournal%5D)">Defining the Cardiac Fibroblast.</a> Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).</li>
<li>Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biological+Basis+for+Cardiac+Repair+After+Myocardial+Infarction%3A+From+Inflammation+to+Fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction: From Inflammation to Fibrosis.</a> Circulatory Research. 119 (1), 91-112 (2016).</li>
<li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt1%2Fbetacatenin+injury+response+activates+the+epicardium+and+cardiac+fibroblasts+to+promote+cardiac+repair%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Wnt1/betacatenin injury response activates the epicardium and cardiac fibroblasts to promote cardiac repair.</a> EMBO Journal. 31 (2), 429-442 (2012).</li>
<li>Shinde, A. V., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblasts+in+myocardial+infarction%3A+a+role+in+inflammation+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Fibroblasts in myocardial infarction: a role in inflammation and repair.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 70, 74-82 (2014).</li>
<li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027(2019).</li>
<li>Kong, P., Christia, P., Saxena, A., Su, Y., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+specificity+of+fibroblast-specific+protein+1+in+cardiac+remodeling+and+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lack of specificity of fibroblast-specific protein 1 in cardiac remodeling and fibrosis.</a> American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology. 305 (9), 1363-1372 (2013).</li>
<li>Furtado, M. B., Nim, H. T., Boyd, S. E., Rosenthal, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((View+from+the+heart%3A+cardiac+fibroblasts+in+development%2C+scarring+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">View from the heart: cardiac fibroblasts in development, scarring and regeneration.</a> Development. 143 (3), 387-397 (2016).</li>
<li>Stellato, M., Czepiel, M., Distler, O., Blyszczuk, P., Kania, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+Isolation+of+Cardiac+Fibroblasts+From+the+Adult+Mouse+Heart+Using+Two-Color+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and Isolation of Cardiac Fibroblasts From the Adult Mouse Heart Using Two-Color Flow Cytometry.</a> Frontiers in Cardiovascular Medicine. 6, 105(2019).</li>
<li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified%2C+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulatory Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li>
<li>Saraswati, S., Marrow, S. M. W., Watch, L. A., Young, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+pro-angiogenic+functional+role+for+FSP1-positive+fibroblast+subtype+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Identification of a pro-angiogenic functional role for FSP1-positive fibroblast subtype in wound healing.</a> Nature Communications. 10 (1), 3027(2019).</li>
<li>Kalajzic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+alpha-smooth+muscle+actin+GFP+reporter+to+identify+an+osteoprogenitor+population%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Use of an alpha-smooth muscle actin GFP reporter to identify an osteoprogenitor population.</a> Bone. 43 (3), 501-510 (2008).</li>
<li>Travers, J. G., Kamal, F. A., Robbins, J., Yutzey, K. E., Blaxall, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Fibrosis%3A+The+Fibroblast+Awakens%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac Fibrosis: The Fibroblast Awakens.</a> Circulatory Research. 118 (6), 1021-1040 (2016).</li>
<li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li>
<li>Montesano, R., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+beta+stimulates+collagen-matrix+contraction+by+fibroblasts%3A+implications+for+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor beta stimulates collagen-matrix contraction by fibroblasts: implications for wound healing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 85 (13), 4894-4897 (1988).</li>
<li>Goldsmith, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+of+fibroblasts+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Organization of fibroblasts in the heart.</a> Developmental Dynamics. 230 (4), 787-794 (2004).</li>
<li>Bagchi, R. A., Lin, J., Wang, R., Czubryt, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+fibronectin+gene+expression+in+cardiac+fibroblasts+by+scleraxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of fibronectin gene expression in cardiac fibroblasts by scleraxis.</a> Cell Tissue Research. 366 (2), 381-391 (2016).</li>
<li>Goodpaster, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunohistochemical+method+for+identifying+fibroblasts+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">An immunohistochemical method for identifying fibroblasts in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (4), 347-358 (2008).</li>
<li>Chapman, D., Weber, K. T., Eghbali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+fibrillar+collagen+types+I+and+III+and+basement+membrane+type+IV+collagen+gene+expression+in+pressure+overloaded+rat+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of fibrillar collagen types I and III and basement membrane type IV collagen gene expression in pressure overloaded rat myocardium.</a> Circulatory Research. 67 (4), 787-794 (1990).</li>
<li>Vasquez, C., Benamer, N., Morley, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardiac+fibroblast%3A+functional+and+electrophysiological+considerations+in+healthy+and+diseased+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The cardiac fibroblast: functional and electrophysiological considerations in healthy and diseased hearts.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 57 (4), 380-388 (2011).</li>
<li>Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1+expression+by+cardiac+fibroblasts%3A+lack+of+association+with+myofibroblast+contractile+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 42 (5), 991-1000 (2007).</li>
<li>Kanisicak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+lineage+tracing+defines+myofibroblast+origin+and+function+in+the+injured+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart.</a> Nature Communications. 7, 12260(2016).</li>
<li>Pinto, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+Cardiac+Cellular+Composition%5BTitle%5D)+AND+%22Circulatory+Research%22%5BJournal%5D)">Revisiting Cardiac Cellular Composition.</a> Circulatory Research. 118 (3), 400-409 (2016).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

