Name: ミクロチューブ細胞骨格の生細胞イメージングと シロイヌナズナの 微小機械的操作 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-23T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: 学ぶ シロイヌナズナの茎頂分裂組織におけるミクロチューブ細胞骨格の生細胞イメージングと微小機械的操作法。GFP標識を用いて機械的応答を定量的に解析し、植物の形態形成と力学的ストレス応答の理解に貢献します。

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1. 植物の成長
<ol><li>シロイヌナズナズ種子は、緑色蛍光タンパク質(MBD-GFP)10と土壌上に融合した微小管結合ドメインを発現し、長い日(16時間日/8時間夜)、発芽のために1週間20°C/6°Cの条件で保持する。</li>
	<li>発芽後、丈夫な栄養成長を可能にする十分な成長スペースを持つ新しいポットに苗を移す。植物を短い日(8時間日/16時間の夜)、20°C/16 °Cの条件で3〜5週間保ちます。</li>
	<li>長い日(16時間日/8時間の夜)、20 °C / 16 °Cの条件に植物を移し、植物ボルト(2-3週間)まで保ちます。花序を2〜5センチまで成長させる。</li>
</ol>2. 中程度の準備
<ol><li>小さなペトリ皿(幅約5.5cm、深さ1.5cm)を2%アガロースで約半分の深さに充填して、解剖皿を準備します。解剖皿はまた単一のタイムポイントのイメージ投射のために使用することができる。</li>
	<li>成長培地を準備します。<ol>
<li>5gのミオイノシトール、0.05gのニコチン酸、0.05gのピリドキシン塩酸塩、0.5gのチアミン塩酸塩、グリシン0.1gの1000xビタミンストック溶液を調製します。</li>
		<li>1/2ムラシゲとスクーグ培地、1%スクロース、1.6%寒天、1xビタミン、pH= 5.8で構成される成長培地を調製します。オートクレーブとそれを冷却することができます。</li>
		<li>滅菌式のクリーンベンチで、ヒンジ付きプラスチックボックス(約5.2cm x 5.2 cm x 3 cm)を70%エタノールに15分間浸漬して殺菌します。</li>
		<li>滅菌、クリーンベンチでは、培地が耐えられる暖かさになったら、N6-ベンジラジンを最終濃度200nMに加え、1/1,000 PPM(植物防腐剤混合物)をよく混ぜます。滅菌箱を培地で約半分の深さに充填します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. SAMの解剖
<ol><li>花序をカットし、肉眼でそれらを見るのが難しいまで、ペダンクルの基部の花を剥がすことによって鋭い鉗子で古い花芽を取り除きます。</li>
	<li>鉗子で解剖皿のアガロースにスリットを作成し、厚い寒天に花序ベースを植えます。これは、SAMを公開するために、若い花の更なる細かい解剖のための良好な固体サポートを与えます。</li>
	<li>SAMが見えるまで、最も古い、順番に解剖顕微鏡の下で若い段階に進行する鉗子でそれらを押し下げることによって、残りの花芽を取り除きます。SAMは通常、ステージ6〜7までの古い花が取り除かれると露出します。SAM が公開されたら、次のステップに素早く移動してサンプルの脱水を避けます。</li>
</ol>4. 培養されたSAMの移転と成長
<ol><li>セクション1で詳述したように解剖したばかりのサンプルを、中表面の上に露出したSAMを持つ長方形のプラスチックヒンジ培養ボックスの成長培地に植えます。培養ボックスの端に滅菌脱イオン水を数滴加え、蓋を閉じて箱の中の湿度を維持します。追加した水が SAM を覆わないことを確認します。</li>
	<li>蓋を閉め、マイクロポアテープで箱を包みます。成長ボックスを 22 °C の長い日または連続日の条件に置き、SAM が解剖手順から回復し、培養条件に適応できるように 12- 24 時間成長します。</li>
</ol>5. SAM のイメージング
