Name: 免疫細胞化学とプロイド分析のための固定心からの心筋細胞の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 学ぶ心筋細胞の分離法。固定心臓組織からロッド型心筋細胞を単離し、DNA含量と核状態を測定する再現性の高い手法です。FijiとRStudioを用いた画像解析により、一貫した細胞収率と形態を確保し、心筋細胞生物学研究に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JHvBは、NIH、再生医療ミネソタ、ハートウェル財団の個別生物医学研究賞からの助成金によって支援されています。

<ol><li>Benjamin, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+Disease+and+Stroke+Statistics-2017+Update%3A+A+Report+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart Disease and Stroke Statistics-2017 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 135 (10), e146(2017).</li>
<li>Heidenreich, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forecasting+the+future+of+cardiovascular+disease+in+the+United+States%3A+a+policy+statement+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Forecasting the future of cardiovascular disease in the United States: a policy statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 123 (8), 933-944 (2011).</li>
<li>Eschenhagen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+Regeneration%3A+A+Consensus+Statement%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte Regeneration: A Consensus Statement.</a> Circulation. 136 (7), 680-686 (2017).</li>
<li>Tzahor, E., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+regeneration+strategies%3A+Staying+young+at+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cardiac regeneration strategies: Staying young at heart.</a> Science. 356 (6342), 1035-1039 (2017).</li>
<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Cell+Generation+and+Turnover+in+the+Human+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart.</a> Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).</li>
<li>Richardson, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Assessment+of+Cardiomyocyte+DNA+Synthesis+and+Ploidy%3A+A+Method+to+Assist+Quantification+of+Cardiomyocyte+Regeneration+and+Turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Assessment of Cardiomyocyte DNA Synthesis and Ploidy: A Method to Assist Quantification of Cardiomyocyte Regeneration and Turnover.</a> Journal of Visualized Experiments. (111), (2016).</li>
<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+cardiomyocyte+renewal+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for cardiomyocyte renewal in humans.</a> Science. 324 (5923), 98-102 (2009).</li>
<li>Senyo, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+heart+renewal+by+pre-existing+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes.</a> Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).</li>
<li>Ang, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 298 (6), C1603-C1609 (2010).</li>
<li>Bergmann, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cardiomyocyte+nuclei+and+assessment+of+ploidy+for+the+analysis+of+cell+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover.</a> Experimental Cell Research. 317 (2), 188-194 (2011).</li>
<li>O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+mouse+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 357, 271-296 (2007).</li>
<li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified%2C+Langendorff-Free+Method+for+Concomitant+Isolation+of+Viable+Cardiac+Myocytes+and+Nonmyocytes+From+the+Adult+Mouse+Heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li>
<li>Shaklee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Click-Chemistry+Reagent+Compatible+with+Mass+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Development of a Click-Chemistry Reagent Compatible with Mass Cytometry.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6657(2018).</li>
<li>Mollova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+proliferation+contributes+to+heart+growth+in+young+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte proliferation contributes to heart growth in young humans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1446-1451 (2013).</li>
<li>Naqvi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+proliferative+burst+during+preadolescence+establishes+the+final+cardiomyocyte+number%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number.</a> Cell. 157 (4), 795-807 (2014).</li>
<li>Roukos, V., Pegoraro, G., Voss, T. C., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+staging+of+individual+cells+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cell cycle staging of individual cells by fluorescence microscopy.</a> Nature Protocols. 10 (2), 334-348 (2015).</li>
<li>Patterson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+of+mononuclear+diploid+cardiomyocytes+underlies+natural+variation+in+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Frequency of mononuclear diploid cardiomyocytes underlies natural variation in heart regeneration.</a> Nature Genetics. 49 (9), 1346-1353 (2017).</li>
<li>Gomes, C. J., Harman, M. W., Centuori, S. M., Wolgemuth, C. W., Martinez, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+DNA+content+in+live+cells+by+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Division%22%5BJournal%5D)">Measuring DNA content in live cells by fluorescence microscopy.</a> Cell Division. 13, 6(2018).</li>
<li>Woo, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+phenotypic+assay+for+proliferation+of+human+iPSC-derived+cardiomyocytes+identifies+L-type+calcium+channels+as+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">High-content phenotypic assay for proliferation of human iPSC-derived cardiomyocytes identifies L-type calcium channels as targets.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 127, 204-214 (2018).</li>
<li>Morikawa, Y., Heallen, T., Leach, J., Xiao, Y., Martin, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin-glycoprotein+complex+sequesters+Yap+to+inhibit+cardiomyocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dystrophin-glycoprotein complex sequesters Yap to inhibit cardiomyocyte proliferation.</a> Nature. 547 (7662), 227-231 (2017).</li>
<li>Bergmann, O., Jovinge, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+cardiomyocyte+nuclei+from+post-mortem+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of cardiomyocyte nuclei from post-mortem tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), (2012).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

