Name: 定性・定量的組織学的手法を用いたマウス胚における先天性心不全の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 学ぶ 定性・定量的組織学的手法を用いたマウス胚の先天性心不全解析法。心臓組織の顕微鏡観察と定量化により、発生心臓病学研究およびヒト心疾患診断への応用可能性を示す標準化プロトコルです。

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アギーレ研究所は、国立衛生研究所の国立心臓、肺、血液研究所の賞番号K01HL135464の下で、賞番号19IPLOI34660342の下で米国心臓協会によってサポートされています。

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</ol>

著者らは報告する開示を持っていません。

このプロトコルは、胚性心臓における心臓発達の分析に関与する技術を探る。この方法のいくつかの制限は、準備技術に必要な物理的な器用さであり、練習を必要とし、顕微鏡イメージングを伴うスキルを有する。クライオスタットで得られたスライスが乱雑な場合、ヘマトキシリンとエオシン染色が明確でない場合、または顕微鏡で撮影した画像の照明が悪い場合、ImageJで使用される方法は機能しません。ImageJ ソフトウェアのしきい値機能の制限は、ピクセル値に応じてしきい値の一端に位置するピクセルを選択することです。したがって、しきい値の間違った側に存在するピクセルは、誤って計算に含まれるか除外されます。最終的には、調査で使用するプロトコルを採用するためにトラブルシューティングが必要になります。
心臓抽出が困難な場合は、ステップ2.8にスキップすることを検討してください。さらに、胸腔から心臓と肺以上のものを取り除くことを検討してください。その後、ターゲットはより大きく、操作しやすくなり、心臓と細かい鉗子との間の直接接触が最小限に抑えられます。クライオスタットの切り離し時、実験サンプルは常にコントロールサンプル...

CHDは、ヒトにおける出生時欠損の最も一般的なタイプであり、出生時欠損関連死の主な原因である1、2、3、4、5、6。新生児の約90%がCHDを生き残っているが、それはしばしば、患者の生活と医療システム7、8、9、10に大きな負担を課す、長年にわたって重大な罹患率および医学的介入に関連している。純粋に遺伝的要因の外では、CHDの原因は十分に理解されていません4.未確認の原因は、米国心臓協会およびその他の情報源2、3、4、11によると、すべてのCHD症例の約56-66%を占める。既知の因子には、遺伝子変異、CTV、デノボ単一ヌクレオチド変異、および異数体が含まれる。母体の生活様式2、12、経済的剥奪、および人種13を結ぶ疫学的研究によって示唆されるように、環境および食事因子もCHDに寄与する重要な供給源であると疑われる。CHDおよび他の心血管欠損のメカニズムと原因を調査することは、予防戦略および新しい治療オプション1、4、17、18、19を開発するために重要である。
開発中のマウスは、哺乳類のCHDを研究するための基礎モデルです。しかし、心臓形態を保存する分節、発達段階の分析、CHD関連欠陥の同定など、採用された方法や分析の中には、マウスの心臓の分析に新しい科学者にとっては困難な場合があります。このプロトコルで説明されている方法の目的は、これらのプロセスに対して定性的かつ定量的なガイドラインを提供することです。したがって、このプロトコルでは、所望の妊娠期の胚を産生するために時間交配を行い、無傷の心臓回復(流出路などの関連組織を含む)、心臓固定および準備のために妊婦を解剖する方法を説明するクライオスタット断面化、基本的な構造学的方法、一般的な心臓欠損の定量的分析、および心筋圧密の定性的分析は、いくつかのタイプのCHDに対する一般的な前駆体表現型である。

