Name: マウス肝組織における血管の多光顕微鏡観察 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: 学ぶマウス肝組織における血管動態の多光顕微鏡観察法。Rhodamine B isothiocyanate–dextranを用いた尾静脈注射により、生体内の深部組織構造を三次元的に可視化し、肝臓の血管化をリアルタイムで研究する手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は中国国立自然科学財団(81772133、 81902444)、広東自然科学基金(2020A1515010269、2020A15011367)、広州市民健康科学技術研究プロジェクト(201803010034、201903010072)、軍事医療イノベーションプロジェクト(170ZZ)

すべての動物のケアと手順は、ヒースと幸福のための中国南方病院の方針に従っていました(アプリケーションNo:NFYY-2019-73)。
1. マウスの準備
<ol><li>マウスを麻酔します。<ol>
<li>注射器にペントバルビタールナトリウム(50mg/kg)を準備します。</li>
		<li>マウス(8週齢の雄C57BL/6)を左手でつかみ、腹が上向きになり、頭が尾よりも低くなるようにします。75%アルコールで腹部の皮膚を消毒します。</li>
		<li>右手に注射器を持ち、3~5mmずつ針で腹部白線を突き刺す。注射針と皮膚が45°の角度であることを確認し、ペントバルビタールを腹腔にゆっくりと注入します。 シェービング後、マウスの切開部位の周囲を75%アルコールとクロルヘキシジン溶液と交互に3回消毒する。</li>
		<li>正しい反射の欠如によって麻酔が成功したかどうかを確認してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ローダミンBイソチオシアネート-デキストランを尾静脈に注入する。<ol>
<li>10 mg/mL ローダミンBイソチオシアネート-デキストランをシリンジに100 μL用意します。</li>
		<li>75%のアルコールでマウスの尾を拭きます。</li>
		<li>尾を左手で持ち、右手の注射器を静脈に平行な針で持ち、100μLの染料を注入します。</li>
		<li>注射後に綿棒で出血を止める。</li>
	</ol>
</li>
	<li>無菌水で濡らしたガーゼでマウスの腹部の毛皮を浸し、かみそりを使ってマウスの腹部を剃り、毛皮の方向にストロークを作ります。シェービング後、マウスの切開部位の周囲を75%アルコールとクロルヘキシジン溶液と交互に3回消毒する。</li>
	<li>75%のアルコールで加熱パッドを拭いた後、加熱パッドを開け、マウスを加熱パッドの背面に置き、体温を37°Cに保ちます。</li>
</ol>2. マウス肝臓を身体器官イメージングフレームで固定する
メモ:市販の臓器イメージングフレームはまだリリースされていません。
<ol><li>清潔な吸引カップを固定位置に配置します。</li>
	<li>臓器イメージングフィクスチャ(補足図1)を取り付け、75%アルコールで加熱パッドと吸引カップを拭きます。</li>
	<li>吸引カップ(直径5mm)を真空ポンプホースに接続し、真空ポンプをオンにします。</li>
	<li>75%のアルコールで殺菌された無菌表では、75%のアルコールとクロルヘキシジン溶液と交互にマウスの切開部位の周りを3回消毒し、75%のアルコールとクロルヘキシジン溶液でマウスの切開部位の周りを3回殺菌し、手術用ハサミを使用して下皮の2cmを切り落とし、マウスの境界部から皮膚の2cmを切断する。</li>
	<li>ホルダーベースに加熱パッドと一緒にマウスを置きます。</li>
	<li>吸引カップが肝臓を保持するように臓器イメージングフィクスチャを調整します。次に、肝臓が吸引カップに付着するように、吸引に30〜35 kPaの負圧を使用する(補足図2)。</li>
</ol>3. 多光子レーザー顕微鏡の調整
<ol><li>マルチフォトン顕微鏡をオンにして、60x/1.00 Wの目的を選択します。</li>
	<li>フレームとマウスを対物レンズの下に固定します。</li>
	<li>吸引カップの中心であるレンズ全体を覆うことができる通常の生理液線の滴を加え、通常の生理液線に触れるだけである対物レンズを調整します。</li>
	<li>コンピュータアイコンをダブルクリックしてレーザーソフトウェアをオンにし、スイッチをオンにします。次に、電源ボタンとシャッターを3 sの長押しします。</li>
	<li>波長を800 nmに設定します。</li>
	<li>コンピュータを使用して、顕微鏡操作ソフトウェアを起動します。</li>
	<li>取得設定に対しては、レーザー 800を設定します。</li>
</ol>4. 多光子レーザー顕微鏡による観察
<ol><li>[ 画像取得コントロール] で 、[蛍光 ]スイッチをクリックします。</li>
	<li>部屋と機器の照明が消灯していることを確認します。騒音レベルを下げるには、暗い環境で顕微鏡を使用してください。</li>
	<li>顕微鏡のライトパスシャッターを開きます。</li>
	<li>蛍光フィルターを第4の歯車に回転させ、光スイッチの2つのレバーを引きます。</li>
	<li>接眼レンズを見て、焦点距離を調整するために粗く細かい焦点を合わせる準渦巻きを使用し 、X/Y 軸を使用して、ターゲット領域を見つけるために視野を調整します。</li>
</ol>5. 多光子レーザー走査顕微鏡
<ol><li>ソフトウェアの蛍光スイッチをオフにし、蛍光フィルターを第2のギア(セカンドギアはRXD1)に切り替え、光スイッチの2つのレバーを押します。</li>
	<li>フォーカス ×2 をクリックしてターゲット領域をプレビューし、取得設定と画像取得制御パラメータを調整します (画像解像度: 1024)。</li>
	<li>コントロール+Cを押して、高電圧、ゲイン、オフセットを調整します(ノイズレベルを下げます)。</li>
	<li>[Stop]をクリックしてプレビューを停止し、[XY]ボタンをクリックして 2 つのディメンションでスキャンし、完了後に保存します (図 1)。</li>
	<li>領域を選択し、[深さ]をクリックし、[プレビュー]をクリックして、終了セットを選択し、顕微鏡設定でセットを開始します(血管の完全な必要部分を参照)。3D画像をスキャンして、完了後に保存します(図2)。</li>
	<li>リージョンを選択し、 時間をクリックして、他の取得設定と画像取得制御パラメータを調整します(ステップサイズ:1 μm;スライス: 10;タイムスキャン番号:40)。異なるスライスをスキャンし、完了後に保存して、動画を取得します (ビデオ 1)。 注:誰かがスキャン中にマウスの世話をし、それに応じて麻酔を追加してもらいます。</li>
	<li>首の解剖によってマウスを犠牲にする。</li>
</ol>