心筋細胞は培養で維持することができないので、そのアーキテクチャと機能11を研究できるように原発性心筋細胞を分離することが重要である。したがって、心筋細胞の分離技術は、心臓フィールドで広く使用されています。目標が心筋細胞の機能的側面を決定することであるならば、実行可能な心筋細胞を分離することが重要である。これらの生きた心筋細胞はまた、単離された心筋細胞に対する免疫染色を行うために使用することができる。しかし、生きた心筋細胞を単離する技術を最適化することは技術的には困難であり、最良の技術でさえ、通常は60〜65%の生きた棒状心筋細胞しか得られ、残りの心筋細胞はすべてボールアップして死んでいるか死んでいるか11,12,12である。ここでは、研究者が最初に心臓を固定し、心筋細胞を効率的に分離できる技術を開発しました。この新しいプロトコルは、以前に公開されたプロトコルと比較して、棒状の心筋細胞のはるかに高い収率を可能にします。さらに、核形成とプロイドに基づいて心筋細胞を自動的に分類するイメージング解析プラットフォームを開発しました。これらの新しい方法論により、グループは異なるタンパク質の心筋細胞を染色し、心臓の再生可能性のサロゲートとして心筋細胞の精始および核形成状態を研究することができる。
ここで説明するプロトコルは比較的簡単で、高度な機器なしで実行できます。消化のためのコラゲナーゼの量とインキュベーション時間は、コラゲナーゼロットとそれを提供する会社によって異なる場合があります。コネラゲーゼ2型は、生きた心筋細胞を得るための心臓を消化するのに最も広く用いられているため、2型を用いた。我々の観察に基づいて、我々は線維化のレベルに関係なく、60mg/mLコラゲナーゼタイプ2での夜間インキュベーションがほぼすべてのマウス心臓に最適であると判断した。細胞内タンパク質は固定されており、細胞外コラーゲンほどアクセスできないので、消化過剰の問題は一度もありませんでした。しかし、心臓が適切に消化されない場合、より活発なトリチュレーションが必要になる可能性があり、せん断応力による細胞の断片化を引き起こす。したがって、トリアーレーションに進む前に心臓が適切に消化されていることを確認することが重要です。心臓の硬さは、消化の程度を評価するために鉗子で絞ることによってテストすることができる。コラゲナーゼによるインキュベーションに続いて、心臓は硬くなく、引き裂きやすいはずです。他のタイプのコラゲザーゼも使用できる。以前のレポートでは、コラベナーゼBとD14の組み合わせを使用しました。
さらに、このプロトコルは、心臓15の心筋細胞の総数を評価するために使用できると考えています。しかし、心臓から全ての心筋細胞を得て定量することが目標である場合、コラゲターゼ溶液中で長期間(例えば、3~7日間)、コラゲターゼ溶液を1日1回補充することが重要です。これは、心筋細胞の収量に対するトリウレーションの程度の影響を排除することにより、分離効率の不整合を最小限に抑えます。
DNA含有量を使用して策略を測定することは新しいものではなく、何十年もの間、フローサイトメトリーで使用されてきました。近年、顕微鏡検査を用い、核16あたりのDNA含有量を推定することが同様に可能であることが示された。ここでは、新たに形成された心筋細胞の代理として、心筋細胞核のプロイドを測定するためにこの戦略を実施した。心臓再生の分野における独断は、単核化されたジプロイド心筋細胞のみがサイトカネシスを受け、新しい心筋細胞を生じさせることができるということです。生体内での新しい心筋細胞形成を測定することは非常に困難であるため、DNAヌクレオチドアナログの投与後に追い込まれた心筋細胞を単離し、単核化のレベルを決定し、新しい心筋細胞を生成する心臓の能力の近似として使用されてきた。ここでは、心筋細胞のプロイドを容易に定量化できるImageJのマクロを提供する。G1ピークの位置を正確に推定するには、最低でも500個の核を測定する必要があります。染色および画像化条件が画像プレートの全ウェルにわたって一貫していることを確認するために注意が払われる場合、サンプル全体で500個の核のみを画像化する必要があり、そうでなければ、画像群18、19,19あたり500個の核が必要である。核化とプロイドのイメージングベースの測定の制限は、2次元画像を使用する場合、実際の心筋細胞核から核と接着細胞を区別することが困難である。このような付着細胞は、多核細胞の量を過大評価し、四肢位心筋細胞核集団の測定の精度を低下させる可能性がある。この問題を解決するための1つの可能な戦略は、心筋細胞核マーカーPCM166、2020を使用することです。しかし、適切に固定された細胞や組織に対して信頼性の高いPCM1染色を得ることは困難でした。
もう一つの潜在的な制限は、一部の核染色画像が重要なバックグラウンド細胞質染色を有し、広範な前処理なしでフィジーの組み込みの方法を使用して適切な閾値を防ぐことである。さらに、このバックグラウンド蛍光の予測値への不規則な寄与は、その精度を低下させる。また、細胞がDNA染色液に十分な時間放置されない場合、蛍光色素は核内の飽和に結合せず、核積分強度とDNA含有量の線形関係の仮定は正確ではなくなります。
ソフトウェアは心筋細胞クラスターをセグメント化できず、代わりに分析からそれらを除去する点に留意すべきである。したがって、比較的低密度(例えば、1000細胞/cm2)で心筋細胞を播種することが極めて重要である。さらに、ソフトウェアは、エンドツーエンドと長い、特異な心筋細胞を並べた2つの心筋細胞を区別することはできません。このようなクラスターは、誤って多核化推定を膨らませる可能性があります。
上記の方法では生存可能な心筋細胞を得ることができず、動的細胞プロセスの測定には使用できませんが、免疫染色を行うことが目的であれば、上記の方法は、心筋細胞の収率が高く、形態およびタンパク質局在化の面でより良い品質を有する既存のプロトコルよりも優れていると考えています。最後に、説明した方法は、臨床サンプル14、21,21から心筋細胞を単離するために使用することができる。私たちは、記載された方法論は、異なる研究者が高品質の心筋細胞を取得し、新しい心筋細胞形成の代理人として核形成と策略を測定するのに役立つと信じています。

