Name: ライブセル超解像顕微鏡と単一分子トラッキングのための従来のBODIPYコンジュゲート (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 学ぶ従来のBODIPYコンジュゲートを用いたライブセル超解像顕微鏡法で、哺乳類細胞と酵母細胞における脂質滴と脂肪酸を30ナノメートル分解能で可視化する手法。代謝疾患の理解に貢献します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本論文で報告された研究は、国立衛生研究所の国立総合医学研究所が、受賞番号R21GM127965の下で支援した。

注:酵母クローニングと内因性タグ付けについては、最近の出版物10を参照してください。
1. 酵母細胞サンプルのイメージング用調製
<ol><li>w303酵母株の液体一晩培養液を調製する。滅菌木製スティックを使用して、酵母エキス-ペプトン-デキストロースを含む寒天プレートから少量の酵母細胞を、合成完全デキストロース(SCD)培地の〜2 mLで培養管に入れ、その中に少量の酵母細胞を見つけます。270rpmおよび30°Cの揺れインキュベーターでチューブを一晩インキュベートする。</li>
	<li>SCDで細胞の1:50朝希釈を行います。270rpmの振盪インキュベーターで30°Cで4時間希釈した細胞を培養し続け、細胞を指数相で増殖させ、〜0.6の光学密度(OD)に到達させる。 注:この手順は、研究されている代謝状態によって異なる場合があります。BODIPY コンジュゲートは、指数成長段階で細胞を必要としません。.しかし、単一のBODIPY-DIIエミッタを分析するには強すぎるバックグラウンドシグナルを引き起こす可能性がありますので、静止期の間に死んだ細胞からの自己蛍光を認識してください。</li>
	<li>断食細胞を研究するために、培地交換なしで2日間酵母培養を成長させます。</li>
	<li>細胞をめっきする前に~30分で、室温で脱イオン化したH2Oに0.8mg/mLの無菌コンカナバリンA(ConA)の80 μLのチャンバーカバーグラスをインキュベートします。30分後、脱イオン化したH2Oでカバーグラスを3回洗います。</li>
	<li>イメージングの30分前に、チャンバーカバーグラス上の細胞をピペットし、新鮮なSCDの正しい体積で〜0.12の光学密度を達成する(通常、OD〜0.6で240 μL SCDで60 μL酵母培養)。細胞を落ち着かせ、ConA表面に30分間接着させます。</li>
	<li>所望のBODIPYコンジュゲートをチャンバーカバーグラスに直接加え、最終濃度の100 nMで加えます。 注:特定のセルラーコンパートメントのBODIPYsローカル密度に応じて、BODIPY濃度最適化実験が必要な場合があります。</li>
</ol>2. SMLMイメージング用哺乳動物細胞の調製
<ol><li>T25フラスコで10%胎児ウシ血清、4 mMグルタミン、1 mMピルビン酸ナトリウム、1%ペニシリンストレプトマイシン抗生物質を用いて、非蛍光性DMEMの哺乳動物U2OS細胞を維持します。 注:細胞は、10%のウシ胎児血清および1%ペニシリンストレプトマイシン抗生物質を用いてDMEMで維持することもできるが、非自己蛍光溶液でイメージングする前に培地を交換する必要がある。</li>
	<li>70-80%の合流率1:5で細胞を8ウェルプレートの単一のウェルに分割します。8ウェルプレートの細胞をイメージング前に12〜24時間培養する。</li>
	<li>画像化の10分前に、100 nM(ジメチルスルホキシド[DMSO]のストック溶液)の最終濃度で、BODIPY-C 12、LysoTracker Greenまたは他のBODIPYコンジュゲートを追加します。この時間は、所望の実験に応じて変化し得る。 メモ:ライブセルイメージングソリューションを使用して、周囲温度(23°C)でイメージングを行うことができます。しかし、37°Cおよび5%CO2での2非蛍光性DMEMでのイメージングは、10%のウシ胎児血清、4mMグルタミン、1mMピルビン酸ナトリウムおよび1%ペニシリンストレプトマイシン抗生物質を混合して、細胞を生理学的状態に近づけ、生物学的結論を下すために好ましい。</li>
</ol>3. 設備準備
<ol><li>使用されている BODIPY の放出色に基づいて、適切なフィルタ セットをエミッション パスにマウントします。 メモ:クワッドバンド二色ミラー(zt/405/488/561/640rdc)は、最初に励起と発光光を分離します。次に、緑の放出(525 nm)と赤の放出(595 nm)は、二色性ロングパスビームスプリッター(T562lpxr)によって、次いでグリーンチャネルのバンドパスフィルタET525/50、赤チャネルのET 595/50によって分割されます。2つのチャンネルは、同じカメラチップの異なる領域に投影されます。同様に、赤い放射(595 nm)と遠赤色の放出は、最初に二色性ロングパスビームスプリッター(FF652-Di01)によって分割され、次いでバンドパスフィルタET 610/75が赤色で、FF731/137は遠赤色チャネルで分割されます。</li>
	<li>顕微鏡、顕微鏡ステージ、レーザー(488 nm、561 nm)、カメラをオンにします。ここでは、完璧なフォーカスシステムと-68°Cに冷却されたEMCCDカメラを備えた反転顕微鏡が使用されています。</li>
	<li>顕微鏡の目的に浸漬油の滴を加える。</li>
	<li>明視野イメージング、レーザーパワー、レーザーシャッター、イメージング用カメラ設定のLEDライトを制御するHal4000ソフトウェア(材料表参照)を開きます。EMCCDゲインを30に、カメラ温度を-68 °Cに設定します。20 Hzで映画を録画するためにカメラと対応するソフトウェアを準備します。 注:この技術は、光活性化局在化顕微鏡(PALM)および確率的光学再構成顕微鏡(STORM)イメージングが可能な広視野顕微鏡に適用されます。対応するソフトウェアは異なる場合があります。</li>
	<li>顕微鏡ステージヒーターをオンにし、37°Cの温度とCO2レベル5%に設定します。目的の補正カラーを適宜調整します。</li>
