Name: ゼブラフィッシュインターニューロマスト細胞における共焦点顕微鏡ベースレーザーアブレーションと再生アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュのインターニューロマスト細胞レーザーアブレーションと再生アッセイ。共焦点顕微鏡を用いて感覚前駆細胞の再生挙動を観察し、聴覚障害治療開発への応用可能性を探索する方法です。

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この研究は、NIH R15助成金1R15DC015352-01A1とペース大学の内部資金源によって資金提供されました.魚のラインは、ウラジーミル・コルジ14、ケイティ・キント15、16、そしてA.ジェームズ・ハドスペスの研究室の礼儀でした。A.ジェームズ・ハドスペスと彼のグループのメンバーに、これらの実験に関するフィードバック、およびペース大学の同僚のサポートに感謝したいと思います。RStudioのロジスティック回帰分析は、特に同僚のマシュー・アイエロ=ランメンスによって支援されました。

すべての動物の仕事は、プロトコル2018-1の下でペース大学の制度的動物ケアと使用委員会によって承認されました。
1. ゼブラフィッシュ幼虫の準備
<ol><li>実験を行う3~5日前に交配を設定し、レーザーアブレーション用に取り付けると幼虫は2日受精後(dpf)から4dpfの年齢になります。 注:Et(krt4:EGFP)sqEt20(ET20と略称)エンハンサートラップラインは、神経間肥満細胞が強化された緑色蛍光タンパク質(eGFP)で明確に標識され、比較的容易な細胞同定およびアブレーション11、14を可能にする。レーザーアブレーション特異性と柔軟性の確認のために、ET20魚はTg(neuroD:tdTomato)魚で飼育され、横線神経は赤い蛍光タンパク質で標識されるか、Tg(myo6b:βactin-GFP)でGFP15,16で感覚性の毛細胞を標識します。</li>
	<li>翌日の胚採取後、0.0001%メチレンブルーを含むE3培地で28.5°Cで、麻酔と装着の準備ができるまで胚をインキュベートする。</li>
</ol>2. 低ゲル化アガロースおよびトリケイン溶液の調製
<ol><li>250 mL ガラスのエルレンマイヤーフラスコに、48 mLの 1x E3培地、2 mL の 15 mM トリケーヌストック溶液、および 0.5 g の低融解アガロースを加えます。</li>
	<li>溶液を30sの高い上に電子レンジし、(熱保護手袋を着用して)渦巻き、アガロースを溶解する。アガロースが完全に溶解するまで30sの加熱サイクルを繰り返します。</li>
	<li>アガロースを42°Cに加熱したインキュベーターに保管し、使用できる状態になるまで保管します。</li>
</ol>3. ゼブラフィッシュ幼虫の麻酔
<ol><li>50 mLの円錐形チューブに、600 μMの最終濃度に1x E3培地24 mLと1mLのトリカインストック溶液(15 mM)を加えます。</li>
	<li>600 μM トリカインを含む E3 の 8 mL で平底の細胞培養プレートの 6 つのウェルのうちの 1 つをロードします。</li>
	<li>トランスファーピペットを使用してゼブラフィッシュの幼虫を74 μmメッシュ底の転写インサートに移動します。</li>
	<li>メッシュ底のインサートをE3+トリカイン溶液を含む6ウェルプレートのウェルに移します。幼虫は最低3分間、または完全に麻酔されるまで井戸に留まる。インサートをタップして麻酔をテストします。幼虫はタップに応じて驚いて泳ぐべきではありません。</li>
</ol>4. 麻酔ゼブラフィッシュ幼虫の蛍光スクリーニング
<ol><li>ピペット1麻酔幼虫は、スクリーニング用に12ウェル疎水性コーティングスライドに十分に上に1つ当たり。スクリーニング時の光学的歪みを低減するために、スライドの各ウェルに形成される半月板の湾曲が最小限であることを確認してください。これは幼虫を置いた後、各ウェルからE3の小さなボリュームを除去することによって行うことができます。</li>
	<li>直立した顕微鏡(水銀アーク灯、金属ハライドランプ、またはLED光源および適切なフィルターキューブを装備した)上の10xの目的の下で、横線システムの神経マストおよび神経間肥満細胞でeGFPを発現する幼虫のためのスクリーン。<ol>
<li>より強い発現を持つ幼虫を選択すると、より明るいeGFPが得られ、これはおそらくトランスジーンのホモ接合性である。 注:ET20ラインでは、eGFPは、各神経マストを取り囲むマントル細胞のリングと、これらの器官を接続するニューロマスト間細胞の狭いストリップで表現されています。より強いeGFP発現(蛍光の明るさ)は、より効果的なアブレーションに寄与する。</li>
