Bリンパ球活性化を研究するための牽引力顕微鏡
2020年7月23日
ここでは、B細胞に対する牽引力顕微鏡実験を行うために用いられるプロトコルを提示する。柔らかいポリアクリルアミドゲルの調製とその機能化、顕微鏡でのデータ取得、データ分析の概要について述べています。
この方法により、免疫シナプスでB細胞が適用する力の空間的時間分布を測定し、特定のタンパク質のリクルートと相関させることができる。ポリアクリルアミドゲルを用いた牽引力顕微鏡は実装が容易である。このプロトコルは、多数のB細胞の機械的能力の測定を迅速に設定するために使用できます。
この方法は柔軟であり、インテグリンのような他のリガンドをグラフ化したり、T細胞やフラステキ細胞症のような他の種類の免疫シナプスを研究するように適応することができる。この実験で必要とされるゲルの物理的および化学的性質のために、古典的な牽引力顕微鏡法をB細胞に適応させるのは難しいかもしれません。まず、ゲル支持体をサリン化します。
カバースリップまたはガラス底のペトリ皿をUVランプで2分間アクティブにし、200マイクロリットルのAPTMSで5分間塩分します。これにより、ゲルの共有結合に対する支持体を準備する。カバースリップまたはガラス底皿を超純水で十分に洗い、真空吸引を使用して乾燥させます。
ゲルを平らにするためのカバーリップを準備するには、セラミックカバースリップホルダーに入れ、ホルダーを小さなビーカーに入れ、カバーリップの上にシリコン化試薬を注ぎ、それらを完全に覆うことを確認します。ビーカーをアルミホイルで覆い、室温で3分間放置します。一方、超純水で大きなビーカーを充填します。
シリコン化試薬で3分間のインキュベーションの後、カバースリップホルダーをカバースリップでビーカーに水で移します。カバーリップを超純水で十分に洗い流します。よく乾かして紙の拭き取りに置きます。
最良の結果を得るには、すぐにゲル重合を進めます。原稿の指示に従って500パスカルゲルプレミックスを準備し、プレミックスの167マイクロリットルを1.67マイクロリットルのビーズと組み合わせます。5分間のバス超音波処理器で混合物を超音波処理します。
アルミニウムホイルで光からミックスを保護します。重合を生かすために、1.67マイクロリットルの10%過硫酸アンモニウムをゲルミックスに加え、0.2マイクロリットルのTEMEDを加え、ピペットで混合して重合を開始します。ゲルをキャストするには、9マイクロリットルのゲルを各塩分化カバースリップまたはガラス底皿にピペットします。
すぐにシリコン化カバースリップでゲルを平らにし、鉗子で押し下げて、ゲルがカバースリップの全領域に広がり、その一部が漏れるようにします。カバースリップまたはガラス底皿を大きなペトリ皿に反転させ、ベンチでタップしてビーズをゲル表面に向かって押し付けます。湿ったチャンバーを作成するために皿の上に加湿したティッシュを置きます。
アルミホイルで覆い、1時間インキュベートします。インキュベーション後、PBSをサンプルに添加してカバースリップ放出を容易にする。慎重に針でカバースリップを取り外し、皿をわずかに傾けますが、ゲルがPBSに沈んでいるようにします。
シリコーン化剤としては、アクリルアミド、塩基アクリルアミド、およびTEMEDが吸入により毒性を持つことができる。標準的な個人用保護具を着用し、化学フードの下でこれらの製品を操作します。ゲルからPBSを吸引し、室温でスルフォ-SANPAHの150マイクロリットルを加えます。
ゲルをUV処理に2分間曝し、その後PBSで3回洗浄します。スルフォ-SANPAHとPBSを使用して処理を繰り返し、250マイクロリットルの鶏卵リソチームまたはHELをゲルに加え、アルミニウム箔で覆われた摂氏4度の湿度室で一晩インキュベートします。インキュベーション後、HEL抗原を除去し、PBSでゲルを3回洗浄します。
最後に、500マイクロリットルのB細胞培養培地でゲルを覆い、室温にしておきます。画像処理には、熱および二酸化炭素制御を備えた共焦点顕微鏡を使用してください。ゲルから培地を吸引し、約200マイクロリットルを残す。
ゲルを顕微鏡に置きます。ビーズの2つの主要な層は、ゲルの底部と上部に表示されます。ゲル平面に焦点を当て、画像に等しい領域を見つけます。
イメージングエリアを慎重に選択し、焦点を合わせるようにしてください。適切なビーズ密度と均一な表面は、堅牢で信頼性の高い力の測定を得るための鍵です。MD4マウスから80マイクロリットルの原発Bリンパ球をゲルに加え、焦点を維持するためにゲルに触れるのを避ける。
フォーカスが正しく、セルがエリア内で下降して表示されることを確認します。細胞がゲルに到達する前に取得を開始します。イメージのスタックとしてムービーを開く、マクロの cropandsave.ijm を実行します。
出力ディレクトリを選択し、属性チャネル設定を構成します。長方形ツールで対象領域を選択し、T キーを使用して ROI リストに追加します。完了したら、[OK] をクリックします。マクロがセルのマスクを提案する場合は、それが十分であれば OK をクリックします。
問題がなければ、[OK] をクリックし、任意の選択ツールで閉じた領域を手動で選択し、[続行] をクリックします。MATLAB を開き、tfmv1.mを実行します。必要なパラメータを入力します。
具体的には、取得のピクセルサイズや時間間隔などの画像特性やヤングモジュラスEやポアソン比などのゲル特性を確認します。終了したら、元のファイルと同じディレクトリにソフトウェアの出力を見つけます。正しいビーズ画像は、星空に似た明るいスポットの均一でランダムな分布のように見えます。
ビーズの数が少なすぎる場合や、画像が焦点を合わせない場合、データと分析は信頼できません。細胞と基板の最初の接触の前に付いた基準フレームを用いて、ビーズの動きを目で観察することができる。概算結果は、単一の粒子追跡から得ることができる。
解析では、参照イメージ内のビーズがコントロールとしてセグメンテーションされます。ソフトウェアを用いて、各画素および各時点における局所応力のベクトルである変位および応力場を得ることができる。セルの面積に集積された変位および力場のスカラー製品は、基板上のセルによって発揮される総作業を提供する。
2つの生物学的条件を比較する場合、エネルギーが高原に到達した最後の時間ポイントにわたる平均曲線または平均値を計算することができる。力の空間的情報が関連する場合、各条件の単一の時点を比較することも可能である。蛍光抗原抽出時間経過の一例をここに示す。
シナプスでの蛍光シグナルの進行性の出現は、ゲルからの抗原剥離を示す。蛍光データは、平均抽出曲線を構築するために使用することができる。プロトコルの最もデリケートなステップは、カバースリップの下のゲルの重合です。
このステップは、比較的迅速かつ慎重に行う必要があり、ゲルがカバースリップの下で均一に絞られるようにする必要があります。この手順に従って、Bリンパ球を発現する蛍光タンパク質を使用して、細胞内構造の局在化と力のパターニングを同時に評価することができる。この技術は、遺伝的または化学的摂動と組み合わせて、細胞の収縮性および抗原取り込みにおける特定のタンパク質の役割を評価することができる。
概要
この記事では、B細胞の牽引力顕微鏡実験のプロトコルを提示し、ポリアクリルアミドゲルの準備とデータ取得方法を詳述しています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 免疫学
背景
- 牽引力顕微鏡はB細胞が加えうる力を測定することができます。
- 免疫シナプスの理解は免疫学研究にとって重要です。
- ポリアクリルアミドゲルは細胞の機械的特性を研究するために使用されます。
- 従来の方法をB細胞に適応させることには独特の課題があります。
研究目的
- 免疫シナプスにおけるB細胞の機械的能力を測定すること。
- 力の分布とタンパク質の動員を相関させること。
- 様々な免疫相互作用を研究するための柔軟なプロトコルを提供すること。
使用された方法
- 塩化されたポリアクリルアミドゲルの準備。
- ゲルのUV処理とタンパク質による機能化。
- 共焦点顕微鏡を用いたデータ取得。
- 力の測定のためのImageJとMATLABを使用した画像解析。
主な結果
- B細胞によって加えられる力の測定に成功。
- データの信頼性に影響を与える主要パラメータの特定。
- このプロトコルの他の免疫細胞への適応性の実証。
- 免疫応答中のB細胞の機械的挙動への洞察。
結論
- このプロトコルはB細胞の力学の詳細な分析を可能にします。
- 結果は免疫シナプスのダイナミクスの理解に貢献します。
