ショウジョウバエを用いたヘテロクロマチン促進薬の同定のためのスクリーニング方法
2020年3月12日
ショウジョウバエは、がん治療の潜在的な用途を有する薬剤のスクリーニングに適した広く使用されている実験モデルです。ここでは、ヘテロクロマチン形成を促進する低分子化合物をスクリーニングする方法としてショウジョウバエ可変眼色表現型を用いるものについて述べている。
現在ヘテロクロマチン形成を促進する際に確立されている薬はありません。.ここでは、このプロセスを促進する低分子化合物を同定するための簡単で効率的な方法を提示する。当社のスクリーニングプロトコルは、ヘテロクロマチン促進薬物同定のための簡単で安価で、生体内システムに従いやすい。
ヘテロクロマチンの形成を促進する化合物を同定することは、治療やがん治療のメカニズムの発見につながる可能性があります。この費用対効果は、ショウジョウバエにおけるヘテロクロマチン促進化合物を同定するために測定されており、細胞スクリーニングの最高細胞プールに対する予防措置であるため、ヒットを数えるためにも使用できる。このショウジョウバエTranSheetシステムは、ハエに存在するヘテロクロマチンの量に反比例する多様な眼色表現型を生成するので、当社のスクリーニングプロトコルは、迅速なパイロットスクリーンにも有用である可能性があります。
手順のデモンストレーションを手伝うのは、私たちの研究室の学部生ケニー・ダオです。適切な溶媒を使用してスクリーニングのための薬物ライブラリーを同定し、準備した後、所望の濃度は、25×95ミリメートルの食物バイアルで3つ以上の処女雌ハエを持つ3つの雄のハエを渡る。標準的なショウジョウバエ食品培地の9ミリメートルで。
各薬剤に対して3つのレプリカバイアルを設定します。画面にコントロール バイアルを 1 つ追加します。そして、ハエが室温で2日間卵を産むことを許可します。
十字架の2日目に、二酸化炭素の短いバーストでハエを麻酔します。そして、70%エタノールを含むボトルに親のハエを捨てます。次に、初期ストックから各薬物化合物を希釈し、水中の33%DMSOでマイクロモル最終濃度に出席する。
そして、フライフードの上に、薬物の60マイクロリットル、またはコントロール33%DMSOを単独で加える。次に、バイアル内に親ハエが存在しないか確認します。そして、適切なバイアルに薬物溶液を追加します。
F1ハエが出現した2日後、一度に1つのバイアルから麻酔付きハエを濾過紙の下から二酸化炭素を濾過する多孔質解剖パッドに移す。解剖顕微鏡の下で、各ハエ全体を調べ、巻き毛のo-支配的な巻き毛の翼表現型の欠如によってヘテロ接合性の雄の全てを識別する。1から5のスケールで各ヘテロ接合男性の目の色をスコア。
1つのスコアが5%未満の赤散乱目総表面積に割り当てられていると。6〜25%の赤いスポットの目の総表面積を持つハエに2つのスコアを追加します。26〜50%の赤い斑点目の総表面積を持つ飛ぶ3。
4は51〜75%の赤い斑点目の総表面積を持つ飛ぶ。そして、75%以上の赤い斑点目の総表面積を持つ5つのハエ。次に、三重で採点された各バイアルからすべての男性の平均色指数を計算します。
化合物が実際にヘテロクロマチン形成を促進することを確認するために、ウェスタンブロッティングなどの異なる検証技術を、行うことができる。本代表的実験では、低分子薬物ライブラリーである腫瘍学セット3は、97のFDA認可腫瘍学薬で構成され、ショウジョウバエメラノガスターのDX1株を用いてスクリーニングした。スクリーニングアッセイによれば、メトトレキサートは、ライブラリー内でE7としてコード化され、Dx1株内で最も変動を引き起こした。
メトトレキサートが将来の癌標的治療のための最も有望なヘテロクロマチン促進薬である可能性を示唆する。この化合物がヘテロクロマチン変換を促進することを更に確認するために、ウェスタンブロットデータが行われた。ヘテロクロマチン関連タンパク質のアップ調節を実証し、H3K9トリメチル化、スクリーニング結果を検証した。
重要なステップは、所定の研究ルートに従って1〜5のスケールで白い11-18 DX1ヘテロ接合オスのハエのそれぞれの目の色を採点することです。ウエスタンブロットまたは免疫染色を使用してヒットを確認できます。ヘテロクロマチンの形成を促進すると疑われる化合物の発見は、ヒト患者におけるがんの発症と臨床試験のIV遺伝的メカニズムの発見にもつながる可能性がある。
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概要
本研究では、ショウジョウバエを用いてヘテロクロマチン形成を促進する低分子化合物をスクリーニングする方法を提示します。この手法では、斑点状の眼の色表現型をヘテロクロマチンレベルの指標として利用することで、薬剤同定のための簡便かつ効率的なin vivoシステムを提供します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 薬剤スクリーニング
- 遺伝学
背景
- ヘテロクロマチンは、遺伝子調節および細胞機能において重要な役割を果たしています。
- ヘテロクロマチン形成を促進するための現在の手法は限られています。
- ショウジョウバエは、遺伝学的研究における効果的なモデル生物として利用されています。
- 斑状の眼色表現型は、生体内におけるヘテロクロマチンのレベルを示す指標となります。
研究目的
- ヘテロクロマチン形成を促進する化合物を特定するための、費用対効果の高い手法を開発すること。
- 潜在的ながん治療薬をスクリーニングするためのモデルとして、ショウジョウバエを利用すること。
- 簡便で低コストなプロトコルを確立すること。
使用した手法
