定性・定量的組織学的手法を用いたマウス胚における先天性心不全の解析

このプロトコルは、先天性心不全を研究する他のグループによってより広く使用できるように、新しい組織分析技術を標準化する。定性的分析と定量分析手法の両方に長所と短所があるので、この方法論は両方を使用して、最も幅広い実験問題に対処します。これらの技術は、心臓病の診断方法にプラスの影響を与えることができます。

例えば、病理学者は、生検サンプルからヒト心臓病を診断するために、私たちの顕微鏡心臓組織分析技術を適用することができます。このプロトコルは、発達性心学または一般的な心臓病研究に使用することができます。しかし、これらの方法は、あらゆる組織分析に適用できる様々な有用な技術も提供する。

胚性15日目から15.5日目の心臓を収集するには、妊娠中のダムの手足を固定し、胸骨まで尿道の周りを開始し、胴体に沿ってI字型の切開を慎重に行います。スクープ運動で鉗子を使用して、抽出を助けるために細かい鉗子で必要に応じて子宮の表面組織をつかむ腹腔から子宮を静かに持ち上げる。はさみを使って腹部から子宮を解放します。

氷冷PBSに子宮を浸した後、臓器を解剖皿に固定します。はさみを使用して、子宮をそれぞれ別々の胚を含む個々の切片に切断する。2組の細かい鉗子を使用して、子宮組織から胚をそっと剥がし、4°CのPBS-EDTAを含む新しいペトリ皿に入れます。

心臓を収集するには、皿を解剖顕微鏡の下に置き、2組の細かい鉗子を使用して胚をサピネの位置に配置します。胸部へのアクセスを安定させた後、2番目の細い鉗子の鋭い点を使用して、鎖骨からへそまで伸びる胚の胸骨に沿って切開を行う。胸腔の内側に向かって徐々に働きながら、非常に細かく表面的な切開を行い、胚の腹部を開く。

心臓がちょうど見えるようになるとき、鉗子のペアを使用して、肋骨ケージにわずかにコッドした胴体を絞り、肋骨を開けて剥がします。鉗子の1組の側面を使用して、組織を分離することなく肺血管をそっとつかみ、心臓を空洞から引き出す。4%パラホルムアルデヒドで45〜60分間組織を固定する前に、新鮮なPBS-EDTAで心臓を1〜2分間洗浄します。

次いで、グリシンを補充したPBSで、1回に5~10分間心臓を3回洗浄する。摂氏4度でPBSに心臓を保存する前に。凍結切除のための心臓を準備するには、サンプルを30%スクロースのチューブに入れ、PBSを摂氏4度で24〜40時間置きます。

心臓がチューブの底に沈んだら、修正された先端を持つパスツールピペットを使用して、各心臓を糸くず無料のワイプに慎重に移します。短い空気乾燥の後、各サンプルを断面化のために所望の向きで個々の最適な切断温度の型に置きます。泡のない最適な切断温度媒体に組織を水没させる。

その後、開氷前に少なくとも24時間、80°Cで組織を凍結する前に、最大20°Cで20°Cで保存します。サンプルのクライオスタットセクションを得るために、新しい最適な温度切断媒体を使用して、対象の組織ブロックをクライオスタットのチャックに取り付け、透明になるまで凍結させます。新しいブレードを挿入し、組織ブロックとブレードの間の距離を調整して、切片を取得できるようにします。

目的のポイントに達するまで、10マイクロメートルのスライスでブロックをトリミングします。組織が観察できるときは、小さな平らな絵筆を使って、連続的な切断動作でスタンドに対してスライスを優しく引っ張ります。組織が完全に切断されたら、詳細ブラシを使用してスライスをステージに対して平らになでます。

詳細なブラシを取り外してスライスを仕上げる前に、セクションを約20〜30秒間保持します。両方のペイントブラシを使用して、ステージに対してスライスを静かに平らにし、ステージに対して組織セクションを保持します。20~30秒後、セクションを反転させてステージに対して再び平らにしてから、静電に帯電したスライドをスライドに引き付けてスライドに触れることなくスライドに付着させるのに十分近づけます。

一般的な心臓欠損の存在について心臓組織切片を評価するために、カメラを搭載した顕微鏡を用いて、5〜10倍および40倍の倍率で画像を得る。心筋圧密解析の場合は、適切な画像解析ソフトウェアプログラムで目的の組織を開き、画像を8ビットに設定します。画像のしきい値を設定するには、[イメージ]、[調整]、[しきい値] をクリックし、上部のバーを移動して、背景のピクセルだけが選択されるまでしきい値を調整します。

次に、ポリゴン選択ツールを使用して、組織の周囲に関心のある領域を描画し、[解析]、[測定を設定]、[面積]、および [しきい値に制限] をクリックします。[解析と計測]をクリックして、ハイライトされたピクセルの領域を測定して、負のスペースの面積の値を取得します。対象領域全体の領域を測定するには、[分析]、[測定の設定]、および [しきい値に制限] の選択を解除します。

次に、[分析と測定] を選択して、選択した対象領域の領域全体を測定します。筋肉組織の面積を計算するには、対象領域の領域から負の領域を差し引きます。次に、筋肉組織の領域を対象領域で分割して筋肉圧とX.採取した胚性心臓からの組織スライスの染色を計算し、組織の端を作るのに十分なコントラストを提供しますが、細胞の特徴を区別できないようにするにはそれほど暗くはありません。

この代表的な分析では、非実験的条件下で発達した胚に対して、実験心臓において筋肉圧密が有意に減少することが観察された。これらのサンプルは貴重であり、作成に長い時間を要します。特に壊死やクライオスタットの切り分けの際には、実行するすべてのアクションについて意図的に行ってください。

パラホルムアルデヒドの組織を保存すると、形態評価中に見つかった病理学的原因を特定するのに役立つアミノフルオレセイン染色のようなテストにサンプルを使用することを可能にする抗原活性を維持します。研究室では、さまざまな治療法がサンプルにどの程度影響を与えるかを特定するのに役立つ実験的治療法の定量表現を得ました。パラホルムアルデヒドは、それが触れる任意の組織を固定することができます。

この化学物質を使用する場合は常に露出した皮膚を最小限に抑え、フィルムフードで作業するように手袋を着用するように注意してください。