	<li>サンプルを顕微鏡ステージに取り付け、フォーカスシステムがかみ合うまで焦点を合わせます。正常なセルが視野に表示されるまで、ステージコントローラーを使用してステージを移動します。 注:室温で酵母細胞をイメージングする場合、ヒーターまたはCO2コントロールをオンにする必要はありません。</li>
	<li>モノマーとダイマーの励起に適したレーザーをオンにします。BODIPYグリーンまたはライソトラッカーグリーンの場合、SMLMのDII状態を励起するために561 nmレーザーを使用し、従来の蛍光のためにモノマーを励起するために488 nmレーザーを使用します。 注:BODIPY赤色の場合は、640 nmレーザーを使用してSMLMのDII状態を励起し、561 nmレーザーを使用して従来の蛍光のためにモノマーを励起します。BODIPY 赤の場合は、561 nm および 640 nm レーザーパワーを調整して、赤チャネルのバルク蛍光を視覚化し、遠赤色チャネルで単一分子バーストを表示します。561 nmの典型的な電力は、640 nmの場合は〜0.06 W/cm2、〜5 kW/cm2です。BODIPYグリーンの場合、561 nm励起の下の緑の放出チャネルで従来の蛍光も見ることを期待する。BODIPY赤色の場合、640 nm励起下の赤色チャネルに従来の蛍光が見えることを期待する。この信号は、連続的なレーザー励起を伴うモノマー/ダイマーの共局在画像に有用となる抗ストークス発光から生じる。</li>
</ol>4. データ取得
<ol><li>モノマーとダイマーの励起のためのロードレーザーシャッターシーケンス。 注: 通常、561 nm で 9 つの単一分子励起フレームを使用し、その後に 488 nm で 1 つの従来の励起フレームを使用します。これは明るい従来の蛍光シグナルを提供し、多色画像化の適用の赤い単一分子の検出チャネルに緑の蛍光蛋白質(GFP)のような別の488 nmの興奮性蛍光色素の漏出を避ける。あるいは、561 nmレーザーを連続的にオンにし、短波長チャネルの従来の画像に対する抗ストークス発光に依存します。</li>
	<li>561 nm励起下の赤ずれた発光チャネルで単一分子蛍光バーストが検出されるようにレーザーパワーを調整し、488nm励起の緑色放射チャネルに従来の蛍光が現れます。561 nmレーザーの典型的なレーザーパワーは、SMLMでは約0.8-1 kW/cm2、従来の蛍光イメージングモードでは488 nmレーザーの場合は0.035-0.07 W/cm2です。2</li>
	<li>映画の保存先フォルダを選択し、5,000~20,000 の取得フレームを記録して、超高解像度イメージを再構築するのに十分なローカリゼーションを収集します。</li>
	<li>別の視野に移動し、上記の手順を繰り返して、より多くのセルからデータを収集します。</li>
</ol>5. データ分析と単一分子トラッキング
<ol><li>ムービーを SMLM 解析ソフトウェアにロードします。 注: 任意のソフトウェア18を使用できます。私たちは、INSIGHT (資料の表を参照)を使用し、imageJ (フィジー) の ThunderSTORM19プラグインを使用して結果をクロス検証します。</li>
	<li>映像を視覚的にスクリーニングし、単一分子蛍光点滅が見えるようコントラスト設定を調整する。必要に応じて、サンプルの一部が継続的に蛍光を発している場合、SMLMデータ分析のための領域またはフレーム範囲を制限する。</li>
	<li>2D ガウス PSF(ROI: ピクセル サイズ 160 nm、幅 260~650 nm、高さ > 50 光子を持つ 7 x 7 ピクセル)に適合するための単一分子識別パラメータを設定します。いくつかのフレーム例を視覚的にスクリーニングして識別パラメータを確認し、単一分子の蛍光バーストを確実に検出する(図1Cを参照)。 注: 高さや幅などの特定の識別パラメータは、視覚的に知覚された単一分子蛍光シグナルの認識を最適化するために、わずかに調整することができます。</li>
	<li>最適化された識別パラメータを使用して SMLM 画像解析を実行し、検出されたフォトン数の逆平方根によって幅が重み付けされた 2D ガウシアンとして各分子をレンダリングします。</li>
	<li>データの品質を評価します。制限されたフレーム範囲を使用して、より特定のインスタンスでの単一分子分布を時間的に観察します。これは、データ取得中のオルガネラの動きを説明することができます。</li>
	<li>さらに、分子分布の空間分布とダイナミクスを分析するには、取得した分子リストをエクスポートし、その座標、外観のフレーム、光子、幅、および高さを含む局在化します。カスタムの作成された分析手順で分子リストをインポートします。</li>
	<li>単一分子分布の空間情報を得るためには、放射状距離20の関数としての局在の密度を表す放射状分布関数ρ(r)を計算する。ρ(r)を得るために、すべてのローカリゼーションのユニークな対方向距離を計算し、高さH(ri)でriを中心としたビンを持ち、幅drで2πri*drで除算してヒストグラムを構築します。(ρ(ri)= H(r i)/π(ri+dr)2-ri2)。iラジアル分布関数を使用して、クラスターの度合いとクラスターの特性サイズを定量化し、比較することができます。</li>
	<li>分子の拡散に関する動的な情報を得るために、連続したデータ取得フレーム内の例えば3ピクセル(0.48 μm)以内に現れる局在化をリンクして、単一分子の痕跡を作成します。 注: リンク距離は、分子の拡散と局在の密度によって異なります。最大リンク距離は、各フレーム21,22,22における局在の密度を分析することによって推定することができる。平均密度はμmあたり0.043の局在性を2と判断した。したがって、半径0.48μmは、異なる分子が相互にリンクされていないことを保証するのに十分な低密度の範囲内でした。</li>
	<li>少なくとも 3 回のラグタイムを持続する複数のトレースからの異なるラグタイム Δt の変位を平均して、平均平方変位(MSD)と Δt プロットを作成します。MSD と Δt の曲線を式 MSD = 4DΔt + σ2に合わせて、平均拡散係数 D3を計算します。</li>
</ol>