心臓病は、何十年もの間、西側諸国の大多数で主要な死因となっています1,,2.心血管疾患の治療における多くの改善は生存率を改善しているが、現在、失われた心筋細胞に代わる治療法はない。したがって、心筋細胞機能、増殖、アポトーシスおよび肥大に関する研究は、科学界の主要な焦点であり続けている。成人哺乳類の心臓は再生能力が非常に限られているため、心筋細胞の再生率は年間1%未満と推定され、心筋細胞増殖事象を確実に同定することが極めて重要である3,4。4増殖事象を測定するほとんどの戦略は、以前または現在の増殖を評価するために組み込まれたDNAヌクレオチド類似体の染色、または活性増殖の核マーカーの染色のいずれかに依存する。増殖性心筋細胞の総数が,3,6と非常に少ないため、心筋細胞増殖事象を確実に同定することが特に重要3である。例えば、1%の内因性心筋細胞の1%の更新率に基づいて、1つは、成人マウス心臓77、88において任意の時点で25〜50の心筋細胞が増殖することを見つけることが期待できる。心筋細胞核の同定に不正確な場合は、偽陽性の結果をもたらす可能性があります。したがって、組織学的セクション9から困難で信頼性が低いことが証明されている心筋細胞核を確実に同定することが重要である。心筋細胞の同定は、αアクチニンなどのマーカーを用いても他の細胞型から心筋細胞を区別することは難しいかもしれないので、組織切片からよりもはるかに正確であるが、PCM1は組織学的セクション10における心筋細胞核の信頼できるマーカーであるかもしれない。
現在のプロトコルは、固定前に生きた心筋細胞を単離することに依存しており、これは心筋細胞の少なくとも30%の死を引き起こすことが知られており、心筋細胞11の特定の集団の不注意な選択につながる可能性がある。さらに、これらのプロトコルは、再現性のある結果を提供するために最適化することが困難で有名です。最適化された分離技術でさえ、通常、生きている、様々な収量を持つ棒状の心筋細胞を65%以下に生み出すことができる12.
これらの問題を克服するために、研究者が固定心筋細胞を分離できるプロトコルを開発しました。試料は分離前に固定されるため、収率は最大化され、生体内形態は十分に保存されます。さらに、このプロトコルを使用すると、臨床サンプルから心筋細胞を分離することが可能であり、これは通常、調達直後に固定される。さらに、新たに生成された心筋細胞を同定するためには、個々の心筋細胞の核形成およびプロイド状態を測定することが重要であり、二量心筋細胞のみが典型的には新たに形成されると仮定される。フローサイトメトリーは多核化と多重性を区別できず、比較的時間とリソースを消費するプロトコルです。画像内の核の手動のアウトラインと測定は、非常に低いスループットであり、人間の偏見を起こしやすいです。固定された、分離されたDAPI染色型心筋細胞の画像の自動定量化は、これらの問題の両方を解決します。核生成およびプロイド分布のイメージングベースの定量は、基本的な装置を用いた最低時間と試薬で得ることができます。