		<li>アブレーションの特異性を調べるには、ET20と Tg(neuroD:tdTomato) のトランスジーンの両方で二重トランスジェニック幼虫を使用してください。 Tg(neuroD:tdTomato) キャリアのスクリーニングの場合は、RFPフィルターキューブセットを使用して、後方の横線神経節を表す耳の後部に真っ赤なパッチを識別します。</li>
		<li>横線神経マストの毛細胞をアブラレートするには 、Tg(myo6b:βactin-GFP) トランスジェニックラインとスクリーンを使用して、各神経マストの中央にGFP局在化します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>神経マストのステレオタイプ間隔を持つ幼虫を選択します。神経マスト間の間隔の違いは、発達中の異常な神経マスト沈着を示し、横線プリモジウム17における遊動行動または細胞増殖の欠陥を示唆する。このような欠陥は、アブレーション後のINMCの回遊または再生行動にも影響を及ぼす可能性があります。 注意:間隔の一般的な欠陥は、最初の移行プリモジウム(prim1L1)によって堆積する前神経マスト(prim1L1)と同じプリモジウム(prim1L2)によって堆積される第2の神経マストとの間の異常に大きな距離を含み、しばしば後部神経マストの混雑に関連する。</li>
</ol>5. レーザーアブレーションとイメージング用の幼虫の取り付け
<ol><li>ピペット3 - 4麻酔幼虫は、カバースリップボトム皿(14 mm番号1.5カバースリップ付き35mm皿)の中央にあるE3/tricaine溶液の小さな液滴に。余分な溶液を取り除き、幼虫が小さな液滴に残るように、それらを含むのに十分な大きさにします。</li>
	<li>双眼鏡ステレオ顕微鏡のステージに皿を移し、すべての幼虫が視野にあるようにズームとフォーカスを操作します。</li>
	<li>加熱されたインキュベーターから低融点アガロースを含むエルレンマイヤーフラスコを取り除きます。トランスファーピペットを使用して、カバースライドにアガロース溶液を移し、薄い層を作り出します。液体がちょうど皿の底の井戸を満たすまで余分なアガロースを引き出し、幼虫を吸引しないように注意してください。</li>
	<li>アガロース溶液の幼虫をヘアナイフまたはヘアループを使用して素早く配置し、互いに整列し、左にrostralを向けます。</li>
	<li>毛髪ナイフで幼虫をガラスにそっと押し付け、右側を下にしてプロフィールに横たわります。3dpfより古い幼虫は、膨張した水泳膀胱のために浮遊する傾向があるので、アガロースがゲル化し始めるまでガラスに繰り返し押し付ける必要があるかもしれません。</li>
	<li>約60sの後、アガロースは固化し始め、幼虫は向きを変えることができない。カバースリップのアガロースが完全に固化するまで、室温で約5分待ちます。アガロースが固まったら、トランスファーピペットを使用して、1xトリカインを含むE3で途中で皿を満たします。</li>
</ol>6. 将来のターゲットとアブレーション前のイメージングを見つける
<ol><li>レーザースキャン共焦点顕微鏡システムの電源を入れ、統合イメージングソフトウェアを使用して初期化します。63倍のプラン-アポクロマート油浸漬目的(数値開口1.40)または類似を選択します。浸漬油を塗布し、幼虫が左に彼らのrostralの側面を持つような円形の段階の挿入物で皿を固定します。</li>
	<li>明視野または差動干渉コントラスト照明の下で、撮像用に取り付けられた幼虫の1つを選択します。カバースリップに最も近い魚の側面の皮膚が焦点を合わせ、ペライダーム細胞の指紋状のパターンで認識できるようにフォーカスノブでフォーカスを調整します。</li>
	<li>フォーカスが入ったら、GFP チャンネルの蛍光照明に切り替えます。水平筋皮下に沿ってGFP発現により後方横線を見つける。蛍光細胞の環は神経マストマントル細胞を示し、細胞の細長鎖は神経間肥満細胞である。</li>
	<li>通常、卵黄に対する単なる後ろ方向に位置するprimIL1ニューロマストから始まり、ステージコントロールジョイスティックまたは他のステージ移動コントロールを使用して、水平ミオセプタムに沿って走査する。<ol>
<li>プリムIL3とprimIL4(L3およびL4)神経マストの間の領域に到達するまで、神経間細胞の文字列に従ってください(図1A)。 注: 他の領域もターゲットにすることもできますが、幹と尾部のこのセクションはカバー ガラスに最も近い傾向があり、したがってアブレーションに最も適しています。</li>
