Name: ショウジョウバエを用いたヘテロクロマチン促進薬の同定のためのスクリーニング方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: 学ぶショウジョウバエを用いたヘテロクロマチン促進薬のスクリーニング方法。眼の斑入り表現型を指標に、簡便かつ低コストな創薬システムを確立し、がん治療薬の同定に応用可能です。

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我々は、J.バーヒラー、E.バッハ、ブルーミントンショウジョウバエストックセンターに様々なショウジョウバエ株に感謝します。国立がん研究所(NCI)腫瘍学のための開発治療プログラムは、低分子薬物ライブラリーを設定します。エイミー・チャン、テシク・ユー、ジェシカ・シン・バンガ、レイチェル・メザ、アレックス・チャベスを含むUCSDの学部生。この出版物で報告された研究は、米国胸部学会からJ.L.への研究助成金とNIHからの資金によって支えられた:R01GM131044からW.X.Lへの資金。

1. 薬物ライブラリーの準備
<ol><li>適切な溶媒を使用して適切な溶媒を使用してスクリーニングされる薬物ライブラリーを特定し、調製する(例えば、DMSOで10mM)。 注:薬物ライブラリーの具体例は、国立がん研究所(NCI)発達治療プログラム(DTP)の腫瘍学セットIIIです。このセットの化合物は、100%DMSOで10mMで20μLで20μLとして26ウェルPPUボトムプレートに2個の96ウェルPPU底板に提供され、-20°Cで保存されます。NCIプレートマップ、および各薬剤の基本的な化学データは、次のウェブサイトで見つけることができます: <a href="https://dtp.cancer.gov/dtpstandard/servlet/PlateMap?searchlist=4740&outputformat=html&searchtype=plate&Submit=Submit" target="_blank">NCIプレート番号 4740</a> <a href="https://dtp.cancer.gov/dtpstandard/servlet/PlateMap?searchlist=4741&outputformat=html&searchtype=plate&Submit=Submit" target="_blank">NCIプレート番号 4741</a>
</li>
</ol>2. ショウジョウバエを用いたヘテロクロマチン促進薬のスクリーニング
<ol><li>
ショウジョウバエ繁殖戦略(図1A)<ol>
<li>1日目:クロス3 w1118/Y;DX1 / CyOオスハエと3つ以上の処女w1118女性は、標準的なショウジョウバエ食品メディア(ブルーミントンのレシピ)の9 mLと25ミリメートルx 95ミリメートル食品バイアルでハエ。各薬剤に3つの複製バイアルと画面用のコントロールを1つ設定します。 注意:DX1ハエは、優しくジェームズ・バーヒラー(ミズーリ大学)9、13,13によって提供されました。</li>
		<li>2日目と3日目:ハエが室温(22°C)で2日間卵を産むことを許可します。</li>
		<li>4日目:親ハエを麻酔し、親ハエを「フライ遺体安置所」(70%アルコールを含むボトル)で親ハエを処分するために、CO2ガスの短いバーストを使用してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>スクリーニングのためにショウジョウバエに薬物を供給する。<ol>
<li>元のストック(96ウェルPP U底板で100%DMSOで10mMで20μL)から各薬剤化合物を水中33%DMSOで10μMの最終濃度に希釈します。コントロールとして、薬物なしで水中の33%DMSOを使用してください。 注:いくつかの薬物は、水に不溶性であり、DMSOに溶解した。100%DMSOはハエに有毒です。33%は許容可能です。</li>
		<li>4日目:ピペット60μLの10μMの薬物溶液またはフライフードの上にコントロール。この時点で、親ハエが取り除かれ、ハエの卵が存在し、食べ物の最初のインスターの幼虫が這っていることを確認してください。</li>
		<li>6日目:同じ10μMの薬物溶液の60μLを食品バイアルに繰り返します。 注:ハエ食品に薬物が添加されたので、上面食品は10μM近くの濃度を含んでおり、底部の食品は完全に浸透することができませんでした。すべてのハエは食べ物の上に卵を産み、上面の食べ物を食べます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>目の色の変化を観察し、スコアを付けます。<ol>
<li>F1ハエが出現した2日後(約14日目)、ハエを調べます。CO2の短いバーストを使用してF1ハエを麻酔し、バイアルからフィルターペーパーの下からCO2を通して多孔質解剖パッドにハエを取り除きます。</li>
		<li>解剖顕微鏡の下でこのパッド上のハエを検査します。フライ全体を調べて、すべてのw1118/ Yを識別します。彼らはCyO支配的な巻き翼表現型を欠いていることでDX1/+ヘテロ接合オス。</li>
		<li>w1118/Y のそれぞれの目の色をスコア。DX1/+ヘテロ接合オスは1から5のスケールでハエを飛ぶ(図1B)。白目の色の割合は、次のように評価されました。 1. <5% 赤散乱目全表面積 2. 6% - 25% 赤い斑点目の全表面積 3. 26% - 50% 赤い斑点目の全表面積 4. 51% - 75% 赤い斑点目の全表面積 5. >75%赤斑目全表面積 注:または、100%メタノールでフライヘッドを均質化し、分光計を使用してOD 450 nmで眼色素沈着を測定します。PEVはDX1男性でより多くの発音されるので、男性のみを選択してください。各バイアルで10人以上の男性を獲得。</li>
		<li>各バイアルから得点されたすべての男性の平均色指数を計算します。各化合物に対して三つ子を行う(図1C)。 注:目の色は年齢によって変化するので、これは時間に敏感なステップです。目の色は、同じ年齢で計算する必要があります – 2日。通常、10個のハエを各バイアルで採点する必要があります。</li>
		<li>化合物が実際にヘテロクロマチン形成を促進することを確認するために、ウェスタンブロッティングなどの異なる技術を使用して検証する(図1G)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Morgan, M. A., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+signatures+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Development%22%5BJournal%5D)">Chromatin signatures of cancer.</a> Genes Development. 29 (3), 238-249 (2015).</li>
<li>Saksouk, N., Simboeck, E., Dejardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+heterochromatin+formation+and+transcription+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Constitutive heterochromatin formation and transcription in mammals.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 3(2015).</li>
<li>Allshire, R. C., Madhani, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten+principles+of+heterochromatin+formation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ten principles of heterochromatin formation and function.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 229-244 (2018).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
<li>Grewal, S. I., Moazed, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+and+epigenetic+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin and epigenetic control of gene expression.</a> Science. 301 (5634), 798-802 (2003).</li>