<table><tbody><tr><td>15 mL コニカルチューブ(s)</td><td>Fisher Scientific</td><td># 1495970C</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Mice</td><td>Jackson Labs</td><td>C57BL/6J - ストック000664</td><td></td></tr><tr><td>Coplin 染色ジャー (x6)</td><td>VWR Scientific</td><td># 25457-006</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 24X50MM #1.5</td><td>VWR Scientific</td><td># 48393-241</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat - Leica CM3050S</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>解剖皿(s)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>#50930381</td><td></td></tr><tr><td>デュモン#5 - ファインフォーセプス(x2)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>#11254-20</td><td></td></tr>エ<tr><td>オシンY溶液</td><td>ミリポアシグマ</td><td>#HT110116-500ML</td><td></td></tr><tr><td>エチルアルコール(ピュア、200プルーフ)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>#BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸(EDTA)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>#E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>ユーキット</td><td>ミリポアシグマ</td><td>#03989-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ファインハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>#14060-10</td><td></td></tr><tr><td>蛍光実体顕微鏡ライカM165 FC</td><td>ライカ</td><td>N / A</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>ミリポアシグマ</td><td>#410225-250G</td><td></td></tr><tr><td>グレーフ鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>#11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism 8 Software</td><td>Graphpad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td># 06666A</td><td></td></tr><tr><td>Mayer's hematoxylin solution</td><td>Millipore Sigma</td><td># MHS16-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette tip(s) - p200</td><td>Fisher Scientific</td><td># 02707448</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel Software</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OCTコンパウンド</td><td>VWRサイエンティフィック</td><td>#102094-106</td><td></td></tr>オ<tr><td>リンパスCkX53顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペイントブラシ(少なくとも2)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>VWRサイエンティフィ</td>ック<td>#0215014601</td><td>4%溶液にする(PBSに溶解)</td></tr><tr><td>パスツールピペットフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>#13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>#15140122</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>#70011044</td> スケールメトラートレド#MS1602TS<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>スケールメト<tr><td></td><td>ラートレド</td><td>#MS105</td><td></td></tr>メス<tr><td>ハンドル#3</td><td>VWRサイエンティフィック</td><td>#を使用する前に10倍から1倍に希釈してください10161-918</td><td></td></tr>メス<tr><td>ブレードVWR</td><td>サイエンティフィック</td><td>#21909-612</td><td></td></tr>スクエア<tr><td>モールド</td><td>VWRサイエンティフィック</td><td>#100500-224OCT</td><td>モールドス</td></tr><tr><td>クロー</td>ス<td>ミリポアシグマ</td><td>#S9378-500G</td><td></td></tr><tr><td>スーパーフロストプラススライド</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>#1255015</td><td></td></tr><tr><td>外科用ハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>#14002-14</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-TEK Accu-Edge ディスポーザブル ミクロトームブレード</td><td>VWR Scientific#</td> <td>25608-964</td><td></td></tr><tr><td>トラベルスケール</td><td>Acculab</td><td>VIC 5101</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>ミリポアシグマ</td><td>214736-1L</td><td></td></tr></tbody></table>

定性・定量的組織学的手法を用いたマウス胚における先天性心不全の解析

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

先天性心不全(CHD)は、ヒトの出生時欠損の最も一般的なタイプであり、すべての出生の最大1%に影響を及ぼす。しかし、CHDの根本的な原因はまだ十分に理解されていません。開発中のマウスは、マウスとヒトの間の心臓発達プログラムが非常に保存されているため、CHDの研究にとって貴重なモデルです。プロトコルは、所望の妊娠段階のマウス胚を生成する方法、下流処理のために心臓を分離して保存する方法、構造学によってCHDの一般的なタイプを識別する定量的方法(例えば、心室中隔)を詳細に記述する欠陥、心房中隔欠損、特許性管管動脈管)、および定量的な構造学法は、一般的な筋圧膜型を測定する。これらの方法は、サンプルの調製、収集、および分析に関与するすべてのステップを明確にし、科学者がCHDを正しく、再現的に測定することを可能にします。

筋肉圧指数は、コントロールと実験群の2つの異なる環境下で発達する心臓の間で比較された。これらのプロトコルは、筋肉組織の圧縮を定量的に分析するために使用され、統計的分析が可能であった。筋肉圧圧は、非実験的条件で発症した胚に対して実験心臓において有意に減少することが示された。
観察のタイミングが不正確に見える場合、胚は廃棄されました。胚の発育不伴は実験の治療の結果であり得るが、発達の進展には範囲があるが、繁殖は胚発生のタイミングを確保するために十分に間隔を空けた。胚のステージングは、Theiler Staging21を使用して行われました。サンプルは、スライスが一貫性を反映していない場合、または明らかな涙や折り目がある場合は、十分にスライスされていないと考えられていました。染色は組織の端を作るのに十分なコントラストを提供したが、細胞の特徴を区別できないほど暗くはなかった。その後、スライドを40倍の目的で反転顕...

本議定書では、先天性心不全に関連するマウスの発達表現型を定性的かつ定量的に分析する手順を説明する。

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...