線維芽細胞は、細胞の異種群であり、多様なマーカーの集合によって同定される。線維芽細胞の同定に用いられてきたタンパク質マーカーは、フィディスコジジンドメイン受容体2(DDR2)、フィブロネクチン、ビメンチン、コラーゲンIおよびIII、およびthy1 15、16、17、18、19、20である。15,16,17,18,19,20ビメンチンは、損傷していない静止性心筋線維芽細胞を同定するために使用されてきたのに対し、線維芽細胞特異的タンパク質1、αSMA、およびペリオスチンは傷害誘発性活性化線維芽細胞を同定することが示されており、αSMAは活性化線維芽細胞66、12、21<sup cl...

心臓線維芽細胞は、間葉起源の細胞、ホメオスタシス中の心臓アーキテクチャの維持に加えて心臓における電気伝導および機械的力を維持する上で重要な役割を果たす1。傷害後、これらの細胞は活性化され、増殖し、細胞外マトリックス(ECM)タンパク質2を産生する。多くの前臨床試験では、負傷した心臓3の構造的完全性を維持する重要な細胞レギュレータとして線維芽細胞が明らかになり、ECMタンパク質の未チェック産生および堆積を担う主なエフェクター細胞が、硬い瘢痕形成および心不全4を引き起こした。線維芽細胞は細胞の異種グループであり、線維化不適応性から修復機能を解剖することは困難です。近年、心筋損傷後の2つの異なる線維芽細胞サブタイプの機能的不均一性が定義されており、異なる線維芽細胞サブタイプを単離し、創傷治癒におけるそれらの役割を研究する可能性を示す5。
純粋な線維芽細胞集団を得ることは、修復および線維化における機能的役割をデリデートする上で極めて重要である。しかし、他の細胞型を認識する複数の線維芽細胞マーカーの存在は、実質的に純粋な線維芽細胞集団6を単離することが困難となる。いくつかのエレガントな研究は、怪我をしていない心筋症や負傷した心筋から心臓線維芽細胞を分離する巧妙な方法を考案しました。線維芽細胞を濃縮する最も一般的かつ確立された方法は、酵素組織消化に続く選択的接着を介してである 7.
また、細胞表面抗原に基づく線維芽細胞の蛍光活性化細胞選別(FACS)が8に記載され、正常に説明されている。この研究では、酵素消化に続いて、間葉系細胞を、マウスの心臓から系統陰性(Lin: Ter119-CD45 -CD31−)およびgp38陽性(gp38+)としてソートした。−+Gp38+ve細胞は、col1α1および他の間葉マーカーのそれらの共発現に基づいて線維芽細胞であることが確認された。ほとんどの組織消化はペトリ皿の中で心室を解剖した後に完了するが、最近の研究では、線維芽細胞を含む筋細胞および非筋細胞を単離するために左心室の直接針酵素灌流の使用を調査した。次いで線維芽細胞を選択的接着によってこの場合に単離した。
このプロトコルは、3つの方法を用いた線維芽細胞の分離および濃縮について説明する。1つ目は、酵素消化後の線維芽細胞の選択的接着を含む既に確立された方法である。第2の方法は、主に筋線維芽細胞を発現する傷害誘発アルファ平滑筋を単離するために使用される。第3の方法は、造血細胞および内皮細胞の酵素消化心細胞懸濁液の逐次的な磁気枯渇を伴う。枯渇後、線維芽細胞/筋線維芽細胞は、磁気ビーズを使用して抗原MEFSK4の存在に基づいて単離される。近年、MEFSK4は、活性化線維芽細胞と同様に静止症に存在する抗原として説明されており、線維芽細胞の同定および単離に適したマーカーとなっています。当然ながら、ここで説明するすべての方法には固有の制限があります。したがって、フロー解析、免疫染色、および半定量的リアルタイムPCRにより、単離された細胞集団の純度を確認することを強くお勧めします。しかし、これらの方法論は、上に拡大することができ、重要な実験のために線維芽細胞および筋線維芽細胞集団を利用する前に、他の汚染集団を除外するために追加のマーカーを追加することができる。