<ol><li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-photon+microscopy+in+cardiovascular+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Multi-photon microscopy in cardiovascular research.</a> Methods. 130, 79-89 (2017).</li>
<li>Zhou, M., Ling, W., Luo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrahepatic+mass-forming+cholangiocarcinoma+growing+in+a+giant+hepatic+hemangioma%3A+A+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22Medicine+%28Baltimore%29%22%5BJournal%5D)">Intrahepatic mass-forming cholangiocarcinoma growing in a giant hepatic hemangioma: A case report.</a> Medicine (Baltimore). 98 (27), 16410(2019).</li>
<li>Werkmeister, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+microscopy+for+blood+vessel+imaging%3A+new+non-invasive+tools+%28Spectral+SHG%2C+FLIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Hemorheology+and+Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Multiphoton microscopy for blood vessel imaging: new non-invasive tools (Spectral SHG, FLIM).</a> Clinical Hemorheology and Microcirculation. 37 (1-2), 77(2007).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Does+optical+microangiography+provide+accurate+imaging+of+capillary+vessels%3F%3A+validation+using+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Does optical microangiography provide accurate imaging of capillary vessels?: validation using multiphoton microscopy.</a> Journal of Biomedical Optics. 19 (10), 1-5 (2014).</li>
<li>Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S., Pramanik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+vascular+imaging+techniques+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Recent developments in vascular imaging techniques in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Biomed Research International. 2015, 783983(2015).</li>
<li>Ustione, A., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+introduction+to+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A simple introduction to multiphoton microscopy.</a> Journal of Microscopy. 243 (3), 221-226 (2011).</li>
<li>Centonze, V. E., White, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+excitation+provides+optical+sections+from+deeper+within+scattering+specimens+than+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Journal%22%5BJournal%5D)">Multiphoton excitation provides optical sections from deeper within scattering specimens than confocal imaging.</a> Biophys Journal. 75 (4), 2015-2024 (1998).</li>
<li>Vogt, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatic+multiphoton+imaging+of+the+whole+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chromatic multiphoton imaging of the whole brain.</a> Nature Methods. 16 (6), 459(2019).</li>
<li>Bacskai, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+amyloid-%CE%B2+deposits+in+brains+of+living+mice+permits+direct+observation+of+clearance+of+plaques+with+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Imaging of amyloid-β deposits in brains of living mice permits direct observation of clearance of plaques with immunotherapy.</a> Nature Medicine. 7 (3), 369-372 (2001).</li>
<li>Lendvai, B., Stern, E. A., Chen, B., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience-dependent+plasticity+of+dendritic+spines+in+the+developing+rat+barrel+cortex+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Experience-dependent plasticity of dendritic spines in the developing rat barrel cortex in vivo.</a> Nature. 404 (6780), 876-881 (2000).</li>
<li>Svoboda, K., Denk, W., Kleinfeld, D., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dendritic+calcium+dynamics+in+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo dendritic calcium dynamics in neocortical pyramidal neurons.</a> Nature. 385 (6612), 161-165 (1997).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Deep-Brain+Structural+and+Hemodynamic+Multiphoton+Microscopy+Enabled+by+Quantum+Dots%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">In vivo Deep-Brain Structural and Hemodynamic Multiphoton Microscopy Enabled by Quantum Dots.</a> Nano Letters. , (2019).</li>
<li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+multiphoton+microscopy+as+a+tool+for+studying+renal+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital multiphoton microscopy as a tool for studying renal physiology and pathophysiology.</a> Methods. 128, 20-32 (2017).</li>
<li>Shear, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peer+Reviewed%3A+Multiphoton-Excited+Fluorescence+in+Bioanalytical+Chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Peer Reviewed: Multiphoton-Excited Fluorescence in Bioanalytical Chemistry.</a> Analytical Chemistry. 71 (17), 598-605 (1999).</li>
<li>Heymann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+term+intravital+multiphoton+microscopy+imaging+of+immune+cells+in+healthy+and+diseased+liver+using+CXCR6.Gfp+reporter+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).</li>
<li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+first+fully+human+anti-TEM1+scFv+in+models+of+solid+tumor+imaging+and+immunotoxin-based+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+%26+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Characterization of the first fully human anti-TEM1 scFv in models of solid tumor imaging and immunotoxin-based therapy.</a> Cancer Immunology & Immunotherapy. 66 (3), 367-378 (2017).</li>
<li>Williams, R. M., Zipfel, W. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+microscopy+in+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiphoton microscopy in biological research.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 5 (5), 603-608 (2001).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