<ol><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature Methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).</li>
<li>Manley, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+mapping+of+single-molecule+trajectories+with+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy.</a> Nature Methods. 5 (2), 155-157 (2008).</li>
<li>Wu, C. -Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote+control+of+therapeutic+T+cells+through+a+small+molecule-gated+chimeric+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor.</a> Science. 350 (6258), New York, N.Y. 4077(2015).</li>
<li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angewandte Chemie. 47 (33), International Ed. in English 6172-6176 (2008).</li>
<li>Cordes, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+single-molecule+assembled+patterns+with+superresolution+blink-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Resolving single-molecule assembled patterns with superresolution blink-microscopy.</a> Nano Letters. 10 (2), 645-651 (2010).</li>
<li>Smith, E. M., Gautier, A., Puchner, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Localization+Microscopy+with+the+Fluorescence-Activating+and+Absorption-Shifting+Tag+%28FAST%29+System%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Localization Microscopy with the Fluorescence-Activating and Absorption-Shifting Tag (FAST) System.</a> ACS chemical biology. 14 (6), 1115-1120 (2019).</li>
<li>Yan, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+microscopy+using+noncovalent+fluorogen+activation+by+genetically+encoded+fluorogen-activating+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%3A+A%3A+European+Journal+of+Chemical+Physics+and+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Localization microscopy using noncovalent fluorogen activation by genetically encoded fluorogen-activating proteins.</a> Chemphyschem: A: European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 15 (4), 687-695 (2014).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+super-resolution+imaging+with+qPAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative super-resolution imaging with qPAINT.</a> Nature Methods. 13 (5), 439-442 (2016).</li>
<li>Adhikari, S., Moscatelli, J., Smith, E. M., Banerjee, C., Puchner, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+localization+microscopy+and+tracking+with+red-shifted+states+of+conventional+BODIPY+conjugates+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Single-molecule localization microscopy and tracking with red-shifted states of conventional BODIPY conjugates in living cells.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).</li>
<li>Bergström, F., Mikhalyov, I., Hägglöf, P., Wortmann, R., Ny, T., Johansson, L. B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimers+of+dipyrrometheneboron+difluoride+%28BODIPY%29+with+light+spectroscopic+applications+in+chemistry+and+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Dimers of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY) with light spectroscopic applications in chemistry and biology.</a> Journal of the American Chemical Society. 124 (2), 196-204 (2002).</li>
<li>Bröring, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bis%28BF2%29-2%2C2%27-bidipyrrins+%28BisBODIPYs%29%3A+highly+fluorescent+BODIPY+dimers+with+large+stokes+shifts%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%28Weinheim+an+Der+Bergstrasse%2C+Germany%29%22%5BJournal%5D)">Bis(BF2)-2,2'-bidipyrrins (BisBODIPYs): highly fluorescent BODIPY dimers with large stokes shifts.</a> Chemistry (Weinheim an Der Bergstrasse, Germany). 14 (10), 2976-2983 (2008).</li>
<li>Mikhalyov, I., Gretskaya, N., Bergström, F., Johansson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electronic+ground+and+excited+state+properties+of+dipyrrometheneboron+difluoride+%28BODIPY%29%3A+Dimers+with+application+to+biosciences%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Chemistry+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Electronic ground and excited state properties of dipyrrometheneboron difluoride (BODIPY): Dimers with application to biosciences.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 4 (22), 5663-5670 (2002).</li>
<li>Pagano, R. E., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+BODIPY-labeled+sphingolipids+to+study+membrane+traffic+along+the+endocytic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Use of BODIPY-labeled sphingolipids to study membrane traffic along the endocytic pathway.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 845, 152-160 (1998).</li>
<li>Bergström, F., Hägglöf, P., Karolin, J., Ny, T., Johansson, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+site-directed+fluorophore+labeling+and+donor-donor+energy+migration+to+investigate+solution+structure+and+dynamics+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The use of site-directed fluorophore labeling and donor-donor energy migration to investigate solution structure and dynamics in proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (22), 12477-12481 (1999).</li>
<li>Kowada, T., Maeda, H., Kikuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BODIPY-based+probes+for+the+fluorescence+imaging+of+biomolecules+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">BODIPY-based probes for the fluorescence imaging of biomolecules in living cells.</a> Chemical Society Reviews. 44 (14), 4953-4972 (2015).</li>
<li>Rocha, J. M., Gahlmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Tracking+Microscopy+-+A+Tool+for+Determining+the+Diffusive+States+of+Cytosolic+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (151), (2019).</li>
<li>Sage, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fight+club%3A+assessment+of+2D+and+3D+single-molecule+localization+microscopy+software%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fight club: assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software.</a> Nature Methods. 16 (5), 387-395 (2019).</li>
<li>Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ThunderSTORM%3A+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), Oxford, England. 2389-2390 (2014).</li>
<li>Puchner, E. M., Walter, J. M., Kasper, R., Huang, B., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+molecules+in+single+organelles+with+superresolution+microscopy+allows+tracking+of+the+endosome+maturation+trajectory%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Counting molecules in single organelles with superresolution microscopy allows tracking of the endosome maturation trajectory.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (40), 16015-16020 (2013).</li>
<li>Shim, S. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+fluorescence+imaging+of+organelles+in+live+cells+with+photoswitchable+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Super-resolution fluorescence imaging of organelles in live cells with photoswitchable membrane probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (35), 13978-13983 (2012).</li>
<li>Hansen, A. S., Woringer, M., Grimm, J. B., Lavis, L. D., Tjian, R., Darzacq, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+model-based+analysis+of+single-particle+tracking+experiments+with+Spot-On%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Robust model-based analysis of single-particle tracking experiments with Spot-On.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Bittel, A. M., Saldivar, I. S., Dolman, N. J., Nan, X., Gibbs, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+microscopy+with+novel+BODIPY-based+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Superresolution microscopy with novel BODIPY-based fluorophores.</a> PLoS ONE. 13 (10), (2018).</li>
<li>Wijesooriya, C. S., Peterson, J. A., Shrestha, P., Gehrmann, E. J., Winter, A. H., Smith, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Photoactivatable+BODIPY+Probe+for+Localization-Based+Super-Resolution+Cellular+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">A Photoactivatable BODIPY Probe for Localization-Based Super-Resolution Cellular Imaging.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (39), 12685-12689 (2018).</li>
<li>Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+phototoxicity+in+live+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 14 (7), (2017).</li>
<li>Wäldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., van de Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 15348(2015).</li>
<li>Grimm, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+to+fine-tune+fluorophores+for+live-cell+and+in+vivo+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">A general method to fine-tune fluorophores for live-cell and in vivo imaging.</a> Nature methods. 14 (10), 987-994 (2017).</li>
</ol>