<table><tbody><tr><td>試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>系抗真菌剤(アンホテリシンB-可溶化;Fungizone)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9528</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>Sigma</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>塩化</td><td></td><td></td><td></td>カルシウム</tr>ク<tr><td>エン酸緩衝液</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼブレンド(リベラーゼブレンドザイム3 TH)</td><td>ロシュ応用科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DDI水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>L-グルタミンおよび HEPES Life テクノロジーを使用した</td><td></td> DI 水 DMEM-F12 11330057 <td></td></tr><tr><td>Dnase I(20U/mL)</td><td>BioRad</td><td>7326828</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+ および Mg2+</td><td>Gibco</td><td>13190-144</td><td></td></tr><tr><td>70% エタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr> FC <tr><td></td> ブロッカー (精製済み)<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗マウス CD16/CD32)</td><td>とんぼバイオサイエンス</td><td>70-0161</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>ライフテクノロジー</td><td>16000044</td><td></td></tr><tr><td>10% ヤギ血清</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ハンクの平衡塩溶液 (HBSS) with Ca2+ and Mg2</td><td>+Corning</td><td>21-023-CV</td><td></td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Corning</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Krebs-Henseleit Buffer powder</td><td>Sigma</td><td>K3753</td><td></td></tr><tr><td>マイコプラズマ予防薬(プラスモシン)</td><td>Invivogen</td><td>ant-mpp</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>1x リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x 赤血球溶解緩衝液</td><td>Miltenyi</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td>スローフェード封入剤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>アジ</td><td></td><td></td><td></td>化ナトリウム</tr>重<tr><td>炭酸</td><td></td><td></td><td></td>ナトリウム</tr><tr><td>TGF&β;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルーステイン (0.4%)</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Type 1 Rat Collagen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>7AAD (ストック: DMSO 中の 1 mg/mL 溶液)</td><td>Molecular Probes</td><td>A1310</td><td>希釈 = 1:1000;RRID =</td></tr> <tr><td>CD45-APC</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>559864</td><td>希釈= 1:200;RRID = AB_398672</td></tr><tr><td>CD31-PE</td><td>BD Bioscience</td><td>553373</td><td>希釈率 = 1:200;RRID = AB_394819</td></tr><tr><td>CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>希釈 = 1:250;RRID = AB_394816</td></tr><tr><td>CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>553076</td><td>希釈率 = 1:250;RRID = AB_394606</td></tr><tr><td>COL 1&alpha;1</td><td>MD Bioproducts</td><td></td><td>203002希釈 = 1:1000;RRID =</td></tr><tr><td>ゴースト色素バイオレット510(製剤:1 uL /DMSOでテスト)</td><td>とんぼバイオサイエンス</td><td>13-0870</td>希釈<td>= 1:1000;RRID =</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes</td><td>A11029</td><td>希釈 = 1:200;RRID = AB_138404</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ-Cy3</td><td>Southern Biotech</td><td>4050-02</td><td>希釈率 = 1:200;RRID = AB_2795952</td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ-FITC</td><td>ジャクソン免疫研究所</td><td>711-165-152</td><td>希釈率 = 1:200;RRID = AB_2307443</td></tr><tr><td>ヤギ抗ラット Alexa Fluor 488</td><td>分子プローブ</td><td>A11006</td><td>希釈 = 1:200;RRID = AB_2534074</td></tr><tr><td>ヤギ抗ラット Alexa Fluor 647</td><td>Thermo-Fisher</td><td>A21247</td><td>希釈 = 1:200;RRID = AB_141778</td></tr><tr><td>Periostin</td><td>Santa Cruz</td><td>SC67233</td><td>希釈率 = 1:100;RRID =</td></tr><tr><td>AB_2166650 Vimentin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V2258</td><td>希釈 = 1:200;RRID = AB_261856</td></tr><tr><td>&-平滑筋アクチン (&alpha;SMA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2547</td><td>希釈 = 1:1000;RRID = AB_476701</td></tr><tr><td>線維芽細胞特異的タンパク質 1 (FSP1)</td> <td>Millipore 07-2274</td><td>07-2274</td><td>希釈率 = 1:100;RRID = AB_10807552</td></tr><tr><td>CD45磁気ビーズ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-052-301</td><td></td></tr><tr><td>CD31 磁気ビーズ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-087-418</td><td></td></tr><tr><td>アンチフィーダー細胞-APC (MEFSK4)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-102-900</td><td>希釈= 1:100;RRID =</td></tr><tr><td>AB_2660619 抗 APC ビーズ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-855</td><td></td></tr><tr><td>ラット IgG-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-103-034</td><td>希釈 = 1:100;RRID = AB_2661598</td></tr><tr><td>ロバ抗ラット Alexa Fluor405</td><td>Abcam</td><td>ab175670</td><td>希釈 = 1:100</td></tr><tr><td>抗 AN2/NG2</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-455</td><td>希釈 = 1:11;RRID = AB_2651235</td></tr><tr><td>その他の材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro;m フィルター</td><td>Thermo Scientific</td><td>723-2520</td><td></td></tr><tr><td>10 cm2 細胞培養ディッシュ</td><td>コーニング</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>10 mL ピペット</td><td>フィッシャーブランド</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>40 & マイクロ;m セルストレーナー</td><td>フィッシャーブランド</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>5 mL ピペット</td><td>フィッシャーブランド</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>50 mL コニカルチューブ</td><td>ファルコン</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメトリーチューブ</td><td>ファルコン</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>フォーセプス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ロッカー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>シングルエッジブレード</td><td>PAL</td><td>62-0177</td><td></td></tr><tr><td>外科用ハサミ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP-&alpha;SMAレポーターマウス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACSセパレーター</td><td></td><td></td><td></td></tr>磁場<tr><td>MACS分離カラム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>カバースリップQaigen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rneasyミニキット</td><td>Qaigen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Ambion RNAqueous Micro Total Isolation Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1931</td><td></td></tr><tr><td>BioRad iScript cDNA Syntehsis Kit</td><td>BioRad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>48-well Plate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30G Needle</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 Laser Flowサイトメトリーマシン (BD FACSAria III)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow Data Acquisition Software (BD FACSDiva Software v8.0a)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow Data Analysis Software (FlowJo Software)</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