特定の生体組織を観察することは、組織17内の物質の変化、局在、および生物学的影響を理解する有効な手段である。この実験では、呼吸や心拍による動きの問題を解決できる臓器イメージングフィクスチャで肝臓を固定し、観察に多光子顕微鏡を使用することが重要です。この方法を用いて、生体内の肝臓の内部組織を多光子顕微鏡で観察し、血管を蛍光標識してその位置や立体構造を明確に観察する。この方法は、物質を蛍光標識し、生体組織内の物質に動的に従うことによって特定の効果を観察し、さらなる可視化を提供するために使用することができる。
多光子顕微鏡は、組織化された組織環境で細胞イベントから情報を収集するための不可欠なツールとなる新しい技術から進化してきました。しかし、特定の組織や臓器の観察に効果的に行うことができるように、安定した画像を生成するために臓器を固定する必要があります。呼吸や心拍からの動きのアーティファクトは、肝臓が直接画像化されるのを防ぐことができるので、真空吸着の原理を使用して臓器を固定し、画像の揺れを防ぐ身体器官の備品が使用されます。真空チャックはま...

血管は、人体の様々な臓器組織に栄養素を提供し、物質を交換することができます。同時に、多くのサイトカイン、ホルモン、薬物および細胞はまた、特定の場所への血管輸送を介して機能する。肝臓組織の血管変化を観察することは、肝臓組織の血流の分布および物質の輸送を理解するのに役立ち、また、ある血管関連疾患の解析に役立つ1,2。
マウスの肝臓の血管を観察する方法はたくさんあります。中でも、光学顕微鏡検査は、不透明血管組織3を観察する上で多くの制限を有する。多光子顕微鏡は、非侵襲的な高分解能4を有する生きた肝臓の血管を画像化するために使用することができる。血管の3次元画像が得られるだけでなく、この技術は、その中の生物学的効果を観察するために組織を整理するのにも役立ちます。さらに、コンピュータ断層撮影や磁気共鳴画像5のように、組織全体をマイクロ血管ではなく画像化することができる。
多光子顕微鏡検査は、より少ない光毒性6で、深部の生体組織における散乱蛍光シグナルを効果的に検出するために使用することができる。したがって、生体組織の活性を確保することができ、そして損傷の量を減らすことができる。多光子顕微鏡は共焦点顕微鏡よりも貫通力が優れ、より深い層を7個観察し、ユニークな3Dイメージングを提供します。多光子顕微鏡は現在、脳神経8のイメージングにしばしば使用され、生きたマウス9、10、11における神経動態の研究に拡張されている。
本実験では、マウス血管の蛍光標識後、肝臓をフレームに固定し、多光子顕微鏡を用いて生きた肝臓組織における血管の動態を見ることができる。この実験は、特定の物質をマークし、多光子顕微鏡を使用して組織内の位置を観察し、細胞間組織における細胞事象を観察し、光化学測定12、13、14を行い、生体組織15内の物質的ダイナミクスを観察する方法を示す。例えば、腫瘍内皮マーカー1(TEM1)は、多くの固形腫瘍において血管および間質に上調節された新規表面マーカーとして同定されており、TEM1に対して単鎖可変フラグメント(scFv)78をマーキングし、そしてその後、多光子顕微鏡をマウス血管腫の位置および腫瘍の評価に使用することができる。