著者らは競合する利益を宣言しない。

このプロトコルでは、従来のBODIPYコンジュゲートを使用して、空間解像度の桁違いの改善を伴うSMLM画像を得る方法を実証しました。この方法は、従来のBODIPY色素の以前に報告された赤シフトDII状態を利用することに基づいており、これは二分子的な出会いを通じて一時的に形成される。これらの状態は、特に赤ずれた波長で励起され、検出され、SMLMには十分にまばらで短命です。レーザーパラメータとともにBODIPYモノマーの濃度を調整することで、局在化と信号対雑音の最適な密度を実現できます。我々は、供給および絶食条件下で生きている酵母細胞において、脂肪酸類似体および中性脂質の細胞内分布と移動性を、約30nm分解能(理論上のトンプソンの公式)で解決した。また、BODIPY DII状態の約40%が20Hzで2つ以上のデータ取得フレームにとどまり、単一分子トラッキングが異なる条件下での移動性を定量化することを可能にすることがわかりました。我々の結果は断食時のBODIPY-FAの差異の局在および移動性を示し、脂肪毒性に対する保護メカニズムを示唆する。単一のBODIPY分子を追跡し、異なる代謝状態下で光学回折限...

確率的光学再構成顕微鏡(STORM)や光活性化局在化顕微鏡(PALM)などの単一分子局在化顕微鏡(SMLM)技術は、アッベの光学回折限界1,22を超える情報を持つ超解像画像を生成する方法として、そして単一1生体分子33,44のダイナミクスを追跡する方法として浮上している。SMLMと互換性のあるプローブの要件の1つは、ポイントスプレッド関数(PSF)の空間的な重複を避けるために、アクティブフルオロフォアの数をいつでも制御できることです。何千ものデータ取得フレームのそれぞれで、各蛍光蛍光蛍光色素の位置は、その対応するポイントスプレッド関数をフィッティングすることによって〜20 nmの精度で決定されます。従来、フルオロフォアのオンオフ点滅は、確率的な光スイッチング11、2、5、2,5または化学的に誘発された固有の点滅6によって制御されてきた。他のアプローチとしては、蛍光物質活性化タンパク質77,88への過渡的結合時の蛍光物質の誘導活性化と、全内部反射蛍光(TIRF)またはライトシート励起における標識DNAオリゴマーのプログラマブル結合結合(TIRF)が含まれる。最近、従来のホウ素二重火メタン(BODIPY)コンジュゲート11、12、1312,13の赤シフト二量体(DII)状態が一時的に形成され、赤シフト波長で特異的に励起され検出されるSMLM10の新しい多目的なラベリング戦略を報告しました。11
BODIPYs は、細胞下の区画と生体分子14,,15,,16に特異的に標識する何百もの変異体を有する色素として広く使用されている。生細胞での使いやすさと適用性のために、BODIPY変異体は従来の蛍光顕微鏡で市販されています。ここでは、何百もの市販のBODIPYコンジュゲートをライブセルSMLMに使用する方法に関する詳細かつ最適化されたプロトコルについて説明します。BODIPYモノマーの濃度を調整し、励起レーザーパワー、イメージング、データ解析パラメータを最適化することにより、生細胞で高品質の超高解像度画像と単一分子追跡データが得られます。低濃度(25-100 nM)で使用する場合、BODIPYコンジュゲートは、赤シフトチャネルのSMLMと従来の発光チャネルにおけるコナルコンルジェンス用蛍光顕微鏡に同時に使用することができます。得られた単一分子データを分析して、不動構造の空間的組織を定量化し、生細胞17における分子の拡散状態を抽出することができる。緑色と赤色の両方の形態のBODIPYプローブの利用可能性は、他の互換性のあるフルオロフォアとの適切な組み合わせで使用する場合、マルチカラーイメージングを可能にします。
本レポートでは、複数色のBODIPY-C 12、BODIPY(493/503)、BODIPY-C12赤、リソトラッカーグリーンを使用して、ライブセル12SMLMデータを取得および分析するための最適化されたプロトコルを提供します。生きている酵母細胞や哺乳動物細胞の脂肪酸と中性脂質を、30nmの分解能で分解します。さらに、酵母細胞が代謝状態に応じて外部付加脂肪酸の空間分布を調節することを実証する。加えたBODIPY-脂肪酸(FA)は、摂食条件下で小胞体(ER)および脂質液滴(LD)に局地的に局部化するのに対し、BODIPY-FAは断食時に血漿膜中に非LDクラスターを形成することを発見した。我々は、生きている哺乳動物細胞におけるリソソームおよびLDを画像化するために、この技術の応用をさらに拡大する。従来の BODIPY コンジュゲートを使用した SMLM 用の最適化プロトコルは、使用可能な無数の BODIPY コンジュゲートを使用してナノスケールで生物学的プロセスを研究するのに役立つリソースになります。