<ol><li>SAMを含む培養ボックスに無菌脱イオン水を充填して、サンプルを覆います。解剖顕微鏡で確認し、1 mLピペットでサンプルに向けられた水を強く噴霧して気泡を取り除きます。</li>
	<li>培養ボックスを直立した共焦点顕微鏡のステージに置きます。培養ボックスが顕微鏡の目的に接触しないように注意してください。カバーガラスを使用しないイメージングに最適な、数値絞り0.8-1の長距離40xまたは60x水浸漬レンズを使用してください。</li>
	<li>水に目的を下げ、目的のフロントレンズに形成された気泡を確認します。ステージを下げ、光学組織でレンズを静かに拭き取り、水に浸漬する前にパスツールピペットで目的のフロントレンズに少量の水を加えることによって、気泡を取り除きます。</li>
	<li>コンフォーカル顕微鏡のGFPフィルターとエピイルミネーションモジュールを使用して、XYコントローラを調整してサンプルを見つけます。眼の位置を調整し、サムを光源の下に置き、頂点が配置されるまで Z 軸に沿って焦点を合わせます。 注:紫外線を直接見ないでください。</li>
	<li>サンプルが見つかったら、GFP(すなわち、488 nmまたは496 nmレーザー光源)が可能なレーザーを使用してそれを照らします。全体のSAMとステージ1花のプリモディアが視野に入るように顕微鏡の光学ズームを調整します。さらに、最適な信号対雑音比を確保するために、レーザー出力とゲイン設定のパワーを調整します。 注:レーザーの強度が高いと、サンプルの写真の漂白が発生します。露出不足と露出過多パレットは、これらの設定をより適切に調整するのに役立ちます。</li>
	<li>サンプルを2〜5分間落ち着かせる。約0.3μmピクセルサイズの分解能で、0.25 μm-0.5 μm Zスライス間隔でサンプルの共焦点Zスタックを取得します。1つのサンプルのZスタックを取得するのに必要な総イメージング時間が、サンプルが水に浸された時点から取得が完了するまで10分を超えないようにしてください。</li>
	<li>すぐに水を取り除き、培養箱を成長室に戻します。サンプルを水中に長時間保管すると、細胞の浸透状態に影響を与えます。</li>
</ol>6. SAM のマイクロメカニカル摂動
<ol><li>セクション5に記載されているようにイメージング条件を設定し、皮質微小管組織の画像積み重ね画像を取得します。</li>
	<li>文化皿の中の水をデカントします。きれいな注射針(0.4 mm x 20 mm)でアブレーションを行います。<ol>
<li>解剖顕微鏡を使用して、慎重に針を保持し、ゆっくりとSAMに近づきます。 注:ゆったりとしたグリップで針を持ち、取り扱う息は揺れを避けるのに役立ちます。</li>
		<li>サムドームに針先を持って簡単に連絡し、アブレーションが行われたことを確認します。好ましくは、SAMの周囲にアブレーションを行い、ドームの中央領域における組織化されていない皮質微小管の挙動および移行を可視化することを可能にする。</li>
	</ol>
</li>
	<li>培養皿に無菌脱イオン水を補充し、ピピジウム・イドジド(10μg/mL)を加えます。GFP皮質微小管信号をモニタリングすることに加えて、別のチャネルを用いてヨウ化プロピジウムを可視化することで、アブレートされた細胞の領域を明確にマークすることができます。ヨウ化プロピジウムは、561 nmまたは600-650 nmの間で記録された放出を有する他の適切なレーザーを使用して照らされる。</li>
	<li>アブレーション直後に画像スタックを取得し(セクション6を参照)、取得プロセスを2時間ごとに6時間繰り返します。培養皿をサンプルと共に、各タイムポイント後にインキュベーションチャンバーに戻します。培養培地に水が残っていることを確認し、乾燥を防ぐために培養皿をマイクロポアテープで包みます。</li>
</ol>7. データの可視化と定量化
<ol><li>このようなMORPHOGRAPHX11、フィジー12、またはマクロサーフカット13などの自由に利用可能なソフトウェアを使用して表面投影を生成します。</li>
	<li>フィジーでFibrilTool14 マクロを使用して皮質微小管異方性の抽出を行う。 注: ソフトウェア使用のための詳細なプロトコルは、それぞれの引用から入手することができます。</li>
</ol>