<table><tbody><tr><td>1 mLシリンジ x 2</td><td>湖南省ピナン医療機器技術</td><td>YA0551</td><td></td></tr><tr><td>5 W 加熱パッド</td><td>BiolinkOptics 技術</td><td>BL336</td><td></td></tr><tr><td>75% 無水エタノール</td><td>広東省 光華科学技術</td><td>1.17113.023</td><td></td></tr><tr><td>吸収性綿球</td><td>健康衛生王国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マウス 手術器具</td><td>RWD ライフサイエンス</td><td>SP0001-G</td><td>はさみとピンセットを含む</td></tr><tr><td>多光子顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>FV1200MPE</td><td></td></tr><tr><td>臓器イメージングフィクスチャ</td><td>BiolinkOptics Technology</td><td>BL336</td><td>吸盤、ホース、負圧ポンプ、ブラケットを含む</td></tr><tr><td>ローダミンBイソチオシアネート&ndash;デキストラン</td><td>Σ</td><td>R9379</td><td></td></tr><tr><td>シェービングマシン</td><td>レイワ</td><td>RE-3201</td><td></td></tr><tr><td>ペントバルビタールナトリウム</td><td>Σ</td><td>P3761-25G</td><td></td></tr></tbody></table>

マウス肝組織における血管の多光顕微鏡観察

Multiphoton Microscopic Observation of Vessels in Mouse Liver Tissue

マウス肝組織の血管内ダイナミクスを観察することで、マウス肝臓の組織関連疾患に関するさらなる詳細な観察と研究を行うことができます。マウスは、血管を汚すことができる染料を注入されます。生体内でマウス肝臓を観察するために、フレーム内に露出して固定する。肝臓組織における血管の2つの3次元画像は、多光子顕微鏡を用いて得られる。選択した部位の組織の画像は、長期的な変化を観察するために継続的に取得されます。肝臓組織の血管の動的変化も観察される。多光子顕微鏡は、深部組織切片または器官における細胞および細胞機能を観察するための方法である。多光子顕微鏡は組織の微細構造に対する感受性を有し、生体内で高い空間分解能での生体組織のイメージングを可能にし、組織の生化学的情報を捕捉する能力を提供する。多光子顕微鏡は肝臓の一部を観察するために使用されるが、画像をより安定させるために肝臓を固定することは問題である。この実験では、特別な真空吸引カップを使用して肝臓を固定し、顕微鏡下で肝臓のより安定した画像を得る。また、この方法は、色素でそのような物質をマークすることにより、肝臓の特定の物質の動的変化を観察するために使用することができます。

肝臓における血管の分布は、多光子顕微鏡を用いて得られた 図1に示されている。血管は、幹から発せられる複数の枝に分かれ、周囲の空間に分布する。血管の外周は赤く、内腔は暗く、内部には多くのものがあります。画像が鮮明であるほど、観察の平面に近くなります。色素が周囲の組織を貫通して他の物質を染色するため、周りにいくつかの赤い斑点もあります。 ビデオ1では、赤い血管の中を動く細胞である可能性のある赤以外のものがあります。ビデオの最後に、これらのもののいくつかは暗くなります。これはおそらく、固定肝臓が時間の経過とともに十分に固定されていないためです。この方法では、2時間のイメージングが可能です。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60932/60932fig01.jpg"> 図1:多光子顕微鏡下の肝臓組織の血管。血...