- 将来的には他の細胞タイプやリガンドに応用される可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Measuring cellular forces at immune synapses provides mechanistic insights into B cell activation, a critical process in humoral immunity and vaccine response. Traction force microscopy enables quantitative assessment of biophysical parameters that correlate with receptor signaling and antigen extraction, supporting target de-risking in biologics development. This approach enhances predictive confidence in early discovery by linking molecular engagement to functional cellular outputs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking BCR engagement to biomechanical responses and protein recruitment at the immune synapse.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct measurement of force-dependent processes in primary B lymphocytes.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by quantifying biophysical signatures of activation that correlate with downstream functional outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for assessing ligand-induced cellular mechanics in a reproducible format.
- Operational Value: Standardizes assay conditions through controlled gel rigidity, bead density, and protein functionalization for reliable force measurements.
- Scalability: Supports screening readiness by enabling rapid setup and imaging of multiple B cells under controlled conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects early discovery findings to preclinical validation by measuring force patterns that reflect physiological immune synapse dynamics.
- Mechanistic De-risking: Reduces ambiguity in target modulation by correlating antigen extraction with intracellular signaling and cytoskeletal reorganization.
- Disease Relevance: Provides a disease-relevant system for studying B cell responses in contexts such as autoimmunity and infectious disease.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target engagement screening to lead optimization by providing quantitative, imaging-based readouts of cellular mechanobiology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring spatial and temporal force distributions that reveal synapse architecture and signaling coordination.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized polyacrylamide gel preparation and bead-based displacement tracking for consistent force quantification.
- Analytics: Generates displacement and stress fields, enabling calculation of total work and energy plateau metrics for comparing activation states.
- Translational Research: Connects to preclinical work by capturing force patterns that mirror physiological antigen presentation and extraction scenarios.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform adaptable to various ligands and immune cell types beyond B cells, including T cells and phagocytic systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in B cell activation pathways through direct biophysical measurement.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via defined gel polymerization, functionalization, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying early biophysical biomarkers of activation that precede functional readouts.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on force-generation capacity linked to antigen extraction efficiency.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, confocal microscopy, and biomechanical analysis using ImageJ and MATLAB.
- Depends on instrumentation for UV treatment, gel polymerization, and environmental control during live-cell imaging.
- Necessitates cross-team standardization of gel preparation, bead density, and protein coating to ensure data comparability.
- Involves adaptation considerations for different cell sizes and ligand densities, particularly for small cells like B cells (~6 µm).
- Includes practical limitations such as toxicity of acrylamide and TEMED, requiring chemical hood use and PPE, and sensitivity to bead density and focus for reliable measurements.