<li>Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delving+into+the+diversity+of+facultative+heterochromatin%3A+the+epigenetics+of+the+inactive+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Delving into the diversity of facultative heterochromatin: the epigenetics of the inactive X chromosome.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 15 (5), 482-489 (2005).</li>
<li>Ci, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+Protein+1alpha+Mediates+Development+and+Aggressiveness+of+Neuroendocrine+Prostate+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin Protein 1alpha Mediates Development and Aggressiveness of Neuroendocrine Prostate Cancer.</a> Cancer Research. 78 (10), 2691-2704 (2018).</li>
<li>Zhu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin-Encoded+Satellite+RNAs+Induce+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin-Encoded Satellite RNAs Induce Breast Cancer.</a> Molecular Cell. 70 (5), 842-853 (2018).</li>
<li>Dorer, D. R., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansions+of+transgene+repeats+cause+heterochromatin+formation+and+gene+silencing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expansions of transgene repeats cause heterochromatin formation and gene silencing in Drosophila.</a> Cell. 77 (7), 993-1002 (1994).</li>
<li>Fanti, L., Dorer, D. R., Berloco, M., Henikoff, S., Pimpinelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+protein+1+binds+transgene+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin protein 1 binds transgene arrays.</a> Chromosoma. 107 (5), 286-292 (1998).</li>
<li>Shi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JAK+signaling+globally+counteracts+heterochromatic+gene+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">JAK signaling globally counteracts heterochromatic gene silencing.</a> Nature Genetics. 38 (9), 1071-1076 (2006).</li>
<li>Shi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+STAT+is+required+for+directly+maintaining+HP1+localization+and+heterochromatin+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila STAT is required for directly maintaining HP1 localization and heterochromatin stability.</a> Nature Cell Biology. 10 (4), 489-496 (2008).</li>
<li>Ronsseray, S., Boivin, A., Anxolabehere, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-Element+repression+in+Drosophila+melanogaster+by+variegating+clusters+of+P-lacZ-white+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">P-Element repression in Drosophila melanogaster by variegating clusters of P-lacZ-white transgenes.</a> Genetics. 159 (4), 1631-1642 (2001).</li>
<li>Loyola, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+methotrexate+as+a+heterochromatin-promoting+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of methotrexate as a heterochromatin-promoting drug.</a> Scientific Reports. 9 (1), 11673(2019).</li>
<li>Dialynas, G. K., Vitalini, M. W., Wallrath, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+Heterochromatin+Protein+1+%28HP1%29+to+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Linking Heterochromatin Protein 1 (HP1) to cancer progression.</a> Mutation Research. 647 (1-2), 13-20 (2008).</li>
<li>Janssen, A., Colmenares, S. U., Karpen, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin%3A+Guardian+of+the+Genome%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin: Guardian of the Genome.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 265-288 (2018).</li>
<li>Zhu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+tumour+suppression+occurs+via+heterochromatin-mediated+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BRCA1 tumour suppression occurs via heterochromatin-mediated silencing.</a> Nature. 477 (7363), 179-184 (2011).</li>
<li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unphosphorylated+STAT5A+stabilizes+heterochromatin+and+suppresses+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Unphosphorylated STAT5A stabilizes heterochromatin and suppresses tumor growth.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (25), 10213-10218 (2013).</li>
</ol>