成人心臓線維芽細胞と筋線維芽細胞の分離と特徴付け

Isolation and Characterization of Adult Cardiac Fibroblasts and Myofibroblasts

傷害に応答した心臓線維症は、創傷治癒に対する生理学的応答である。線維症を軽減する線維芽細胞サブタイプを研究し、標的にするための努力がなされている。しかし、線維芽細胞の研究は、活性化線維芽細胞と同様に静止を同定するために普遍的に許容される線維芽細胞マーカーの欠如のために妨げられてきた。線維芽細胞は異種細胞集団であり、分離して特徴付けることを困難にする。提示されたプロトコルは、傷つけていないマウスの心臓から線維芽細胞および筋線維芽細胞を豊かにする3つの異なる方法を記述する。標準的で信頼性の高いプロトコルを使用して線維芽細胞を分離することで、ホメオスタシスと線維症変調における役割の研究が可能になります。

αSMA-GFPレポーターマウスを用いた筋線維芽細胞の分離を実証するフロー・ガッティング・スキーム 傷つけていない心臓は、αSMA-GFPレポーターマウスモデルで検出可能なGFP+細胞を示さなかった。したがって、GFPチャネルポスト補償のバックグラウンド信号のゲートを確立するために使用されました(図2)。αSMA+細胞は、MIの10日後に負傷した左心室からのGFP発現の存在に基づいて選別した。内皮のごく一部 (GFP+/CD31+ 細胞;SD = 3.8% ± 0.0164;n = 5) および造血 (GFP+/CD45+ 細胞;SD = 3.18% ± 0.0112;n = 5) 細胞は、負傷したαSMA-GFPマウスの心臓においてもGFPを発現した(図2A)。しかし、GFP+/CD31-/CD45-細胞はAN2、ペリサイトマーカーを発現しなかった。
<p class="jove_conten...