<table><tbody><tr><td>BODIPY C12</td><td>ThermoFisher</td><td>D3822</td><td>緑色脂肪酸アナログ</td></tr><tr><td>BODIPY C12 Red</td><td>ThermoFisher</td><td>D3835</td><td>赤色脂肪酸アナログ</td></tr><tr><td>BODIPY(493/503)</td><td>ThermoFisher</td><td>D3922</td><td>中性脂質マーカー</td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2010</td><td>ガラス表面への細胞固定化</td></tr><tr><td>ドロップアウトミックス 窒素塩基なし 完全</td><td></td><td></td><td>SCD</td></tr>デ<tr><td>キストロース</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>G7021</td><td>用炭素源SCD</td></tr><tr><td>エイトウェル</td><td>Cellvis</td><td>C8-1.58-N</td><td>チャンバーカバーグラス</td></tr><tr><td>エイトウェル、Lb-Tek II</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td></td><td>チャンバーカバーグラス</td></tr><tr><td>ET525/50</td>クロ<td>マ</td><td></td><td>バンドパス</td></tr><tr><td>フィルターET595/50</td>クロ<td>マ</td><td></td><td>バンドパスフィルター</td></tr><tr><td>ET610/75</td><td>クロマ</td><td></td><td>バンドパスフィルター</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140079</td><td>Serum</td></tr><tr><td>FF652</td><td>Semrock</td><td></td><td>Beam スプリッター</td></tr><tr><td>FF731/137</td><td>Semrock</td><td></td><td>バンドパスフィルター</td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>A1896701</td><td>Cell Culture Medium</td></tr><tr><td>Hal4000</td><td>Zhuang Lab, Harvard University</td><td></td><td>データ収集ソフトウェア</td></tr><tr><td>Ixon89Ultra DU-897U</td><td>Andor</td><td></td><td>EMCCDカメラ 光子検出用</td></tr><tr><td>Laser 405, 488, 561, 640 nm</td><td>CW-OBIS</td><td></td><td>励起用レーザー</td></tr><tr><td>Insight3</td><td>Zhuang Lab, Harvard University</td><td></td><td>単一分子ローカリゼー</td></tr><tr><td>ションソフトウェア L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>細胞培養に必要なアミノ酸</td></tr><tr><td>生細胞イメージングソリューション</td><td>ThermoFisher</td><td>A14291DJ</td><td>イメージングバッファー</td></tr><tr><td>Lysotracker Green</td><td>ThermoFisher</td><td>L7526</td><td>ボディベース リソソームマーカー</td></tr><tr><td>哺乳類 ATCC U2OS 細胞 (バージニア州マナッサス)</td><td>Dr. Jochen Mueller (University of Minnesota)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon-CFI Apo 100 1.49 N.A</td><td>Nikon</td><td></td><td>Oil immersion目的</td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>細胞培養用サプリメント</td></tr><tr><td>T562lpxr</td><td>クロマ</td><td></td><td>ビームスプリッター</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td>接着細胞の解離</td></tr><tr><td>W303 MATa 株</td><td>Horizon-Dharmacon</td><td>YSC1058</td><td>親酵母菌</td></tr><tr><td>酵母窒素ベース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1250</td><td>アミノ酸なし窒素塩基</td></tr><tr><td>zt405/488/561/640rdc</td><td>クロマ</td><td></td><td>クワッドバンド ダイクロイック ミラー</td></tr></tbody></table>