このプロトコルは、先天性心不全を研究する他のグループによってより広く使用できるように、新しい組織分析技術を標準化する。定性的分析と定量分析手法の両方に長所と短所があるので、この方法論は両方を使用して、最も幅広い実験問題に対処します。これらの技術は、心臓病の診断方法にプラスの影響を与えることができます。例えば、病理学者は、生検サンプルからヒト心臓病を診断するために、私たちの顕微鏡心臓組織分析技術を適用することができます。このプロトコルは、発達性心学または一般的な心臓病研究に使用することができます。しかし、これらの方法は、あらゆる組織分析に適用できる様々な有用な技術も提供する。胚性15日目から15.5日目の心臓を収集するには、妊娠中のダムの手足を固定し、胸骨まで尿道の周りを開始し、胴体に沿ってI字型の切開を慎重に行います。スクープ運動で鉗子を使用して、抽出を助けるために細かい鉗子で必要に応じて子宮の表面組織をつかむ腹腔から子宮を静かに持ち上げる。はさみを使って腹部から子宮を解放します。氷冷PBSに子宮を浸した後、臓器を解剖皿に固定します。はさみを使用して、子宮をそれぞれ別々の胚を含む個々の切片に切断する。2組の細かい鉗子を使用して、子宮組織から胚をそっと剥がし、4°CのPBS-EDTAを含む新しいペトリ皿に入れます。心臓を収集するには、皿を解剖顕微鏡の下に置き、2組の細かい鉗子を使用して胚をサピネの位置に配置します。胸部へのアクセスを安定させた後、2番目の細い鉗子の鋭い点を使用して、鎖骨からへそまで伸びる胚の胸骨に沿って切開を行う。胸腔の内側に向かって徐々に働きながら、非常に細かく表面的な切開を行い、胚の腹部を開く。心臓がちょうど見えるようになるとき、鉗子のペアを使用して、肋骨ケージにわずかにコッドした胴体を絞り、肋骨を開けて剥がします。鉗子の1組の側面を使用して、組織を分離することなく肺血管をそっとつかみ、心臓を空洞から引き出す。4%パラホルムアルデヒドで45〜60分間組織を固定する前に、新鮮なPBS-EDTAで心臓を1〜2分間洗浄します。次いで、グリシンを補充したPBSで、1回に5~10分間心臓を3回洗浄する。摂氏4度でPBSに心臓を保存する前に。凍結切除のための心臓を準備するには、サンプルを30%スクロースのチューブに入れ、PBSを摂氏4度で24〜40時間置きます。心臓がチューブの底に沈んだら、修正された先端を持つパスツールピペットを使用して、各心臓を糸くず無料のワイプに慎重に移します。短い空気乾燥の後、各サンプルを断面化のために所望の向きで個々の最適な切断温度の型に置きます。泡のない最適な切断温度媒体に組織を水没させる。その後、開氷前に少なくとも24時間、80°Cで組織を凍結する前に、最大20°Cで20°Cで保存します。サンプルのクライオスタットセクションを得るために、新しい最適な温度切断媒体を使用して、対象の組織ブロックをクライオスタットのチャックに取り付け、透明になるまで凍結させます。新しいブレードを挿入し、組織ブロックとブレードの間の距離を調整して、切片を取得できるようにします。目的のポイントに達するまで、10マイクロメートルのスライスでブロックをトリミングします。組織が観察できるときは、小さな平らな絵筆を使って、連続的な切断動作でスタンドに対してスライスを優しく引っ張ります。組織が完全に切断されたら、詳細ブラシを使用してスライスをステージに対して平らになでます。詳細なブラシを取り外してスライスを仕上げる前に、セクションを約20〜30秒間保持します。両方のペイントブラシを使用して、ステージに対してスライスを静かに平らにし、ステージに対して組織セクションを保持します。20~30秒後、セクションを反転させてステージに対して再び平らにしてから、静電に帯電したスライドをスライドに引き付けてスライドに触れることなくスライドに付着させるのに十分近づけます。一般的な心臓欠損の存在について心臓組織切片を評価するために、カメラを搭載した顕微鏡を用いて、5〜10倍および40倍の倍率で画像を得る。心筋圧密解析の場合は、適切な画像解析ソフトウェアプログラムで目的の組織を開き、画像を8ビットに設定します。画像のしきい値を設定するには、[イメージ]、[調整]、[しきい値] をクリックし、上部のバーを移動して、背景のピクセルだけが選択されるまでしきい値を調整します。次に、ポリゴン選択ツールを使用して、組織の周囲に関心のある領域を描画し、[解析]、[測定を設定]、[面積]、および [しきい値に制限] をクリックします。[解析と計測]をクリックして、ハイライトされたピクセルの領域を測定して、負のスペースの面積の値を取得します。対象領域全体の領域を測定するには、[分析]、[測定の設定]、および [しきい値に制限] の選択を解除します。次に、[分析と測定] を選択して、選択した対象領域の領域全体を測定します。筋肉組織の面積を計算するには、対象領域の領域から負の領域を差し引きます。次に、筋肉組織の領域を対象領域で分割して筋肉圧とX.採取した胚性心臓からの組織スライスの染色を計算し、組織の端を作るのに十分なコントラストを提供しますが、細胞の特徴を区別できないようにするにはそれほど暗くはありません。この代表的な分析では、非実験的条件下で発達した胚に対して、実験心臓において筋肉圧密が有意に減少することが観察された。これらのサンプルは貴重であり、作成に長い時間を要します。特に壊死やクライオスタットの切り分けの際には、実行するすべてのアクションについて意図的に行ってください。パラホルムアルデヒドの組織を保存すると、形態評価中に見つかった病理学的原因を特定するのに役立つアミノフルオレセイン染色のようなテストにサンプルを使用することを可能にする抗原活性を維持します。研究室では、さまざまな治療法がサンプルにどの程度影響を与えるかを特定するのに役立つ実験的治療法の定量表現を得ました。パラホルムアルデヒドは、それが触れる任意の組織を固定することができます。この化学物質を使用する場合は常に露出した皮膚を最小限に抑え、フィルムフードで作業するように手袋を着用するように注意してください。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