		<li>複数の幼虫をイメージングする場合は、最初のステージ位置を設定し、適切なチェックボックスを選択解除して複数ステージ位置オプションを無効にします。</li>
		<li>ステップ 6.4.1 ~ 6.4.2 を繰り返します。各所望の段階位置(各幼虫)のために。</li>
	</ol>
</li>
	<li>L3–L4領域のセルボディが特定されたら、取得モードに切り替えます。<ol>
<li>488 nm または 491 nm レーザーを使用して、GFP イメージング トラックをアクティブにします。</li>
		<li>「イメージングセットアップ」ドロップダウンメニューのT-PMTチェックボックスをオンにして、アクティブ化された488 nmレーザートラックに送信光(透過光増倍管またはT-PMT)チャンネルを追加します。</li>
		<li>レーザーパワーを6%、ピンホールサイズを1 Airyユニット相当に、デジタルゲインを750に設定してET20幼虫を撮影します。正確なゲインとレーザーパワーは、カバースリップにどれだけ近い、蛍光の明るさによって、任意の幼虫のために異なる場合があります。それ以外の場合は薄暗い投影やフィリポディアをキャプチャするために、セルのボディが飽和するようにゲインを調整します。</li>
		<li>パラメータをフレームサイズ1024×1024ピクセル、デジタルズーム0.7(145.2 μm x 145.2 μmの画像サイズ)に調整します。画像の品質を向上させるために、平均を 2 に設定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Z-スタックボックスをチェックして、Z位置のドロップダウンメニューを表示します。高速スキャン中, 神経間肥満細胞がちょうど焦点を合わせなくなるまで焦点を合わせます。最初のスライスを設定し、ニューロマスト細胞が再び焦点を合わせなくなるまでサンプルを通して焦点を合わせます。最後のスライスを設定します。約25μmのzスタックを含むようにしてください。イメージング間隔を1μmに設定します。</li>
	<li>実験を開始して、アブレーション前の z スタックをキャプチャします (図 1B)。ステージ位置が追加されている場合は、位置オプションを無効にして、現在の位置のみがイメージされるようにします。キャプチャ後にファイルを保存します。</li>
</ol>7. 細胞体のレーザーアブレーション
<ol><li>[すべてのツールを表示]をクリックします。このオプションは、取得インターフェイスの上部にあります。</li>
	<li>「イメージング設定」のドロップダウンメニューをクリックします。[イメージングの設定] で、[新しいトラックを追加](+"と表示される) をクリックします。</li>
	<li>[イメージング設定] で、[Dye]のドロップダウンメニューをクリックします。染料として DAPI を選択します。</li>
	<li>[チャンネル] のドロップダウン メニューをクリックし、それぞれのチェックボックスをオフにして他のすべてのトラックの選択を解除します。DAPI トラックのみが選択されていることを確認します。</li>
	<li>DAPI トラックで、405 をクリックして"レーザー設定"。レーザーパワーを75%に上げます。候補セルボディをスキャンしてアブレーションをスキャンしている間、DAPI チャネルをクリック解除してレーザーをオフにします。</li>
	<li>視野を中心とした神経間肥満細胞の体を中心に、スキャンフレームを20x-22倍に拡大します。ズームを適用する際に、セル本体を中央に保つために、フレームの位置を調整する必要がある場合があります。セル本体が視野に入り込んだら、ライブスキャンを停止します。 注: セルの本文は、視野全体を占める必要があります。このズームレベルでは、GFPは急速に漂白します。迅速に作業することで、レーザー露出時間を最小限に抑えます。関心のある領域を選択するのではなく、ズームを使用して、小さな領域でレーザーの電力分布を増加させます。</li>
	<li>405 nmレーザーシャッターボックスをチェックして、トラックをアクティブにします。レーザーパワーを75%に調整します。45 s のタイマーを設定します。連続スキャンを有効にして、タイマーを開始します。45 s ですぐにスキャンを停止します。</li>
</ol>8. 回生を研究するためのアブレーション後のイメージングとタイムラプス顕微鏡
<ol><li>"チャンネル" のドロップダウン メニューをクリックします。チャンネルで、アブレーションレーザーを無効にするには、"DAPI"トラックをクリック解除します。取得モードのドロップダウンメニューをクリックします。</li>
	<li>取得モードで、クリックして "ズーム" .</li>
	<li>スライダを使用するか、または「0.7」と入力して、ズームを0.7に縮小します。<ol>