この実験では、マウスを血管を染色できるローダミンBイソチオシアネート-デキストランで尾静脈に注射します。肝臓が露出して固定された後、肝臓の特定の部分を選択して、多光子顕微鏡を用いて生体内の深部組織を観察することができる。

Observing the intravascular dynamics of mouse liver tissue allows us to conduct further in-depth observations and studies on tissue-related diseases of ...

この方法は、複数の次元で肝臓のダイナミクスの進化に沿ってマウス肝臓内の血管の動きを視覚化するのに役立ちます。この方法を用いれば、肝臓内の血管の動態を3次元で可視化できる。血管染料の使用を実証しましたが、顕微鏡的な視覚化の前に目的の物質で血管染色を行うことができます。麻酔下8週齢の雄C 57黒6マウスで右反射の欠如を確認した後。マウスの尾を75%アルコールで拭き、30ゲージ針を装備した1マイクロリットルの注射器を使用して、ローダミンBイソチオシアネート・デキストランの100マイクロリットルに1ミリグラムのローダミンBイソチオシアネート・デキストランを付け加えた尾部静脈に10ミリグラムを注入します。すべての溶液が送達されたら、綿棒を使用して穿刺部位に圧力をかけ、無菌水で濡れたガーゼを使用して腹部の毛皮を浸します。かみそりを使って腹部を剃り、毛皮の方向にストロークを作り、マウスを摂氏37度のアルコールで除菌した加熱パッドの上に置きます。身体臓器イメージングフレームでマウス肝臓を固定するには、まず、きれいな5ミリメートル直径の吸引カップを固定位置に配置し、75%アルコールで加熱パッドと吸引カップを拭きます。吸引カップを真空ポンプホースに接続し、ポンプをオンにします。75%アルコール殺菌テーブルでは、手術用はさみを使用して、マウスの下胸骨の境界から2センチメートルの皮膚を切断し、肝臓を露出させます。マウスと加熱パッドをボディフレームのホルダーベースに置き、吸引カップが肝臓を保持できるように臓器イメージング器具を調整します。次に、肝臓がカップに取り付けることができるように吸引のために30〜35キロパスカルの負圧を使用します。多光子レーザー走査顕微鏡を設定するには、顕微鏡をオンにして、60 Xの目的を選択します。目的の下にフレームとマウスを固定し、レンズをカバーするのに十分な大きさのカップに通常の生理液線のドロップを追加します。レンズが通常の生理音に触れ、レーザーソフトウェアをオンにするように目的を調整します。レーザーをオンにし、電源ボタンとシャッターを3秒間押し続けます。その後、顕微鏡の操作ソフトウェアを起動し、800ナノメートルにレーザーを設定します。画像取得制御を設定するには、蛍光スイッチをクリックし、部屋と機器の照明をオフにします。顕微鏡のライトパスシャッターを開き、蛍光フィルターを第4の歯車に回転させます。オプティカルスイッチの2つのレバーを引いてアイピースを見て、焦点距離を調整するためにコースと細かい焦点準スパイラルを使用します。次に、X Y 軸を使用して、ターゲット領域を見つけるために視野を調整します。イメージングの場合は、ソフトウェアの蛍光スイッチをオフにして、蛍光フィルターを第2のギアに切り替えます。光スイッチの2つのレバーを押し、フォーカス倍を2回クリックして、ターゲット領域をプレビューして取得設定と画像取得制御パラメータを調整し、プレスコントロールとCを押して高電圧ゲインとオフセットを調整します。[停止]をクリックしてプレビューを停止し、[X Y]ボタンをクリックして2次元でスキャンし、[保存]をクリックします。領域を選択し、深さをクリックしてプレビューし、顕微鏡設定で終了セットと開始セットを選択します。3D画像をスキャンして保存します。スキャン後、リージョンのクリック時間を選択し、他の取得設定と画像取得制御パラメータを調整します。次に、別のスライスをスキャンし、結果のイメージムービーを取得するために保存します。ここで示されるように多光子顕微鏡を用いた肝臓内の血管の分布の可視化が、観察できる。この血管は、幹から発せられる複数の枝に分かれ、周囲の空間に分布する。血管内腔が暗い間、血管の外周は赤で観察され、血管内を移動する赤い物体以外の物体が細胞である可能性がある。このビデオで観察された組織の暗闇は、肝臓が時間の経過とともに十分に固定されていない可能性が高い.瘢痕のない肝臓がどのように固定されているかは、画像の安定性に影響を与えることを覚えておくことが重要です。この方法論は、肝臓内の他の構造の位置に適用して、関心のある特定の労働構造の分布または変化を直接観察することができる。