<ol><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-constructing+our+models+of+cellulose+and+primary+cell+wall+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Re-constructing our models of cellulose and primary cell wall assembly.</a> Current Opinion in Plant Biology. 22, 122-131 (2014).</li>
<li>McFarlane, H. E., Doring, A., Persson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+cellulose+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of cellulose synthesis.</a> Annual Reviews in Plant Biology. 65, 69-94 (2014).</li>
<li>Burgert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+micromechanical+design+of+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Exploring the micromechanical design of plant cell walls.</a> American Journal of Botany. 93 (10), 1391-1401 (2006).</li>
<li>Paredez, A. R., Somerville, C. R., Ehrhardt, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cellulose+synthase+demonstrates+functional+association+with+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of cellulose synthase demonstrates functional association with microtubules.</a> Science. 312 (5779), 1491-1495 (2006).</li>
<li>Barbier de Reuille, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MorphoGraphX%3A+A+platform+for+quantifying+morphogenesis+in+4D%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">MorphoGraphX: A platform for quantifying morphogenesis in 4D.</a> Elife. 4, 05864(2015).</li>
<li>Kierzkowski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elastic+domains+regulate+growth+and+organogenesis+in+the+plant+shoot+apical+meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Elastic domains regulate growth and organogenesis in the plant shoot apical meristem.</a> Science. 335 (6072), 1096-1099 (2012).</li>
<li>Heisler, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alignment+between+PIN1+polarity+and+microtubule+orientation+in+the+shoot+apical+meristem+reveals+a+tight+coupling+between+morphogenesis+and+auxin+transport%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Alignment between PIN1 polarity and microtubule orientation in the shoot apical meristem reveals a tight coupling between morphogenesis and auxin transport.</a> PLoS Biology. 8 (10), e1000516(2010).</li>
<li>Louveaux, M., Rochette, S., Beauzamy, L., Boudaoud, A., Hamant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+mechanical+compression+on+cortical+microtubules+in+Arabidopsis%3A+a+quantitative+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The impact of mechanical compression on cortical microtubules in Arabidopsis: a quantitative pipeline.</a> Plant Journal. 88 (2), 328-342 (2016).</li>
<li>Nakayama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+regulation+of+auxin-mediated+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical regulation of auxin-mediated growth.</a> Current Biology. 22 (16), 1468-1476 (2012).</li>
<li>Marc, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+GFP-MAP4+reporter+gene+for+visualizing+cortical+microtubule+rearrangements+in+living+epidermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A GFP-MAP4 reporter gene for visualizing cortical microtubule rearrangements in living epidermal cells.</a> Plant Cell. 10 (11), 1927-1940 (1998).</li>
<li>Strauss, S., Sapala, A., Kierzkowski, D., Smith, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Plant+Growth+and+Cell+Proliferation+with+MorphoGraphX%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying Plant Growth and Cell Proliferation with MorphoGraphX.</a> Methods in Molecular Biology. 1992, 269-290 (2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Erguvan, O., Louveaux, M., Hamant, O., Verger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ+SurfCut%3A+a+user-friendly+pipeline+for+high-throughput+extraction+of+cell+contours+from+3D+image+stacks%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">ImageJ SurfCut: a user-friendly pipeline for high-throughput extraction of cell contours from 3D image stacks.</a> BMC Biology. 17 (1), 38(2019).</li>
<li>Boudaoud, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FibrilTool%2C+an+ImageJ+plug-in+to+quantify+fibrillar+structures+in+raw+microscopy+images%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">FibrilTool, an ImageJ plug-in to quantify fibrillar structures in raw microscopy images.</a> Nature Protocols. 9 (2), 457-463 (2014).</li>
<li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+wall+cellulose+synthase+regulates+shoot+apical+meristem+mechanics+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth.</a> Development. 146 (10), (2019).</li>
<li>Hervieux, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mechanical+Feedback+Restricts+Sepal+Growth+and+Shape+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">A Mechanical Feedback Restricts Sepal Growth and Shape in Arabidopsis.</a> Current Biology. 6 (8), P1019-P1028 (2016).</li>
<li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+and+supracellular+mechanical+stress+prescribes+cytoskeleton+behavior+in+Arabidopsis+cotyledon+pavement+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Subcellular and supracellular mechanical stress prescribes cytoskeleton behavior in Arabidopsis cotyledon pavement cells.</a> Elife. 3, e01967(2014).</li>
<li>Sampathkumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+wall+cellulose+synthase+regulates+shoot+apical+meristem+mechanics+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Primary wall cellulose synthase regulates shoot apical meristem mechanics and growth.</a> Development. 146 (10), dev179036(2019).</li>
<li>Uyttewaal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stress+acts+via+katanin+to+amplify+differences+in+growth+rate+between+adjacent+cells+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanical stress acts via katanin to amplify differences in growth rate between adjacent cells in Arabidopsis.</a> Cell. 149 (2), 439-451 (2012).</li>
<li>Hamant, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+patterning+by+mechanical+signals+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Developmental patterning by mechanical signals in Arabidopsis.</a> Science. 322 (5908), 1650-1655 (2008).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