線維芽細胞の純粋な集団を得ることは、創傷修復および線維化におけるその役割を研究するために重要である。ここでは、線維芽細胞と筋線維芽細胞を、傷つけていないマウスの心臓から分離し、その後、免疫蛍光、RTPCR、蛍光支援細胞選別による純度と機能性の特徴付け、およびコラーゲンゲル収縮。

Cardiac fibrosis in response to injury is a physiological response to wound healing. Efforts have been made to study and target fibroblast subtypes that ...

このプロトコルは、静止と傷害誘発性活性化線維芽細胞集団の両方を有意な純度で分離することを可能にする。この技術の主な利点は、即興のための柔軟性です。フローは、ビーズベースの単離と同様に、汚染細胞に対する抗体を組み込んで、単離された標的細胞からそれらを除外することができる。この技術は、主に心臓線維芽細胞の分離に使用されます。しかし、他の組織から線維芽細胞を単離するために利用することができる。この手順を実証するには、学部のインターンであるメイリング・メルツァーと、私の研究室の研究アシスタントであるデビッド・ベアーです。解剖中に6つの心臓を貯蔵するための6ウェルプレートを準備するには、各井戸に冷たいKHBの2ミリリットルを分配し、氷の上にプレートを置きます。70%エタノールでボディをスプレーします。腹側が実験者に向かるように向きます。干渉を防ぐために付属物を固定します。肝臓を突き刺さずに、腹の皮膚と筋肉を切り開きます。胸骨に向かって垂直に切り、心臓を突き刺さずに胸郭を慎重に開けます。次に、胸部を切り抜いて心臓を露出します。鉗子を使用して、心臓を胸からそっと持ち上げ、心臓の外側に付着した肺または余分な組織を切り取ります。左心室を分離します。解剖ごとに、6ウェルプレートの別々のウェルに心室を置きます。まず、過剰な血液を除去するためにKHBの心室を繰り返し圧迫し、攪拌するために鉗子を使用する。心室を清潔で無菌の10センチメートル平方プレートに移します。次に、片刃の刃を使用して、すぐに小片に心室をミンチ。コラゲターゼ消化カクテルを1ミリリットル加え、ミンチを続けます。1ミリリットルのマイクロピペットで転写するのに十分な小さい場合は、50ミリリットルの円錐管に移します。2ミリリットルのカクテルでプレートを2回洗い、チューブに移します。チューブを30分間インキュベートし、5ミリリットルのピペットを用いて原稿に記載されているように細胞を再懸濁する。最初の再懸濁液の後、細胞を15分間インキュベートし、10ミリリットルのピペットを使用して再び再懸濁する。次に、新しい50ミリリットルの円錐チューブの上に40マイクロメートルの細胞ストレーナーを置き、1〜2ミリリットルのKHBで湿らせ、ストレーナーをプライミングします。消化懸濁液に25ミリリットルのKHBを加え、再中断する。ストレーナーを通して懸濁液をフィルターし、必要に応じてストレーナーを交換します。濾液を400g、摂氏4度で10分間遠心分離する。上清を取り除き、1心臓当たり5ミリリットルのバッファーを使用して1x RBCライシス緩衝液中のペレットを再懸濁させた。懸濁液を室温で2分間インキュベートした後、室温で10分間400回gで懸濁液を遠心分離する。上清を取り出し、KHBの1ミリリットルでペレットを再懸濁します。その後、9ミリリットルのKHBを懸濁液に加える。プライミングされた40マイクロメートルのセルストレーナーを通して、新しい50ミリリットルの円錐管に懸濁液をフィルターします。円錐管を室温で10分間400回gで遠心する。最後に、上清を取り除き、1ミリリットルの線維芽細胞培地またはPBS中のペレットを再懸濁させた。細胞数が決定された後、線維芽細胞は、原稿に記載された3つの異なる方法によって懸濁液から単離することができる。差動めっきによる分離を開始するには、各ウェルに2ミリリットルの線維芽細胞培地を加えて6ウェルプレートを調製します。プレートを旋回して井戸底を覆います。マウス心臓細胞がPBSで懸濁される場合、遠心分離機および心臓あたり1ミリリットルの線維芽細胞培地中で再懸濁する。各ウェルに1つの心臓に相当する細胞懸濁液を1ミリリットル加えます。均一に細胞を分配するためにプレートを旋回します。