<li>セルアブレーションを成功させるには、ゲインを900に増やし、視野を高速スキャンします。 注: GFP は、対象のセル内に表示されません。それでも蛍光が観察される場合は、ステップ7.1~7.3に戻ります。</li>
		<li>アブレーション前のイメージングで説明されているものと同じまたは類似した設定を使用して、アブレーション後の画像をキャプチャして保存します(図1C)。画像が蛍光細胞または除去する必要がある追加の細胞体の残骸を明らかにした場合は、レーザーアブレーションステップを繰り返して、神経間肥満細胞の文字列に目に見えるギャップを作り出します。</li>
		<li>T-PMTチャンネル画像を調べて、細胞の損傷をさらに確認します。損傷した細胞は粒状の外観を持ち、しばしば核が膨らんだり、不規則な形になる(図2)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>アブレーション前画像を撮像し、必要に応じて細胞をアブレーションし、個々のステージ位置ごとにアブレーション後画像をキャプチャした後、画像キャプチャのステージ位置と時間オプションの両方を活性化してタイムラプス顕微鏡を設定する。時間パラメータを 24 時間または別の目的のエンドポイントと 15 分間隔に設定します。実験を開始して画像を取得し、完了時に結果のファイルを保存します (翌日)。</li>
	<li>幼虫をさらに研究または上げる場合は、細かい鉗子を使用してアガロースから慎重に除去し、回復のためにトリカインなしでE3培地に移します。それ以上使用しない場合は、承認された動物プロトコル(氷浴中の急速かつ持続的な浸漬は一般的な方法である)に従って安楽死させ、機関の要求に応じてそれらを処分する。</li>
</ol>9. 画像解析
<ol><li>推奨イメージ処理ソフトウェア (表/材料) でアブレーション後の z スタック ファイルを開きます。各チャネルが別々の表示ウィンドウに表示されるようにチャネルを分割します。</li>
	<li>GFP チャネル ウィンドウで、ライン ツールを使用して、残りの INMC の先端の間に直線を描画します。これは、z スタックを上下にスクロールするか、線を描画する前に最大強度の投影を実行することによって支援される場合があります。</li>
	<li>X 平面と Y 平面の INMC 端点間の距離を取得するには、[計測] ツールを使用します。</li>
	<li>元の z スタックの Z スライスをスクロールして、Z 平面内の INMCs 間の距離を決定します。</li>
	<li>ピタゴラス定理(a 2 + b 2 =c2)を使用してINMC端間の全距離を計算します。斜辺は、全体の距離(またはギャップサイズ)です。</li>
	<li>結果の距離計測値をスプレッドシート アプリケーションに入力して、データ分析を行います。</li>
	<li>コンフォーカルシステムの統合イメージングソフトウェアまたは自由に利用可能な画像解析ソフトウェアを使用して、ステップ8.2-8.3で収集されたタイムラプス顕微鏡ファイルを確認します。細胞投影によって神経間肥満細胞間のギャップが埋まった時点を特定する。これは、複数のzスライスを調べて、すべての次元のギャップの閉鎖を確認することで助けることができます。</li>
	<li>ギャップの閉じるまでの時間を最も正確に測定するには、アブレーション後の画像のタイムスタンプ(Finder またはエクスプローラーで表示)をゼロタイムポイントとして使用します。タイムラプスイメージスタックの最初から時間を測定すると、追加のステージポジションを明示している間に経過した時間に応じて、閉鎖までの時間が過ぎる可能性があります。</li>
	<li>元のギャップサイズ(μm)を完全なギャップ閉鎖に必要な時間または分で割るだけで、閉鎖率を導き出します。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

プロトコルは、近紫外線レーザー(405 nm波長)を搭載した任意の共焦点顕微鏡で行うことができるレーザー細胞アブレーションのための汎用性の高い方法を記述しています。このプロトコルは、電気アブレーション(より広範囲にわたる損傷を引き起こす)やパルスUVレーザーアブレーション(追加の特殊な装置12を必要とする)などの以前に採用された方法の限界に対処する。アブレーション前およびアブレーション後の共焦点イメージングは、実験の成功に関する迅速なフィードバックを提供します。その後のタイムラプス顕微鏡は、感覚システム開発に不可欠な細胞型の再生のための簡単なアッセイを提供します。