メカノ知覚と伝達経路に関与する分子調節因子を特定するには、機械的信号伝達事象の評価が重要です。ここで説明するプロトコルは、シロイヌナズナズムのこのようなプロセスの読み出しとして皮質微小管応答を使用して、このような事象の定量的なビューを提供する。ここで説明する手順は、様々な組織タイプ16、17、18、19のいくつかの研究で日常的に使用されています。微小管異方性の有意な増加は、全ての組織タイプにおいて4時間の範囲で観察される。
プロトコルの最も重要なステップは、それ自身の水が細胞のturgor圧力の増加をもたらすので、水中の長期の水没のために微小管への変更が起こらないことを保証することです。したがって、撮像時間を最小限に抑える必要があります。これにより、画像の解像度が損なわれますが、摂動結果をより正確に読み取ること...

植物細胞は、機械的にその機械的特性を動的に変化させることができる繊維強化複合材料に似た多糖類及び糖タンパク質の細胞外マトリックスに囲まれている1。植物細胞の成長は、細胞への水の取り込みによって駆動され、細胞壁に引張力が蓄積する。このような力に応じて、細胞壁の物理的状態に対する変更は細胞の拡張を可能にする。一次壁を有する細胞は、主に多糖類の化学組成の違いにより細胞を含む二次細胞壁と比較して急速な成長を遂げることができる。一次壁細胞は、糖タンパク質に加えてセルロース、ヘミセルロース、ペクチン、およびグリグニンを欠いて、二次細胞壁2に存在する成分から構成される。セルロースは、β-1,4結合を介して結合したグルコースポリマーであり、細胞壁の主要成分である。細胞増殖時に経験した高い引張力に耐えることができるフィブリラー構造に編成される3.引張力に耐えるだけでなく、優先方向に沿った機械的補強は、セルロースマイクロフィブリルの正味方向に垂直な軸に沿ってターゴール駆動の膨張をもたらす。セルロースミクロフィブリルの組織は、皮質微小管細胞骨格の影響を受け、原形質膜4に位置するセルロース合成複合体の方向運動を導くようにする。したがって、蛍光分子と融合した微小管関連タンパク質または管状管を用いた皮質微小管組織をモニタリングすることは、植物細胞におけるセルロースの上層パターンの観察の代理となる役割を果たす。
皮質微小管細胞骨格のパターニングは、細胞および組織形態の制御下にある機械的な力を導く。皮質微小管組織は、SAMの頂点に位置する細胞に経時の優向組織を有していないが、一方、周囲およびSAMと新興器官の境界内の細胞は、皮質微小管5の安定した高度に組織化された超細胞アレイを有する。細胞の機械的状態を物理的に摂動させるいくつかのアプローチが開発されている。浸透圧状態の変化は、細胞壁の剛性に影響を与える薬理学的および酵素的化合物による治療と同様に、細胞6,7が経験する引張力の後続の変化をもたらす可能性がある。組織が経験する圧縮力の漸進的増加を可能にする仕掛けの使用は、別の代替8である。遠心力の適用は、細胞9との物理的接触なしに機械的な力に影響を与えることも示されている。しかし、細胞群の指向性力を変化させる最も広く使用されている手段は、すべての表皮細胞が緊張下にあり、細胞の物理的なアブレーションが細胞のターゴール圧力を局所的に排除し、細胞間接着を破壊し、それによって隣接細胞が経験する引張力を改変するという事実を利用する。これは、高出力のパルス紫外線レーザーをターゲットにするか、細かい針を使用して行われます。
ここでは、SAMにおける機械的摂動に対する皮質微小管挙動のイメージングおよび評価のプロセスについて詳しく説明する。

<table><tbody><tr><td>FibrilTool</td><td></td><td></td><td>Boudaoud, A. et al., Nat Protoc. 2014</td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td>Schindelin, J. et al., Nat Methods. 2012</td></tr><tr><td>glycine</td><td>Merck</td><td>1.04201.1000</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 confocal microscope</td><td>Leica</td><td>DM6000 CS</td><td></td></tr><tr><td>MAP4-GFP</td><td></td><td></td><td>Marc, J. et al., Plant Cell 1998</td></tr><tr><td>micropore tape</td><td>Leukopor</td><td>02482-00</td><td></td></tr><tr><td>MorphographX</td><td></td><td></td><td>Strauss, S. et al., Methods Mol Biol. 2019</td></tr><tr><td>myo-inositol</td><td>Sigma</td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>N6-benzyladenine</td><td>Sigma</td><td>B3408</td><td></td></tr><tr><td>nicotinic acid</td><td>Sigma</td><td>N4126</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックヒンジボックス</td><td>Electron microscopy sciences</td><td>64312</td><td></td></tr><tr><td>PPM (Plant Preservative Mixture)</td><td>Plant Cell Technology</td><td>PPM</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>Sigma</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>塩酸ピリドキシン</td><td>Sigma</td><td>P9755</td><td></td></tr><tr><td>SURFCUT</td><td></td><td></td><td>Erguvan, O. et al., BMC Biol. 2019</td></tr><tr><td>thiamine hydrochloride</td><td>シグマ</td><td>T4625</td><td></td></tr></tbody></table>