心臓の発達に影響を与える遺伝的変化を検討する際に、胎児および周産期死亡は、一般的な機能です。高周波超音波イメージングは​​、2次元の解像度を向上しており、早期に心臓の開発に優れた情報を提供することができますし、死亡前に心臓の構造と機能に及ぼす影響を検出するための理想的な方法です。...

ネズミの胎児心エコー検査

超高周波超音波小動物における心臓の異常を調べるための強力なライブイメージングツールです。その非侵襲性は、胚の生理的な状態を維持することができます。ここで、我々は子宮内で E18.5で胚の心拍数を測定するためのM-モード超音波を使用することを示している。...

非侵襲Mモード心エコー検査によるマウスでの心拍数の子宮内測定で

&gt;jove_content&lt;先天性心疾患を引き起こす突然変異は、発生中の心臓構造のin...

胚性マウスの心臓に免疫蛍光を用いて、心筋細胞の開発の分析

心エコー検査は、マウスで多用されます。高価な高分解能超音波デバイスは、この目的のために開発されています。このプロトコルでは、心臓形態を決定する組織学的形態計測学的解析と組み合わせて現実的な心エコー手順について説明します。...

マウスの心臓形態の心エコー検査・組織学的検討

ここでは、全体のマウント蛍光マウス初期胚のイメージに基づく定量的容積測定分析のためのプロトコルについて述べる.定性的と定量的開発時に心臓の構造を評価し、他の器官に広く適応可能があることを提案する強力な方法としてこのテクニックを紹介します。...

マウス胚における心臓前駆細胞集団の定量的ホール マウント免疫染色解析

高周波超音波胎児マウスの解像度の画像が上がったし、心臓発生と構造欠陥の正確な非侵襲的評価を提供することができます。本プロトコルを実行するリアルタイムの胎児マウス...

心血管イメージング (30/45 MHZ) の高周波超音波を用いた胎児マウス

心室固有 MLC 2 v tdTomato レポーター ノックアウトのマウスから解剖マウス胚全体のマウント epifluorescent...

落射蛍光マウント全体を用いたマウス胚発生中に心臓商工会議所発展の分析

この記事では、胎児心エコー検査、剖検、およびエピスコピック共焦点顕微鏡(ECM)を使用したエピスコピック蛍光画像キャプチャ(EFIC)を使用したマウス先天性心疾患(CHD)診断方法とそれに続く3次元(3D)再構成について詳しく説明します。...

マウス胎児の構造的心臓欠損を特徴付けるパイプライン

ここでは、血管内DiI注射と組み合わせたひよこGFP 神経管の種内移植を用いた神経堤細胞および血管の二重標識を報告する。この実験技術により、臓器形成中にNCC由来の(腸管)神経系と血管系の発達を同時に可視化し、研究することができます。...

鶏の胚内の神経堤細胞と血管の二重標識は、ひよこGFP 神経管移植とカルボシアニンDyI注射を用いた

ここでは、生きている、孤立した後期妊娠期のマウス胚に超音波マイクロバブル造影剤を注入するためのプロトコルを提示する。この方法は、灌流パラメータ及びコントラスト強調高周波超音波イメージングを用いて、胚内の血管の分子マーカーの研究を可能にする。...

高周波超音波を用いて、マウス胚におけるコントラストイメージング

学ぶ 定性・定量的組織学的手法を用いたマウス胚の先天性心不全解析法。心臓組織の顕微鏡観察と定量化により、発生心臓病学研究およびヒト心疾患診断への応用可能性を示す標準化プロトコルです。

定性・定量的組織学的手法を用いたマウス胚における先天性心不全の解析

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