ライブセル超解像顕微鏡と単一分子トラッキングのための従来のbodipyコンジュゲート

Conventional BODIPY Conjugates for Live-Cell Super-Resolution Microscopy and Single-Molecule Tracking

一分子局在化顕微鏡(SMLM)技術は、従来の蛍光顕微鏡の光学回折限界を克服し、細胞内構造と生体分子のダイナミクスを〜20nmの精度で解決することができます。SMLMの前提条件は、何千ものデータ取得フレームのそれぞれでポイントスプレッド機能の時空間的な重複を避けるために、暗い状態から蛍光状態に移行する蛍光HOREです。BODIPYは、従来の顕微鏡で使用される多数のコンジュゲートを備えた確立された染料です。赤シフトBODIPY地中状態ダイマー(DII)の一過性形成は、明るい単一分子放出をもたらし、単一分子局在顕微鏡(SMLM)を可能にする。ここでは、生きている酵母および哺乳類細胞における従来のBODIPYコンジュゲートを用いたSMLMのためのシンプルだが汎用性の高いプロトコルを提示する。この手順は、超解像画像を取得し、BODIPY-DII状態を追跡してBODIPYコンジュゲートの時空間的情報を抽出するために使用できます。この手順を応用して、ナノスコピック長さスケールで生きている酵母や哺乳動物細胞の脂質滴(LD)、脂肪酸、リソソームを解決します。また、他の蛍光プローブと併用した場合の、BODIPY色素によるマルチカラーイメージング能力を実証しています。我々の代表結果は、供給および断食条件下で酵母におけるBODIPY脂肪酸および中性脂質の差動空間分布および移動性を示す。SMLM用のこの最適化されたプロトコルは、市販の何百ものBODIPYコンジュゲートで使用することができ、この研究の用途をはるかに超えてナノスケールで生物学的プロセスを研究するのに有用なリソースです。

ここでは、上記のプロトコルに基づいたBODIPYコンジュゲートを用いたSMLMの最適化されたサンプル調製、データ取得および分析手順を提示する(図1A)。SMLMデータを取得して分析するワークフローの例を示すために、酵母にBODIPY(493/503)を採用し、光回折限界を下回るLDを解決します(図1B-F)。-F図2に、GFP、mEos2などの他のプローブと組み合わせたBODIPYの異なるマルチカラーイメージングモードの例を示す。酵母の代謝状態を~48時間同じ培地で増殖させることで、酵母の代謝状態を操作し、BODIPY-C12が、供給条件下でのLDへの組み込みとは対照的に、断食時に細胞周辺において非移動性非LDクラスターを形成することを示す(図3)。さらに、BODIPYコンジュゲートのSMLM能力を哺乳動物細胞に拡張するために、生きたU2OS細胞でBODIPY-C12...

従来のBODIPYコンジュゲートは、一過性形成、赤シフト地盤状態ダイマーの開発を通じて、生細胞単一分子局在化顕微鏡(SMLM)に使用することができます。我々は、生きている哺乳類および酵母細胞における細胞内中性脂質および脂肪酸をナノスコピック長さスケールで追跡し、解決するための最適化されたSMLMプロトコルを提示する。

ライブセル超解像顕微鏡と単一分子トラッキングのための従来のBODIPYコンジュゲート

Single molecule localization microscopy (SMLM) techniques overcome the optical diffraction limit of conventional fluorescence microscopy and can resolve ...