ミクロチューブ細胞骨格の生細胞イメージングと シロイヌナズナの 微小機械的操作

Live Cell Imaging of Microtubule Cytoskeleton and Micromechanical Manipulation of the Arabidopsis Shoot Apical Meristem

細胞および組織レベルの成長と形態形成の調節を理解することは、何十年もの間、生物学的研究の最前線にありました。分子および画像技術の進歩により、生化学的シグナルが形態遺伝学的事象にどのような影響を与えるかについての洞察を得ることができました。しかし、生化学的シグナルとは別に、機械的手がかりも細胞および組織の成長のいくつかの側面に影響を与えることがますます明らかになっています。 シロイヌナズナは 、すべての地上臓器の生成を担当するドーム型の構造である。植物細胞における非製化セルロース沈着を媒介する皮質微小管細胞骨格の組織は、空間的に異なっている。セルロースは植物細胞壁の最も硬い成分であるため、細胞の細胞の生物学的性質を理解するためには、皮質微小管のパターンの視覚化と定量的評価が必要です。皮質微小管組織のステレオタイプ形態はまた、SAMに存在する組織全体の物理的な力の結果でもある。これらの物理的な力の摂動と皮質微小管組織のその後のモニタリングは、メカノ知覚および伝達の仲介に関与する候補タンパク質の同定を可能にする。ここでは、このようなプロセスを調査するのに役立つプロトコルについて説明します。

図1は、ドームの中心に組織化されていない皮質微小管を含む細胞を有するMBD-GFP線から得られた典型的な投影画像と、周分布を有する周辺の細胞(図1A,B)を示す一方、境界ドメイン細胞には細胞の長い軸に平行に整列した皮状微小管が含まれている。これらの観察は、SAMの異なる領域における皮質微小管の空間分布の違いを示す。時間経過イメージングは、切断の6時間以内に、非常に乱れたアレイからより組織化されたアレイに変化する皮質微小管アライメントを示した(図1C,D)。FibrilToolを用いて生成されたテンソルは、皮質微小管画像に重ね合わせることができる。長いテンソルは異方性の程度が高いことを表した。テンソルはまた、皮質微小管の整列の長軸を示した。抽出された情報は、平均異方性を経時にポッティングすることによって表すことができる(<stro...

ここでは、細胞内の細胞骨格を撮影する上皮状の微小管細胞骨格を生細胞イメージングするためのプロトコルを説明し、物理的な力の変化に対する応答を監視する。

Understanding cell and tissue level regulation of growth and morphogenesis has been at the forefront of biological research for many decades. Advances in ...