井戸あたり最大4ミリリットルの総体積のために井戸あたり線維芽細胞培地の追加1〜2ミリリットルを追加します。摂氏37度で4時間インキュベートします。線維芽細胞は選択的にウェルに付着するので、それらは培地を取り除いて捨てて単離することができる。残りの取り付けた細胞を2ミリリットルのPBSで洗い、それからウェルあたり2〜4ミリリットルの無菌線維芽細胞培地を加える。コンフルエントまで37度でインキュベートし、2~4日ごとにメディアを交換します。CD45陽性造血細胞の磁気標識と分離を開始するために、500倍gのマウス心臓細胞の懸濁液を5分間遠心分離する。上清を取り除き、細胞ペレットを平衡バッファーの1ミリリットルで再懸濁させた。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。再び細胞を遠心した後、細胞ペレットを平衡バッファーに再懸濁させる。CD45正の磁気ビーズを加え、よく混ぜます。摂氏4度で少なくとも15分間インキュベートする。平衡バッファーを加えて、摂氏4度で10分間500倍の遠心分離機を加えて細胞を洗います。上清を取り除き、ヘモサイトメーターを用いて細胞を数える。平衡バッファー内のペレットを再懸濁します。細胞凝集が分離カラムを詰まらせるのを防ぐために、40マイクロメートルのフィルターを通して懸濁液を通過させる。次に、適切なセパレータの磁場に分離カラムを配置し、少なくとも3ミリリットルのPBSでカラムを平衡化する。カラムを通して細胞懸濁液を注ぎ、ラベルのない細胞を含むフロースルーを15ミリリットルの円錐チューブに集めます。3ミリリットルの平衡バッファーでカラムを3回洗浄し、洗浄液とフロースルーを組み合わせます。区切り記号から列を取り外し、15 ミリリットルの円錐管にカラムを置きます。標識したCD45陽性細胞を、5ミリリットルの平衡バッファーをカラムにピペットし、カラムをしっかりと突き出す。500倍gで流れ管のチューブとのチューブを遠心分離する。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数えます。分離を完了するには、CD31陽性内皮細胞およびMEFSK4陽性線維芽細胞の原稿のプロトコルに従ってください。蛍光活性化細胞選別は、心筋梗塞後のα-SMA-GFPマウス心臓から単離された単一細胞に対して行った。代表的な格言方式は、CD31、CD45、またはAN2を共同発現するGFP陽性細胞を示す。負傷したマウスの心臓では、内皮細胞および造血細胞のごく一部がGFPを発現した。しかし、GFP陽性/CD31陰性/CD45陰性細胞は、AN2、ペリサイトマーカーを発現しなかった。gFP陽性細胞はα-SMA、コラーゲン1α1、ペリオスチン、ビメンチンを発現した。選択的接着によって単離された傷ついていない線維芽細胞は、ビメンチンを発現したが、α-SMA、ペリオスチン、またはコラーゲン1α1の発現を示さなかった。けがのない線維芽細胞と活性化線維芽細胞の両方がMEFSK4抗原を発現した。両方の負傷していない線維芽細胞は、選択的接着によって単離され、筋線維芽細胞は、α-SMA-GFPマウスから単離および選別され、コラーゲンを収縮させる能力を示した。インキュベーションの前に組織を十分にミンチすることが重要です。ビーズベースの分離の前に、細胞凝集を防ぐために40マイクロメートルのフィルターを通して懸濁液を通過することが重要です。この方法で精製された細胞は、高いレベルの純度を確保するために、ペリサイト特異的抗体に関連する磁気ビーズを使用してさらに精製することができる。新しいビーズ共役抗体とレポータートランスジェニックマウスの利用により、これらの技術を利用して、線維芽細胞だけでなく、異なる細胞集団を単離して研究することができます。

isolation-characterization-adult-cardiac-fibroblasts

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

成人心筋細胞は動物の心臓から分離し、数日間培養することができる主要な細胞である。この培養期間内にアデノウイルス遺伝子導入は、遺伝的に符号化されたバイオセンサー（GEBs）または蛍光融合タンパク質を発現させることができる。両方のアプローチは、共焦点顕微鏡による細胞の調査を許可する。...