我々のプロトコルは、そのまばらな、赤シフト状態を使用して超解像顕微鏡のための従来のBODIPY染料の使用を記述する。これにより、30ナノメートルの分解能で生きている細胞のオルガネラや生体分子を研究することができます。この方法の利点は、そのシンプルさと、単一分子信号の長期的なソースを提供する異なる利用可能なBODIPYコンジュゲートの汎用性です。我々の実証されたアプリケーションは、脂肪肝疾患や2型糖尿病などの疾患の洞察を得るために重要になる可能性があり、脂質滴と脂肪酸を回折限界以下に解決することによって。酵母細胞や哺乳動物細胞における脂肪酸・脂質滴の生物学の知見を得る。しかし、この技術は、低バックグラウンド蛍光を有する他のすべての透明細胞タイプに適用可能である。初めて技術を使用する場合は、明るい単一分子信号を観察するために、di濃度とレーザーパワーを最適化することを確認してください。この技術の視覚的なデモンストレーションは、レーザーパワーのdi濃度と最適化が明るい単一分子信号をもたらす方法を見るために重要です。T-25フラスコでは、10%の胎児ウシ血清4ミリモルグルタミン、1ミリモルナトリウムピルビン酸、1%ペニシリンストレプトマイシン抗生物質を用いて、非蛍光性DMBMの哺乳類U2OS細胞を維持する。70~80%の合流度で細胞を1~5個に分割し、ピペットを8つのウェルプレートの単一ウェルに分割します。8つのウェルプレートの細胞を12〜24時間変えます。それをイメージングする10分前に、BODIPY-C12ライソトラッカーグリーンまたは他のBODIPYコンジュゲートを追加し、100ナノモルの最終濃度を追加します。使用されている BODIPY の放出色に基づいて、適切なフィルタ セットをエミッション パスにマウントします。顕微鏡の電源を入れます。顕微鏡ステージ、488ナノメートルおよび561ナノメートルレーザー、ならびにカメラ。顕微鏡の目的に新興油の滴を加える。明視野イメージング、レーザーパワー、レーザーシャッター、イメージング用カメラ設定のLEDライトを制御するHAL4000ソフトウェアを開きます。EMCCD ゲインを 30 に、カメラ温度をマイナス 68°C に設定します。20ヘルツで映画を録画するためにカメラと対応するソフトウェアを準備します。顕微鏡ステージヒーターをオンにし、摂氏37度の温度と5%の二酸化炭素レベルに設定します。目的の補正色を適宜調整します。サンプルを顕微鏡ステージに取り付け、フォーカスシステムがかみ合うまで焦点を合わせます。正常なセルが視野に表示されるまで、ステージコントローラーを使用してステージを移動します。モナムスの励起のためのレーザーシャッターシーケンスと調光器、1分子局在化顕微鏡の561ナノメートルレーザーのレーザーパワーが1平方センチメートル当たり821キロワットの間で、赤シフト発光チャネルで単一分子蛍光孔が検出されるような負荷レーザーシャッターシーケンス。488ナノメートルレーザーのポイント035とポイント07ワット/平方センチメートルの間のレーザーパワーを調整して、従来の蛍光が緑色の発光チャネルに現れるようにします。映画の保存先フォルダを選択し、5000 ~20000 の取得フレームを記録して、スーパー解像度のイメージを再構築するのに十分なローカリゼーションを収集します。別の視野に移動し、より多くのセルのデータを収集するために繰り返します。ムービーを単一分子の局在顕微鏡分析ソフトウェアにロードします。単一分子蛍光点滅が見えるように、映像を視覚的にスクリーニングし、コントラスト設定を調整する。2Dガウス、PSFをフィッティングするための単一分子同定パラメータを設定する。いくつかの例のフレームを視覚的にスクリーニングして識別パラメータを確認し、明確な単一分子蛍光バーストを確実に検出します。単一分子局在化顕微鏡を実行するために、分析を行うプレス分析は、最適化された同定パラメータを使用して分析を想像します。そして、検出されたフォトン数の逆平方根によって幅が重み付けされた2Dガウスとして、各分子をレンダリングします。データの品質を評価します。制限されたフレーム範囲を使用して、より特定のインスタンスと時間で単一分子分布を観察します。これは、データ取得中のオルガネラの動きを説明します。本研究では、BODIPYコンジュゲートを用いた単一分子局在化顕微鏡による最適化されたサンプル調製、データ取得および分析手順を発表した。単一分子局在化顕微鏡データを取得および分析するためのワークフローの一例を示すために、酵母におけるBODIPYは、光学回折限界以下の脂質滴を解決するために採用した。GFPやmEos2などの他のプローブとの結合におけるBODIPYの異なる多色イメージングモードの例をここに示す。断食時に細胞周辺の移動性非脂質滴クラスターで形成されたBODIPY-C12は、供給された条件下で脂質液滴に組み込まれるのとは対照的である。さらに、BODIPYコンジュゲートの単一分子局在化顕微鏡機能を哺乳動物細胞に拡張するために、生きたU2OS細胞におけるBODIPY-C12およびライソトラッカーグリーンを画像化した。明るい単一分子信号を可視化し、超解像度画像を再構築するために、BODIPY濃度を最適化するだけでなく、レーザーパワーを刺激することは重要なステップです。この方法は、他のBODIPYコンジュゲートと共に使用して、生きている細胞内の特定の生体分子の特殊な時間的分布において、高解像度の洞察を得ることができます。私たちの技術は、ナノスコピックレンズスケールで脂質滴と脂肪酸生物学をさらに尋問する道を開きました。しかし、このアプリケーションは、様々な機能的なBODIPYコンジュゲートの可用性のために、特定のフィロペステテをはるかに超えています。生物学的サンプルおよび染料を取り扱うための標準的な操作手順に従い、また当社の義務的なヘッジ者であり、レーザー安全手順に従ってください。