<table><tbody><tr><td>イメージング用96ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>3340</td><td>これらのプレートはイメージングに適しているため、これらのプレートを使用しますが、ガラス底プレートは共焦点イメージングに適しています</td></tr><tr><td>アルファアクチニン</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-32462</td><td>この抗体は、心筋細胞のサルコメアのマーカーとして使用されます</td></tr><tr><td>鈍いはさみ</td><td>ファインシザーツール</td><td>14072-10</td><td>心臓を露出させると心臓組織を引き裂く可能性が低いため、鈍いハサミを好みます</td></tr><tr><td>C57BL/6J</td><td>ジャクソン研究所</td><td>664</td><td>心筋細胞集団の倍数性と核形成のイメージング、評価に使用</td></tr><tr><td>CD-1マウス</td><td>チャールズ川</td><td>22</td><td>心筋細胞集団の倍数性と核形成のイメージング、評価に使用</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ 2</td><td>ワージントン</td><td>LS004177</td><td>このプロトコルの目的上、バッチ間の違いは最小限であり、分離銅</td></tr><tr><td>(II)硫酸五水和物</td>の全体的な収量と品質に影響を与えません <td>Sigma-Aldrich</td><td>203165-10G</td><td>教育染色用</td></tr><tr><td>Cy5 ピコリルアジド</td><td>クリック化学ツール</td><td>1177-25</td><td>教育染色に使用されるアジド</td></tr><tr><td>Cytation3</td><td>BioTek-DNA</td><td></td><td>分析の自動イメージングに使用</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズD3571</td><td>DNA染色に使用されるDAPI。ストックを蒸留水に溶解した。</td></tr><tr><td>ロバの反マウスIgG-Alexa568</td><td>Life Technologies</td><td>A10037</td><td>心筋細胞内のアルファアクチニン染色を検出するために使用される二次抗体</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5137</td><td>我々は、これらの湾曲した、鈍い鉗子を使用しますが、まっすぐな鉗子も使用することができます</td></tr><tr><td>塩酸</td><td>フィッシャー科学</td><td>A144212</td><td>Tris-HCl緩衝液のpHをpH 8.5</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>に設定するには<a href="https://imagej.net/Fiji/Downloads">imagej.net/Fiji/Downloads</a></td><td>-</td><td>画像分析に使用</td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255564-100G</td><td>教育染色用</td></tr> 輸<tr><td>液用針</td><td>テルモ</td><td>SV*23BLK</td><td>注射中にこれらのセットで針の位置を操作するのが簡単なため、プロトコル全体で翼のある輸液セットを使用します</td></tr><tr><td>Nikon A1RHD25</td><td>ニコン</td> <td>-</td> <td>アルファ アクチニン染色ナイロン</td></tr><tr><td>メッシュ 200 ミクロン</td><td>Elko フィルタリング</td><td>03-200/54</td><td>メッシュ 通常の心筋細胞 (肥大していない) をろ過するために使用される</td></tr>ナイロン <tr><td>メッシュ 400 ミクロン</td><td>Elko フィルタリング</td><td>06-400/38</td><td>肥大した成人心筋細胞をろ過するために使用されるメッシュ</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (1X)</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td>これはラボで準備することもできます。この実験では無菌性が重要ですが、PBSを調製してろ過するだけで十分であると考えています</td></tr><tr><td>塩化カリウム、粒状</td><td>Mallinckrodt</td><td>6858</td>粒<td>状塩化カリウムは、室温で保存すると凝集体の形成が少ないため、私たちによって好まれました</td></tr><tr><td>R</td><td><a href="http://www.r-project.org/">r-project.org</a></td><td>-</td><td>画像から得られた測定値のデータ分析に使用されます</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td>EdU染色反応のバッファーに使用</td></tr></tbody></table>

免疫細胞化学とプロイド分析のための固定心からの心筋細胞の分離

Isolation of Cardiomyocytes from Fixed Hearts for Immunocytochemistry and Ploidy Analysis