共焦点イメージングのための成人心筋細胞の単離と遺伝子操作

ここでは、ランゲンドルフ灌流システムを使用して、成体マウスcardiomyoctyesの単離を記載している。得られた細胞は、電気的に休止状態、のCa 2 +·トレラントであり、培養およびアデノ又は遺伝子発現を操作するためのレンチウイルスでトランスフェクトすることができる。それらの機能は、MMSYSシステムおよびパッチクランプ技術を用いて分析することができる。...

アイソレーション、文化、および成体マウスCardiomyoctyesの機能解析

ヒトの筋肉に由来する主な接着細胞タイプは、筋原性細胞と線維芽細胞です。ここでは、CD56抗原に基づく磁気活性化細胞ソーティングを用いて細胞集団を濃縮します。その後、特異的抗体による免疫標識と画像解析技術の使用により、個々の細胞の細胞質および核特性を定量化できます。...

ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

私たちは、筋線維芽細胞の表現型を持つマウスとヒトの食道間質細胞の初代培養物を生成するためのプロトコルを提示します。培養細胞は紡錘形の形態を持ち、α-SMAとビメンチンを発現し、上皮細胞、造血細胞、内皮細胞表面マーカーを欠いています。特性評価された間質細胞は、上皮-間質相互作用の機能研究に使用することができます。...

マウスおよびヒト食道から筋線維芽細胞の単離

線維芽細胞の振る舞いは、さまざまな臨床実体の根底にありますが、それらは主にその固有の不均一性のために、特徴付けられていないままです。従来の線維芽細胞研究は、in vivoでの線維芽細胞の挙動をマスキングするin...

FACSによるマウス皮膚線維芽細胞の分離

ラット心臓から様々な心臓細胞型を単離するためのいくつかのプロトコールが開発され、記載されている。ここでは、単一の調製物から高品質の主要な心臓細胞型（心筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞）の単離を可能にし、実験コストを削減する最適化プロトコルが記載されている。...

成体ラット心臓からの高品質心筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞の同時単離

ここでは、分離と培養ラット心室心筋細胞 (ARVC) のためのプロトコルを提案する.分離 ARVC は、短期および長期の栽培に使用できます。分離と ARVC...

ラット心筋細胞の分離と培養

ここでは、保存された駆出率とメタボリック症候群関連心不全ラットモデルから単一セル心房心筋細胞を分離するため、蛍光ベースの最適化手順をについて説明します。心腔の内圧の手動調節、機能そのまま心筋興奮収縮連関研究に適した屈する実装されます。...

保存された駆出率とメタボリック症候群関連心不全ラットモデルから心房の心筋細胞の単離

我々は、初心者(例えば、学生)が実行可能な、簡単で迅速かつ信頼性の高い方法で原発性成人線維芽細胞を分離するためのプロトコルを提示する。この手順は、酵素組織の消化と機械的撹拌を超音波と組み合わせて、一次線維芽細胞を得ます。プロトコルは、特定の実験要件(例えば、ヒト組織)に容易に適合させることができる。...

超音波増強原発性成人線維芽細胞分離

単成マウス心臓の心房と心室の両方から筋細胞と非筋細胞を同時に分離する方法について説明する。このプロトコルは、高生存性心筋細胞および非筋細胞の一貫した収量をもたらし、フェノタイピングおよびインビトロ分析のための最適な細胞特異的培養条件を詳述する。...

心房筋細胞、心室筋細胞、および非筋細胞の同時分離と培養

組織のクリアの精製方法が開発され、成体マウスの心臓に適用された。この方法は、遺伝的レポーター戦略に起因する標識された線維芽細胞蛍光を維持しながら、緻密な自己蛍光心臓組織をクリアするように設計された。...

健康で負傷したマウス心臓における三次元線維芽細胞組織のための精製されたCLARITYベースの組織クリアリング

学ぶ、マウス心臓から線維芽細胞と筋線維芽細胞を高純度に分離する方法。免疫蛍光、RT-PCR、蛍光細胞分選を用いて傷修復と線維症における細胞機能を解析する技術です。

成人心臓線維芽細胞と筋線維芽細胞の分離と特徴付け

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