conventional-bodipy-conjugates-for-live-cell-super-resolution

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

我々は、細菌のFtsZ-リングの構造、組織、細胞分裂に不可欠な装置を検査する、超解像イメージング法を説明します。この方法は、光活​​性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）画像の定量分析に基づいており、他の細菌の細胞骨格タンパク質に適用することができます。...

細菌分裂機械の超解像イメージング

私たちは、細胞内の複数の種類の蛍光標識分子を同時にイメージングするための蛍光光活性化局在化顕微鏡(FPALM)の使用を実証します。記載されている技術は、単一細胞内で数十ナノメートルの精度で、数千から数十万の個々の蛍光標識タンパク質の局在をもたらします。...

蛍光光活性化局在顕微鏡による生体構造の同時マルチカラーイメージング

タンパク質間相互作用は、二分子蛍光相補(BiFC)と光活性化局在顕微鏡(PALM)を組み合わせることにより、ナノメートルの空間分解能で細胞内で可視化されます。ここでは、個々のRas-Raf複合体のナノスケールクラスタリングと拡散を視覚化するためのU2OS細胞内のRas-Raf相互作用をイメージングするためのBiFC-PALMの使用について説明します。...

二分子蛍光相補性を持つ光活性化ローカライゼーション顕微鏡（BIFC-PALM）

私たちは、接着性、哺乳動物細胞におけるアクチン細胞骨格のイメージングに、干渉光活性化ローカライゼーション顕微鏡（iPALM）、3次元の単一分子の局在超解像顕微鏡法の適用のためのプロトコルを提示します。このアプローチは、そうでなければ、従来の回折限界光学顕微鏡で未解決のままであるナノスケールの構造的特徴の光ベースの可視化を可能にします。...

干渉光活性化ローカライゼーション顕微鏡（iPALM）によってF-アクチンフィラメントの三次元超解像顕微鏡

最近我々 は様々 なタンパク質の一次線毛による生細胞内透過輸送ルートの三次元 (3 D) 空間の場所を割り当てられます。ここで実験のセットアップ、生体試料のプロセスおよびアプローチを新しくイメージング 3 D...

ライブの一次繊毛で高速超解像顕微鏡の応用

3D単分子局在顕微鏡は、生きた細菌細胞における蛍光標識タンパク質の空間位置および運動軌道をプローブするために利用される。本明細書に記載される実験およびデータ分析プロトコルは、プールされた単一分子軌道に基づいてサイトソリックタンパク質の一般的な拡散挙動を決定する。...

単一分子トラッキング顕微鏡 - 細胞細胞分子の拡散状態を決定するツール

我々は、現代の蛍光標識技術を用いて生細胞における膜受容体ダイナミクスを研究するために、フェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)と組み合わせた生細胞二重色蛍光相互相関分光(FCCS)を行う実験プロトコルとデータ分析ワークフローを提示する。...

生細胞におけるタンパク質相互作用とタンパク質ダイナミクスを研究するための二色蛍光相互相関分光法

多くの天然変性タンパク質は、多くの細胞プロセスにとって重要な行動である、非常に動的な生体分子凝縮物の形成に関与することが示されています。ここでは、生細胞内の生体分子凝縮物中でタンパク質が互いに相互作用するダイナミクスを定量化するための1分子イメージングベースの方法を紹介します。...

生体分子凝縮物内のタンパク質相互作用ダイナミクスの1分子測定

このプロトコルは、光学光子再割り当てを備えた回転円盤共焦点顕微鏡を用いて深部全細胞単分子局在顕微鏡(SMLM)を行う手順を示しており、カスタム光学や複雑な照明を必要とせずにDNA-PAINTイメージングを可能にします。...

光学光子再割り当て を用いた回転円 板共焦点によるDNA-PAINTによる全セル超分解能イメージング

このプロトコルは、高解像度のセルラーおよびサブセルラー画像診断のための、多重アレイ検出器と統合されたレーザー走査共焦点顕微鏡システムの高度なイメージングアプリケーションおよび共有リソース管理について詳述しています。このワークフローにより、共焦点から超分解能(~120nm)までのマルチモーダルイメージングが単一のプラットフォーム内で可能となり、ナノスケールの可視化をより容易にします。...

超分解能イメージングと共有管理:多重検出を伴う共焦点顕微鏡のプロトコル

学ぶ従来のBODIPYコンジュゲートを用いたライブセル超解像顕微鏡法で、哺乳類細胞と酵母細胞における脂質滴と脂肪酸を30ナノメートル分解能で可視化する手法。代謝疾患の理解に貢献します。

ライブセル超解像顕微鏡と単一分子トラッキングのための従来のBODIPYコンジュゲート

さらに動画を探す