このプロトコルは、植物における微小管細胞骨格の挙動の発生を理解するのに役立ちます。同時に、細胞や臓器の形状に影響を与えるこれらの構造成分が機械的な力の変化にどのように反応するかを理解するのにも役立ちます。しかし、この方法はほとんど洗練された必要はありませんが、それは堅牢な、定量的な読み取り後、異なる遺伝子型と条件間の機械的応答の違いを提供します。1週間の長い日の条件下で20度と6°Cで、土壌中の緑色蛍光タンパク質と融合した微小管結合ドメインを発現するシロイヌナズナズの種子を成長させることから始めます。発芽後、強力な栄養成長を可能にする十分な成長スペースを持つ新しいポットに苗を移し、短い日の条件下で20度と16度の植物を置きます。3~5週間後、植物をボルトまで同じ温度で長い一日の条件に戻し、花序を2〜5センチメートルまで成長させます。シュートアピカルメリステム解剖のために、花序を入れて、古い花の芽を取り除くために肉眼でペダンクを見ることが困難になるまで、ペダンルクの基部の花を剥がすために鋭い鉗子を使用します。鉗子を使用して、解剖皿の中にアグロスにスリットを作成し、花序ベースを厚いオーグルに植えます。皿を解剖顕微鏡の下に置きます。最も古い花芽から始まり、植物から花の芽を削除するために鉗子でプッシュ。シュート・アペリカル・メリステムは、通常、ステージ6〜7までの古い花が取り除かれると露出します。そして、シュートのアピカルメリステムが見えるまで、各花芽を押し下げるために鉗子を使用してください。すぐに、シュートの叙液状メリステムが露出されると、エタノール滅菌された長方形のプラスチックヒンジ培養ボックスに新たに解剖したサンプルを培地表面の上に露出させたシュートのアピカルメリステムと共に培養ボックスに入れておきます。培養ボックスの端に滅菌脱イオン水を数滴加え、蓋を閉じて箱の中の湿度を維持します。箱をマイクロポアテープで包み、成長箱を12〜24時間摂氏22度の長いまたは連続した日の条件下に置きます。解剖手順から植物が回復したら、滅菌脱イオン水でサンプルを覆い、解剖顕微鏡の下で気泡をチェックします。培養ボックスをアップリ直立型共焦点顕微鏡ステージに移し、40または60X水浸漬レンズを選択します。水に目的を下げ、物体の前面レンズに気泡がないか確認します。気泡を取り除くために、ステージを下げ、光学組織でレンズを静かに拭きます。その後、パスツールピペットを使用して、水にレンズを再浸漬する前に、目的のフロントレンズに少量の水を追加します。次に、コンフォーカル顕微鏡のGFPフィルタとエピイルミネーションモジュールを使用して、サンプルを見つけるためにXYコントローラを調整します。眼の位置を調整し、光源の直下に射目のアピオメリステムを配置し、頂点が配置されるまでZ軸に沿って焦点を合わせます。サンプルを照らすのにGFPを励ますことができるレーザーを使用し、顕微鏡の光学ズームを調整して、撮影の全てのパイオメリステムとステージ1の花のプリモリアが視野に入るようにします。次に、レーザー出力のパワーとゲイン設定を調整し、最適な信号対雑音比を得ます。サンプルを2~5分間落ち着かせ、0.25~0.5マイクロメートルのZスライス間隔でサンプルの共焦点Zスタックを取得し、約0.3マイクロメートルのピクセルサイズの解像度を追加します。取得終了時に、すぐに水を取り出し、培養箱を成長室に戻します。マイクロメカニカルシュート・アピカル・メリステム・摂動のために、先述のように皮質微小管組織のアブレーション前画像スタックを取得し、培養箱から培養皿に水をデカフします。分析顕微鏡の下でシュートのアピカルメリステムを移し、ゆっくりときれいな0.4 x 20ミリメートルの注射針でシュートのアピカルメリステムに近づいた。アブレーションが完了したことを確認するために、針先でシュートのアピカルメリステムのドームの周辺を簡単に接触します。そして、滅菌脱イオン水で培養皿を補充します。次に、ヨウ化プロピジウム1ミリリットル当たり10マイクログラムを皿に加え、2時間ごとに6時間ごとに実証したように画像スタックをすぐに取得し、各時間の間の培養皿をインキュベーションに戻します。データ解析では、適切な画像解析ソフトウェアプログラムを使用して画像スタックの表面投影を生成し、フィジーのフィブリルツールマクロを使用して皮質微小管異方性の抽出を行います。ここで、組織化されていない皮質微小管を含むドームの中心にある細胞を有する微小管結合ドメインGFP線から得られた典型的な投影画像は、周囲の細胞、細胞の長い軸に平行に整列した皮質微小管を含む周回分布および境界ドメイン細胞を有する。タイムラプスイメージングは、アブレーションの6時間以内に、非常に乱れたアレイからより組織化されたアレイに変化する皮質微小管アライメントを示す。テンソルは皮質微小管画像に重ね合わせることができ、抽出された情報は時間の経過とともに平均異方性をプロットすることによって表すことができる。レーザー出力の出力電力とゲイン設定を調整する際には、フィラメントを明確に観察し、飽和した信号が後の分析で引張方向に偏る可能性がありますので、過度の露出を避けるようにしてください。原子間力顕微鏡を用いて、機械的な力の変化が実際に細胞壁の物理的状態に与える影響を評価することもできます。

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Research

JoVE Journal

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ミクロチューブ細胞骨格の生細胞イメージングとシロイヌナズナの微小機械的操作

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