成人哺乳類の心臓は、心筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞を含む様々な細胞タイプで構成される。組織学的セクション上の心筋細胞の核を確実に同定することは困難であるため、多くのグループは、免疫染色を行うために固定前に生存可能な心筋細胞を単離することに依存しています。しかし、これらの生きた心筋細胞分離技術は、最大の最適化にもかかわらずサンプルからサンプルまでの固有の変動を伴い、サンプルの収量、生存率、品質を最大化するための最適化を必要とします。ここでは、個々の心筋細胞の生体内形態を維持しながら最大収量をもたらす心臓の酵素消化前の固定を含む再現性プロトコルを報告する。さらに、個々の心筋細胞の核およびDNA含有量を決定する自動分析プラットフォームを開発しました。胸腔を露出させた後、心臓はPBSで60mM KClで灌流することによって拡張期に逮捕された。次に、心臓を4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液に固定し、次いで60mg/mLコラゲナーゼ溶液で消化した。消化後、細胞をトリチュレーションによって単発化し、心筋細胞画分を差動遠心によって濃縮した。孤立した心筋細胞は、得られた集団の純度を評価するためにトロポニンTおよびαアクチニンのために染色された。さらに、DAPI染色後の心筋細胞核形成とプロイディ状態を決定する画像解析プラットフォームを開発しました。画像ベースの策略評価により、一貫した再現性のある結果が得られました。このように、このプロトコルを用いて、個々の心筋細胞の天然型を保存し、最大収量を達成しながら免疫細胞化学およびDNA含有量分析を可能にすることができる。

心筋細胞は、上記のプロトコルに従って単離した。この方法を用いて、我々は通常、非心筋細胞細胞を汚染することなく比較的純粋である均一に単一化された心筋細胞を得る(図1A)。心筋細胞は、特性サイズと複屈折により明視野顕微鏡で容易に同定されます。この技術は実装が容易で、同等の心筋細胞の収量と品質を持つ異なる分離から一貫した結果を提供します(図1B)。分離された心筋細胞は、さらに使用する前に、数週間4°Cで保存することができます。
上記のプロトコルに従って単離された心筋細胞は、心筋細胞サイズ、心筋細胞プロイド、免疫細胞化学などの様々な下流用途に使用することができる。代表的な結果として、このプロトコルに従って単離された心筋細胞は、特異的タンパク質の局在を検出したり、それぞれ心筋細胞DNA複製を検出するために、クリック化学用の抗体およびフルオロクロム共役アジドを使用して染色できることを示した。例えば、サルコメアの特徴的なz線染色パターンを示すαアクチニンを認識する抗体を用いて心筋細胞を染色した(図2A)。別の実験では、固定心筋細胞を単離する前に、チミジンアナログ5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)をマウスに投与した。心筋細胞単離後、標準的なプロトコル13を用いてEdUを組み込み、単核、二核、三核心筋細胞のいずれかでS相を受けた心筋細胞を検出することができた(図2B)。
分離法の有用性をさらに拡大するため、DNA染色の統合に基づく心筋細胞プロイドの定量を可能にするパイプラインを開発しました。細胞や核のプロイドステータスを測定するには、核および心筋細胞をセグメント化する必要があります。図 3は、個々の核を特定するために使用した戦略の表現を示しています。まず、元の画像DNA染色像(図3A)が強度に基づいて閾値される(図3B)。ここでは、DAPIを使用してDNAを染色しましたが、DNA含有量と線形相関を示す他の核色素は機能します。このプログラムではフィジーの強度閾値法を選択できますが、この例では大津の方法が使用されました。画像の端に触れている、または指定された最小ピクセル領域のしきい値より小さい核マスクは除外されます。次いで、楕円は核マスクにフィットし、個々の核をセグメント化する。図 3Cは、元のイメージにこれらの楕円を重ねて示しています。次に、マスクに穴が埋め込まれ、画像のピクセルは、それらが最も近い楕円に基づいて領域に分割されます (図3D)。これらの領土の境界は、核クラスターを通して線を引くために使用され、核セグメンテーションプロセスを終える(図3E)。
次のステップは心筋細胞の検出を含む。蛍光染色された細胞に基づいて得られる心筋細胞画像(図4A)では、このプロセスは核の場合と非常によく似ています。画像は、選択したしきい値方式(この場合は三角形法)によって計算された強度値に基づいてしきい値を設定します。画像の境界に接触しているか、特定のサイズを下回っている特定の心筋細胞マスクは除外され、正しくセグメント化された心筋細胞を提供するためにマスクに穴が埋められます(図4B)。心筋細胞は核よりも不規則な形状を有するため、心筋細胞クラスターをセグメント化する試みは行われなかった。これらのクラスターは、解析ステップ中に、その最小フェレットの直径の高さにもとづいて除外されます。明るいフィールド画像からのセグメンテーションは、わずかに異なる方法で進行します。まず、元の明視野画像(図4C)は、Sobelエッジフィルタで処理されます。このフィルターは、イメージ内の各ピクセルのグラデーションの絶対値を計算します。急速な変化のある領域のピクセルは高い値を受け取り、画像の滑らかな領域のピクセルは低い値を受け取ります。このエッジフィルターされた画像は、トライアングル法を用いて強度によって閾値され、マスクされた心筋細胞が生じる(図4D)。これらの非常に不規則なマスクは、2ピクセルの半径を持つ円を使用して形態学的閉鎖を介して平滑化され、リンクされ、黒い領域を重ねることなく円が収まらない画像内のすべての白い領域を埋めます(図4E)。最後に、マスク内の穴が埋まり、境界に接触する領域が除外され、小さな粒子が除去され、心筋細胞のセグメンテーションプロセスが終了する(図4F)。