著者らは開示する利益相反を持っていません。

ヘテロクロマチンは、遺伝子発現を調節する上で中心的な役割を果たすDNAの凝縮形態である。癌でますます認知されつつあり、がん,治療15、16、17、18,16,17の潜在的な標的として役立つ可能性があります。18低分子化合物は、人間の体内での製造、保存、代謝の利点により、医薬品開発に一般的に使用されています。ヘテロクロマチン促進小分子化合物を同定するために、効率的な方法を設計し、ヘテロクロマチン依存的にハエの目の色に影響を与えることを証明されているDX1ショウジョウバエ株を使用して提示した(図1)。
当社のスクリーニングプロトコルは、医薬品開発のためのシンプルで安価で簡単にインビボシステムです。しかし、スクリーニング戦略の1つの制限は、...

ヘテロクロマチンは、遺伝子発現において中心的な役割を果たす凝縮されたDNAの形態であり、細胞分裂中の染色体分離を調節し、かつゲノム不安定性1から保護する際に行われる。ヘテロクロマチンは遺伝子抑制調節因子であると考えられ、細胞の有糸分裂の間に染色体の完全性を保護するために2,,3.これは、系統コミットメント4、5の間にヒストンH3リジン9(H3K9me)のジメチル化および三メチル化に5関連付けられている。また、ヘテロクロマチンタンパク質1(HP1)のクロムドメインタンパク質の動員は、遺伝子発現6のヘテロクロマチンおよびエピジェネティックな抑制と関連しているとも考えられる。これらのタンパク質はヘテロクロマチン形成の必須成分およびマーカーです。
ゲノム不安定性により細胞は発癌を促進する遺伝的変化を得ることができるため、ヘテロクロマチンは癌の発症においてより認識されるようになり、癌治療77,88の標的となり得る。現在, ヘテロクロマチンの形成を支援するために確立されている薬はありません。.ここでは、ヘテロクロマチンの形成を促進する低分子化合物をスクリーニングするための簡単かつ迅速かつ効率的な方法を提示する。スクリーニングは、低分子薬物のライブラリーでショウジョウバエを治療することによって行われる。この方法は、ヘテロクロマチンレベルの影響を受けるDX1ショウジョウバエ株の多様な眼色表現型を利用します。DX1ハエは、ヘテロクロマチ化に依存して多様な発現/抑うつを有する7つのP[lac-w]トランス遺伝子のタンデム配列を含み、したがって、眼色の変化の程度はヘテロクロマチンレベルを反映する。具体的には、ヘテロクロマチンの増加は、可変眼色(白目)の上昇割合によって検出され得る。逆に、ヘテロクロマチンの減少は、P[lac-w]トランスジーン発現(赤目)9、10、11、1210,11,12の上昇割合によって検出されるであろう。9
したがって、このショウジョウバエトランスジーンシステムは、その発現が存在するヘテロクロマチンの量と直接相関しているため、多様な眼色表現型を生成する。ヘテロクロマチンの形成を促進すると疑われる化合物の発見に際して、ウェスタンブロットなどの他の方法を用いてこの疑いを確認してもよい。これらのヘテロクロマチン促進物質は、将来の患者における臨床試験のためにさらに開発され得る。