multiphoton-microscopic-observation-of-vessels-in-mouse-liver-tissue

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

光学系は、FITC標識赤血球と肝微小循環を可視化するために、レーザーアシストりんと血管中の酸素分圧を測定​​するために開発されました。このメソッドは、微小血管の構造、直径、血流速度、および酸素分圧を分析することにより、生理学的および病理学的メカニズムを調べるために使用することができます。...

肝微小循環における血流と酸素消費量の可視化と分析：急性肝炎モデルへの応用

近赤外蛍光（NIRF）を使用して、最近開発されたイメージング技術は、リンパ系の癌転移、免疫応答、創傷修復、および他のリンパ関連疾患に果たす役割の解明に役立つことがあります。...

マウスのリンパ脈管構造の非侵襲的光イメージング

このビデオでは、臓器の安定化後に多光子顕微鏡を使用してマウス肝臓組織の血管内ダイナミクスを観察し研究するイメージング手順について説明しています。多光子顕微鏡は、生体組織をin...

多光子顕微鏡法に基づく血管可視化のためのイメージングフィクスチャサポートマウス肝臓病期分類:マウス肝臓の血管の多次元画像を取得するための安定化デバイス支援イメージング技術

この記事では、画像取得と分析のための特定の方法論と組み合わせて、生体内顕微鏡イメージングを使用して、マウスの肝臓血管系の個々の血管内の血流速度の動的測定と定量化の詳細な方法について報告します。...

以下の肝臓の生体顕微鏡イメージング<em&gt;リーシュマニア</em&gt;感染症：肝血行動態の評価

肝臓の免疫細胞の安定した生体内高解像度イメージングは困難です。ここでは、マウス肝臓内の免疫細胞の遊走と細胞間相互作用を、インテンシブケアモニタリングと組み合わせた生体内多光子レーザー走査型顕微鏡法と組み合わせた長時間(約6時間)にわたって研究するための高感度で信頼性の高い方法を提供します。...

CXCR6.Gfpレポーターマウスを使用して、健康で罹患肝臓における免疫細胞の長期生体内多光子顕微鏡イメージング

最小の侵入と生きたマウス肝臓の二光子励起イメージングのための新しい外科プロトコルを設立しました。この手法は、リポポリサッカライド誘起ブタエンドトキシン肝臓の微細構造を確認できた。肝の白血球の遊走に各種の試薬処理の有効性を決定するこのメソッドが利用されることを期待しています。...

リポ多糖投与マウス肝臓における免疫応答時に白血球の二光子励起生体イメージング

ここでは、中隔動脈がカニュール化および加圧されるように、動脈灌流圧および流れを維持する動脈灌流圧および流れのex...

マウス心臓における毛細血管、細動脈、および周囲細胞の動的測定とイメージング

白血球および血小板の動員は、動脈形成中の側副動脈の効果的な成長に必要な必須成分を構成する。多光子顕微鏡は、動脈形成中の白血球の動員と血管外漏出を研究するために、 in vivoで...

マウス後肢モデルにおける動脈形成中の白血球動員モニタリングのための多光子生体内イメージング

ここでは、イソレクチンB4の単一染色を使用して、マウス全体の肺組織の肺微小血管密度の偏りのない定量を行うためのシンプルで経済的なプロトコルについて説明します。...

小葉全体のマウスにおける肺微小血管密度の定量化

高い空間分解能(100μm)と感度を備えた超高速ドップラー超音波(UFUS)は、肝臓血管系の包括的な定性的概要を得るための適切な非侵襲的イメージングモダリティを表しています。UFUSはまた、微小血管系の定量的測定を容易にし、血管疾患のメカニズムの理解を深めることを目的としています。...

超高速ドップラー超音波を用いたマウスの肝血管系のイメージングと定量化

学ぶマウス肝組織における血管動態の多光顕微鏡観察法。Rhodamine B isothiocyanate–dextranを用いた尾静脈注射により、生体内の深部組織構造を三次元的に可視化し、肝臓の血管化をリアルタイムで研究する手法です。

マウス肝組織における血管の多光顕微鏡観察

さらに動画を探す