その後、分節化戦略を用いて、個々の心筋細胞の核形成状態を決定することができます。このアプローチを用いて、出生後の早期タイムポイントで、外血CD-1マウスの心臓から単離された心筋細胞の核形成状態を決定した。新生児マウスの心臓(生後1日目)は、その時点で心筋細胞の大部分が単核化されていることを示した(図5:新生児)。この高頻度の単核化心筋細胞は、単核化心筋細胞が全心筋細胞集団の約25%を占める若年マウス(2週齢)でははるかに低い(図5:若年)最後に、心筋細胞内の個々の核のプロイド状態を測定し、それらが二量体か四量体かを判断することができます。これらの結果は、青年期マウスにおける四量体核の高頻度を示す(図6)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60938/60938fig1.jpg"> 図1:固定後の心筋細胞分離の効率。 (A) 核を示すためにDAPIで染色された単離された心筋細胞の代表的な画像。(DAPI(青)、ブライトフィールド(グレー))(B)生後3ヶ月で異なるマウスから分離された心筋細胞の収率。スケールバー= 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/60938fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60938/60938fig2.jpg"> 図2:単離型心筋細胞の免疫細胞化学 (a) αアクチニン(αアクチニン(赤)およびDAPI(青))に染色された心筋細胞の代表的な画像。(B) EdU(赤)とDAPI(青)を組み込んだ心筋細胞に染色した。単核化された代表的な心筋細胞(左)、二核(中央)および三核化(右)およびEdU陽性が示されている。スケールバー= 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/60938fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60938/60938fig3.jpg"> 図3:原子力セグメンテーションの戦略 (A) 元の DAPI チャネルイメージ。(B)しきい値画像(この例では、大津の方法を使用した)。(C) 元の DAPI 染色画像上にオーバーレイされたしきい値イメージから識別されたマスク。(D) 核マスクに基づくボロノイテッセレーション(E) 分割クラスターが強調表示された最終セグメント化された核。スケールバー= 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/60938fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60938/60938fig4.jpg"> 図4:心筋細胞のセグメンテーションの戦略(A)元の蛍光トロポニンI染色心筋細胞画像。(B)三角形の閾値画像、穴を埋め、小さなオブジェクトと境界に触れたものを除外した後。(C) 元の明視野心筋細胞画像 (D) エッジフィルターおよび三角形閾値心筋細胞画像 (E) 2ピクセルの半径でモルフォロジークロージング後のエッジフィルター画像 (F) 穴を埋め、小さな物体と境界に触れたものを除いた画像を除く。スケールバー= 100 μm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/60938fig4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60938/60938fig5.jpg"> 図5:核数に基づく心筋細胞の分類 新生児の心臓(1日齢)は、若年性心臓(生後14日)よりも多くの単核心筋細胞を含む。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/60938fig5large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60938/60938fig6.jpg"> 図6:核1個あたりの心筋細胞DNA含有量の分布 新生児(左)では、単核化CM核の13.5%が四価数であり、二核化CM核の11.9%が四トラピドである。若年(右)では、単核化CM核の33.9%が四価数であり、2核化されたCM核の31.2%が四トラピドである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/60938fig6large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:ソフトウェアのスクリーンショット。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/SoftwareScreenshots.pdf" target="_blank">このファイルを表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。</a>
補足ファイル 2: AnalyzeNucleation.py。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/AnalyzeNucleation.zip" target="_blank">このファイルを表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。</a>
補足ファイル 3: 多核化サーバー.R を分析します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60938/AnalyzeMultinucleatedServer.zip" target="_blank">このファイルを表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。</a>