<table><tbody><tr><td>ショウジョウバエ</td><td></td><td>DX1株</td><td>DX1ハエは、ジェームズ・バーヒラー(ミズーリ大学)</td></tr><tr><td>Drosophila食品メディア</td><td>UCSDフライキッチン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メトトレキサート</td><td>NCI薬物ライブラリ</td><td></td><td></td></tr>ジ<tr><td>メチルスルホキシド(DMSO)</td><td>シグマ</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>エチルによって提供されました。アルコール</td><td>シグマ</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr></tbody></table>

ショウジョウバエを用いたヘテロクロマチン促進薬の同定のためのスクリーニング方法

A Screening Method for Identification of Heterochromatin-Promoting Drugs Using Drosophila

ショウジョウバエは、がん治療に有用な化合物をスクリーニングするために使用できる優れたモデル生物です。ここで説明する方法は、ショウジョウバエを用いてヘテロクロマチン促進化合物を同定するインビボ法で費用対効果が高い方法である。ショウジョウバエのDX1株は、ヘテロクロマチン形成の程度を反映した多様な眼色表現型を有し、ヘテロクロマチン促進薬スクリーン用のツールを提供する。このスクリーニング方法では、目の変化を眼の一部を占める赤色素沈着の表面積に基づいて定量化し、1から5のスケールで採点される。スクリーニング方法は簡単で敏感であり、インビボでの化合物のテストを可能にする。この方法を用いた薬物スクリーニングは、がん治療薬に有益な効果を有するヘテロクロマチン促進薬を同定するための迅速かつ安価な方法を提供する。ヘテロクロマチンの形成を促進する化合物を同定することは、がんの発生のエピジェネティックなメカニズムの発見にもつながる可能性があります。

このプロトコルは、ショウジョウバエにおけるヘテロクロマチン形成を促進する化合物のスクリーニングに成功し、これは医薬品開発のための効率的かつ低コストのインビボシステムである(図1)。我々は、ショウジョウバエメラノガスターのDX1株を用いて、97のFDA認可腫瘍学薬で構成される低分子薬物ライブラリー、腫瘍学セットIIIをスクリーニングした(図1B)。重要な薬物の結果は棒グラフで表された(図1C,D)。スクリーニングアッセイによると、ライブラリー内でE7としてコード化されたメトトレキサート(4-アミノプテロイルグルタミン酸)はDX1株で最も変動を引き起こし、メトトレキセートが将来の癌標的療法にとって最も有望なヘテロクロマチン促進薬である可能性を示唆している(図1<str...

ショウジョウバエは、がん治療の潜在的な用途を有する薬剤のスクリーニングに適した広く使用されている実験モデルです。ここでは、ヘテロクロマチン形成を促進する低分子化合物をスクリーニングする方法としてショウジョウバエ可変眼色表現型を用いるものについて述べている。

Drosophila is an excellent model organism that can be used to screen compounds that might be useful for cancer therapy. The method described here is a ...