- ショウジョウバエを用いた低分子化合物のスクリーニング。
- ヘテロクロマチンの存在の指標として、眼の色などの表現型を評価する。
- 簡便なin vivoスクリーニングプロトコルの実施。
- 眼の色とヘテロクロマチンレベルの相関性を評価する。
主な結果
- このスクリーニングプロトコルにより、ヘテロクロマチン形成を促進する化合物を正常に同定できた。
- 斑状の眼の色表現型は、ヘテロクロマチンの量と相関していた。
- この手法は、薬剤同定において効率的かつコスト効率が良いことが証明された。
- がん治療への潜在的な影響について検討した。
結論
- 本研究は、がん研究における薬剤スクリーニングの新しいアプローチを提示します。
- Drosophilaは、ヘテロクロマチン形成を促進する化合物の同定に効果的に利用できます。
- これらの知見は、がんのメカニズムと治療法の理解に寄与する可能性があります。
よくある質問
産業上の重要性
本手法は、がん治療に向けたエピジェネティック創薬における課題を解決し、ヘテロクロマチン形成を促進する化合物を特定するためのコスト効率の高いin vivoシステムを提供します。ショウジョウバエの眼の斑（variegation）を定量的リードアウトとして活用することで、エピジェネティックなメカニズムの初期段階におけるターゲットバリデーションおよびメカニズム的なリスク低減を可能にします。このアプローチは、腫瘍学に特化した創薬プログラムにおけるリード化合物の同定とポートフォリオの選別において、予測精度の向上を支援します。
バイオファーマ研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：がんにおけるヘテロクロマチン形成およびエピジェネティック制御に関連する治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値：エピジェネティック修飾因子の機能的ターゲットバリデーションのための、簡便で安価なin vivoシステムを提供する。
- 予測的価値：化合物の効果をH3K9三メチル化などのヘテロクロマチン関連タンパク質の変化と結びつけることで、生物学的リスク低減を支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 化合物の優先順位付けのため、ヘテロクロマチン量と相関する定量的な眼の色スコア（1～5）を算出する。
- 運用上の価値： 3本のバイアルによるスコアリングと平均色指数の算出を用いた、標準化され再現性のあるプロトコルを提供する。
- アッセイの実用性： 最小限の設備で、疾患に関連した系における信頼性の高い化合物評価を可能にする。
翻訳および前臨床研究
- トランスレーショナル価値：保存されたエピジェネティックな経路を通じて、ショウジョウバエでの知見をヒトの癌メカニズムに関連付けます。
- 前臨床の継続性：ウェスタンブロッティングなどの直交法を用いてヒット化合物を検証することで、リスクを調整した進展決定を支援します。
- メカニズムによるリスク低減：同定されたヘテロクロマチン促進化合物を通じて、癌発生のエピジェネティックなメカニズムの解明に寄与します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、初期探索からリード化合物特定までの段階に適合し、オンコロジープログラムにおけるヒット化合物からリード化合物への最適化プロセスに役立つエピジェネティックスクリーニングデータを提供します。
- 探索生物学： ヘテロクロマチン形成のリードアウトを通じて、エピジェネティックな標的の仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング： 化合物ライブラリーの評価に向けた、定量的でスケーラブルな出力を備えたアッセイ準備済みの生物学的システムを提供します。
- 分析： 平均カラーインデックスおよび3反復バイアル結果の統計分析により、データ駆動型の比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： ヘテロクロマチンタンパク質バイオマーカーを用いてヒット化合物を確認することで、前臨床検証へと繋げます。
- エンタープライズでの再利用： 複数の腫瘍学標的クラスに対応した、再利用可能なエピジェネティック・スクリーニングプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：エピジェネティック制御におけるメカニズムの曖昧さを排除することで、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を高める。
- 運用的価値：簡便なin vivoスコアリングと繰り返し試験により、標準化、再現性、およびスケーラビリティを実現する。
- 戦略的価値：エピジェネティック創薬におけるgo/no-go決定と資本効率を改善し、後期の生物学的リスクを低減する。
- ポートフォリオへの影響：ヘテロクロマチン形成促進活性に基づいた、リスク調整後の化合物の優先順位付けと推進を可能にする。
実施上の留意点
- ライブラリ調製には、ショウジョウバエ（Drosophila）の遺伝学および化合物ハンドリングの専門知識が必要です。
- 眼色の表現型解析には、標準的な解剖用顕微鏡およびスコアリングツールが必要です。
- 一貫したバイアル設定、スコアリング、およびデータ解釈を行うため、チーム間での標準化が求められます。
- 他のモデルシステムや化合物クラスへ拡張する場合、適応に関する検討が必要です。
- スコアリングの主観性や、ヒット化合物の直交的検証の必要性などの実用上の制限が含まれます。