本研究の目的は、心筋細胞を成体から再現的に単離し、DNAの含有量と核形成を測定する方法を開発することです。

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably ...

このプロトコルは、任意の心臓組織から棒状の心筋細胞を単離する方法を提供し、手動分析なしでこれらの心筋細胞の策略および核形成状態を測定するために使用することができる。他の技術と比較して、我々のプロトコルはより一貫した細胞収量および細胞形態を提供し、フローサイトメトリーとは対照的に、心筋細胞の核形成および策略状態を視覚的に検証することができる。この方法の視覚的なデモンストレーションは、心臓組織の分裂と関連が理解しやすいため重要です。まず、安楽死させたマウスをスーピーンの位置に置き、延長された手足をテーピングします。胸を切り裂いて心臓を露出させるために、鈍い頭のはさみを使用してください。その後、下降大動脈と内静脈カバをカットします。23ゲージの蝶の針で設定された注入に取り付けられた蠕動ポンプを使用して、左心室を通して3ミリリットルの塩化カリウムPBS溶液を注入して心臓を浸透させます。中隔を貫通しないようにしてください。その後、1分間に1ミリリットルの速度で10分間4%PFA溶液の10ミリリットルを注入します。はさみを使って心臓全体を取り除きます。必要に応じて、特定の領域を分離します。4%PFA溶液の1ミリリットルを含む1.5ミリリットル遠心管に組織を入れる。ロッカーに1時間インキュベートします。PBS溶液でシャーレに心臓を入れます。心室に残っているPFAを取り除くためにそれを絞り、PBSでそれを洗います。コラーゲン溶液を含む新しい1.5ミリリットルのチューブに固定心臓を入れます。その後、一晩摂氏37度でロッカーに心臓をインキュベートします。翌日、コラーゲン溶液を含む35ミリメートルのペトリ皿に心臓を入れ、鉗子またははさみで1ミリメートルに解離する。次に、移管ピペットを使用して、解離した組織をさらに2分間トリチュレートする。組織粒子がまだ残っている場合は、より狭い先端を持つピペットを使用し、組織の大部分が分解されるまでトリチュレーションを続けます。15ミリメートルの遠心管の上に200〜600マイクロメートルのナイロンメッシュを置きます。解約した細胞に5ミリリットルのPBSを加え、ナイロンメッシュを通してそれらをフィルタリングします。追加の4ミリリットルのPBSを渡してナイロンメッシュを洗います。次に、1分間Gの10〜100倍にろ過した溶液を遠心分離する。上清を捨て、染色する前にPBSの10ミリリットルでペレットを再懸濁します。フィジーのイメージ J のディストリビューションをダウンロードした後、フィジーを開き、ヘルプをクリックし、更新プログラムサイトを管理します。バイオメッドグループとIFPBプラグインを確認してください。依存関係プラグインをダウンロードするには、楕円分割とmorpho lib J.次に閉じるをクリックして変更を適用します。次に、RStudio をダウンロードして開きます。テキスト原稿のコードをRConsoleのコマンドラインにコピーし、Enterキーを押します。すべての依存関係をインストールするすべてのプロンプトに応答して Y と入力します。画像の定量を実行するには、フィジーを開き、核化をドラッグします。ステータスバーに入ります。スクリプト編集ウィンドウが開いたら、左下隅の[実行]をクリックします。出力データ ディレクトリの場所を尋ねるダイアログ ボックスがポップアップ表示されます。ソフトウェアで使用されるすべての解析データ、数値、およびその他のデータを保存するフォルダを選択します。解析パラメータで、解析する画像の場所を選択し、正規表現を使用して画像ファイル名の形式を入力します。必要な設定を選択したら、[OK] をクリックします。さまざまな段階の分析パイプラインの画像が画面に表示されるように、しきい値とセグメンテーションが正しく行われていることを確認するために、それらを検査します。多核化サーバーを開きます。Rstudio の r。次に、folder name という変数に、最後のステップで選択した出力データ フォルダーへのファイル パスを最後のスラッシュなしで入力します。スクリプト編集ウィンドウの左上隅にある [アプリの実行] をクリックします。スライダーを使用して、最小有効な核平均強度しきい値、最小有効な核面積しきい値、および心筋細胞の最大最小フェレット直径のしきい値を設定します。下にスクロールして[選択したしきい値を適用]をクリックし、[プロット強度分布]をクリックすると、サンプル全体の核強度分布のプロットと、各グループ変数の個別のサブプロットがレンダリングされます。サンプル内変動を考慮するには、下にスクロールしてグループ別に正規化を確認し、[計算]をクリックして推定プロイド分布をプロットします。正規化されたサンプルグラフ全体が表示されたら、2つのピークパターンが表示されます。スライダを使用してしきい値を選択し、ディプロイドピークと四倍数ピークを互いに外れ値から分離します。次に、下にスクロールして、計算策略と核生成をクリックします。最後に、ボタンプロットをクリックして結果フォルダに保存します。この方法は、細胞を汚染することなく比較的純粋である均一に単一化された心筋細胞を分離するために使用することができる。実装が容易で、異なる分離から一貫した心筋細胞の収率と品質を提供します。このプロトコルで単離された心筋細胞は、抗体およびフルオロクロム共役アジードを使用して染色することができる。サルコメアの特徴的なZ線染色パターンを示すために、細胞をαアクチニンを認識する抗体で染色した。別の実験では、EdUを固定心筋細胞を単離する前にマウスに投与した。単離後、S相を経た単核、二核、三核化心筋細胞が検出された。個々の核を同定するために、元のDNA染色像を強度に基づいて閾値した。楕円は核マスクにフィットし、個々の核をセグメント化した。次に、画像のピクセルは、それらが最も近い楕円に基づいて領土に分割され、これらの領土の境界は核クラスターを通して線を引くために使用されました。同様のセグメンテーションプロセスを使用して心筋細胞を検出した。このセグメンテーション戦略は、新生児マウス由来の心筋細胞の大部分が単核化されることを示した。単核化心筋細胞の頻度は、生後2週間のマウスでははるかに低く、全心筋細胞集団の約25%を占める。心筋細胞内の個々の核のプロイド状態を測定したところ、若年マウスで四量体核の高い頻度が検出された。心筋細胞を単離する場合、すべての細胞塊が三分分解を解消していることを確認することが重要です。