現在ヘテロクロマチン形成を促進する際に確立されている薬はありません。.ここでは、このプロセスを促進する低分子化合物を同定するための簡単で効率的な方法を提示する。当社のスクリーニングプロトコルは、ヘテロクロマチン促進薬物同定のための簡単で安価で、生体内システムに従いやすい。ヘテロクロマチンの形成を促進する化合物を同定することは、治療やがん治療のメカニズムの発見につながる可能性があります。この費用対効果は、ショウジョウバエにおけるヘテロクロマチン促進化合物を同定するために測定されており、細胞スクリーニングの最高細胞プールに対する予防措置であるため、ヒットを数えるためにも使用できる。このショウジョウバエTranSheetシステムは、ハエに存在するヘテロクロマチンの量に反比例する多様な眼色表現型を生成するので、当社のスクリーニングプロトコルは、迅速なパイロットスクリーンにも有用である可能性があります。手順のデモンストレーションを手伝うのは、私たちの研究室の学部生ケニー・ダオです。適切な溶媒を使用してスクリーニングのための薬物ライブラリーを同定し、準備した後、所望の濃度は、25×95ミリメートルの食物バイアルで3つ以上の処女雌ハエを持つ3つの雄のハエを渡る。標準的なショウジョウバエ食品培地の9ミリメートルで。各薬剤に対して3つのレプリカバイアルを設定します。画面にコントロール バイアルを 1 つ追加します。そして、ハエが室温で2日間卵を産むことを許可します。十字架の2日目に、二酸化炭素の短いバーストでハエを麻酔します。そして、70%エタノールを含むボトルに親のハエを捨てます。次に、初期ストックから各薬物化合物を希釈し、水中の33%DMSOでマイクロモル最終濃度に出席する。そして、フライフードの上に、薬物の60マイクロリットル、またはコントロール33%DMSOを単独で加える。次に、バイアル内に親ハエが存在しないか確認します。そして、適切なバイアルに薬物溶液を追加します。F1ハエが出現した2日後、一度に1つのバイアルから麻酔付きハエを濾過紙の下から二酸化炭素を濾過する多孔質解剖パッドに移す。解剖顕微鏡の下で、各ハエ全体を調べ、巻き毛のo-支配的な巻き毛の翼表現型の欠如によってヘテロ接合性の雄の全てを識別する。1から5のスケールで各ヘテロ接合男性の目の色をスコア。1つのスコアが5%未満の赤散乱目総表面積に割り当てられていると。6〜25%の赤いスポットの目の総表面積を持つハエに2つのスコアを追加します。26〜50%の赤い斑点目の総表面積を持つ飛ぶ3。4は51〜75%の赤い斑点目の総表面積を持つ飛ぶ。そして、75%以上の赤い斑点目の総表面積を持つ5つのハエ。次に、三重で採点された各バイアルからすべての男性の平均色指数を計算します。化合物が実際にヘテロクロマチン形成を促進することを確認するために、ウェスタンブロッティングなどの異なる検証技術を、行うことができる。本代表的実験では、低分子薬物ライブラリーである腫瘍学セット3は、97のFDA認可腫瘍学薬で構成され、ショウジョウバエメラノガスターのDX1株を用いてスクリーニングした。スクリーニングアッセイによれば、メトトレキサートは、ライブラリー内でE7としてコード化され、Dx1株内で最も変動を引き起こした。メトトレキサートが将来の癌標的治療のための最も有望なヘテロクロマチン促進薬である可能性を示唆する。この化合物がヘテロクロマチン変換を促進することを更に確認するために、ウェスタンブロットデータが行われた。ヘテロクロマチン関連タンパク質のアップ調節を実証し、H3K9トリメチル化、スクリーニング結果を検証した。重要なステップは、所定の研究ルートに従って1〜5のスケールで白い11-18 DX1ヘテロ接合オスのハエのそれぞれの目の色を採点することです。ウエスタンブロットまたは免疫染色を使用してヒットを確認できます。ヘテロクロマチンの形成を促進すると疑われる化合物の発見は、ヒト患者におけるがんの発症と臨床試験のIV遺伝的メカニズムの発見にもつながる可能性がある。

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遺伝学

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