isolation-cardiomyocytes-from-fixed-hearts-for-immunocytochemistry

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

成人心筋細胞は動物の心臓から分離し、数日間培養することができる主要な細胞である。この培養期間内にアデノウイルス遺伝子導入は、遺伝的に符号化されたバイオセンサー（GEBs）または蛍光融合タンパク質を発現させることができる。両方のアプローチは、共焦点顕微鏡による細胞の調査を許可する。...

共焦点イメージングのための成人心筋細胞の単離と遺伝子操作

心臓核密度沈降を介して分離し、フローサイトメトリーにより心筋細胞核を識別し、ソートするための中心体周辺物質1（PCM-1）に対する抗体で免疫標識されています。...

事後組織から心筋細胞核の分離

ここでは、ランゲンドルフ灌流システムを使用して、成体マウスcardiomyoctyesの単離を記載している。得られた細胞は、電気的に休止状態、のCa 2 +·トレラントであり、培養およびアデノ又は遺伝子発現を操作するためのレンチウイルスでトランスフェクトすることができる。それらの機能は、MMSYSシステムおよびパッチクランプ技術を用いて分析することができる。...

アイソレーション、文化、および成体マウスCardiomyoctyesの機能解析

野生型および突然変異マウスの個々の心筋細胞を心臓から分離し、その収縮性とカルシウム過渡性を研究することができます。これにより、細胞機能障害が何らかの原因から心臓機能障害に寄与していることを特徴付けることができます。...

マウス心筋細胞の単離と生理解析

心筋細胞の代謝回転の定量化は困難です。ここで説明するプロトコルは、新心筋細胞の核生成と核倍数性の正確で高感度な定量を可能にすることにより、この課題に重要な貢献をします。...

心筋細胞のDNA合成と倍数性の同時評価：心筋細胞再生の定量化を支援する方法および売上高

心筋細胞の細胞分裂と細胞周期の変動を区別するために、私たちは2つのトランスジェニックマウス系統を使用したプロトコルを提示します:Myh6-H2B-mChトランスジェニックマウスは、心筋細胞の核を明確に識別し、CAG-eGFP-アニリンマウスは細胞分裂と細胞周期の変動を区別するためのものです。...

生後心筋細胞における細胞周期変化の可視化と核の決意

ラット心臓から様々な心臓細胞型を単離するためのいくつかのプロトコールが開発され、記載されている。ここでは、単一の調製物から高品質の主要な心臓細胞型（心筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞）の単離を可能にし、実験コストを削減する最適化プロトコルが記載されている。...

成体ラット心臓からの高品質心筋細胞、内皮細胞および線維芽細胞の同時単離

提示は、ビブラートメカット心筋切れスライスからヒトおよび動物心室心筋細胞を単離するためのプロトコルである。カルシウム耐性細胞の高収率(最大200細胞/mg)は、少量の組織(&lt;50mg)から得ることができます。このプロトコルは、最大36時間の冷たい虚血にさらされた心筋に適用可能です。...

ビブラートムカット心筋切れ切り切れからヒト心室心筋細胞を分離

前向き灌流法により、高品質のマウスの心臓細胞を単離するためのシンプルe...

マウスからの心筋細胞分離のための前向きの灌流法

細胞および分子機能実験の心臓病学のゴールドスタンダードは心筋細胞です。この記事では、マウス心筋細胞を単離するための非ランゲンドルフ法への適応について説明します。...

マウス心筋細胞を一貫して単離するための簡単で効果的な方法

学ぶ心筋細胞の分離法。固定心臓組織からロッド型心筋細胞を単離し、DNA含量と核状態を測定する再現性の高い手法です。FijiとRStudioを用いた画像解析により、一貫した細胞収率と形態を確保し、心筋細胞生物学研究に貢献します。

免疫細胞化学とプロイド分析のための固定心からの心筋細胞の分離

さらに動画を探す