ニューロマストやINMCでGFPを強く発現するトランスジェラフィッシュを事前にスクリーニングすることは極めて重要です。明るい蛍光とprimI由来神経マストのほぼ均等な間隔を有する幼虫は、レーザーアブレーションの理想的な候補である。これらの魚でも、最初の脱出検出で可能性のある暗いINMCが時々存在します。これらの細胞は、レーザーアブレーション後に後ろに残ることができ、INMCs間の真のギャップの形成を防ぐことができます。デジタルゲインは、405 nmレーザー(ステップ8.2)で標的にできるように、アブレーション前のイメージング中にこれらの調光セルを明らかにするように調整する必要があります。
同様に、レーザーターゲティングは、セルを完全に破壊しないことがあります。むしろ、蛍光を漂白し、実際のギャップを作り出す失敗をもたらす。これらの細胞は、一般的にタイムラプス顕微鏡の間に蛍光が増加する。T-PMTイメージングと共にアブレーション後のイメージングステップでのゲイン調整(図2)は、標的となるすべての細胞が効果的に除去されたことを確認するのに役立ちます。INMC 文字列にギャップを生じるためには、2 つまたは 3 つの個別のセルアブレーションが必要な場合がよくなります。細胞死は、血を流すか、標的細胞の粒状の外観によって検出することができる。しかし、これはレーザーターゲティング後に短い待ち時間を必要とするかもしれません(そして場合によっては、明らかなアポトーシスまたは壊死的な数字がその後まもなく観察されます)。
この手順の制限は、レーザー条件が最適化され、INMCの再生が成功する前に、複数の実験試験が必要になる可能性があることです。レーザーのレーザーパワーと総ドウェル時間は、それぞれ異なるサンプルにわずかな調整を必要とすることがあります。レーザーの過剰な適用は、それ自体を修復する横線の能力を損なう可能性が発見されています。これには、1)個々の細胞をレーザー照射に過剰に曝露し、周囲の組織にさらなる損傷を引き起こす可能性が高く、2)文字列内のあまりにも多くの細胞のアブレーションが大きなギャップにつながる。ユーザーは、破壊を確実にし、細胞を過剰に露出しないように十分に照射する細胞のバランスをとる必要があり、再生を遅くしたり防いだりする可能性があります。適切な設定により、INMCは後側線神経に目に見える損傷を与えることなく除去できることが判明しており、電気除去11とは異なり、このプロトコルで副次的損傷が最小限に抑えられることを示している。ギャップに形成された新しい神経マストが観察されなかった症例は、おそらく横線神経がそのまま残り、基礎となるグリア細胞が残り、INMCs6、7、8、11の増殖を阻害するためである。
この共焦点レーザーアブレーションの方法は、他の細胞タイプにも適用され得ることを実証した。同様のプロトコルは、前述の13のように、軸索再生研究のための創傷修復またはニューロンを調べるために皮膚細胞を棄権するために使用することができる。この技術は、共焦点顕微鏡を持ちながらレーザーアブレーションのための他の特殊な装置を持たない実験室の実験的レパートリーに有用な追加になることが期待される。

最も進行性の難聴の核心は、外因性聴覚刺激を脳によって検出可能な神経インパルスに変換する感覚性毛細胞の破壊である。人工内毛細胞死は、成人哺乳類が損傷後にこれらの細胞を再生する能力を欠いているため、永久的な難聴を引き起こす。逆に、ゼブラフィッシュのような非哺乳類の脊椎動物は、音響外傷または人毒性侮辱に失われた毛細胞を再生することができる。ゼブラフィッシュメカノ感覚横線は、毛細胞再生1、2、3を研究するために使用できるシンプルで簡単に操作できる器官系である。
横線は、神経マストと呼ばれる小さな感覚パッチで構成され、神経間肥満細胞(INMC)として知られる細長い細胞の文字列によって開発中に接続されます。新しい毛細胞を含む器官を生み出す明らかな幹細胞としての増殖能力を考えると、INMCの行動はコミュニティ4,5にとって大きな関心事である。INMCに関する研究の多くは、Wnt/βカテニンシグナル伝達の阻害剤を通じて、横線神経を包み込む近くのシュワン細胞による増殖の抑制を特徴付けている。6、7、8.新しいニューロマストへのINMC増殖と分化の調節はよく説明されているが、アブレーション後のINMC再成長を支配するメカニズムは解明されていない。このプロトコルは、個々のINMCをアブレフトし、その後の回生行動を分析する手段として機能します。
毛髪細胞、支持細胞、神経マスト全体を破壊するための様々な方法と、回復を監視するための方法論が発表されている。化学アブレーションは、毛細胞のためにうまく機能しますが、CuSO4のような有毒な化学物質の用量は、他の横線細胞タイプ9を除去するために大幅に増加する必要があります。蛍光顕微鏡下での電気切合は、再生を研究するためにINMCを破壊する効果的かつ簡単な手段であるが、狭く標的化することは困難であり、したがって、重大な担保損傷を生じさせる可能性がある。その結果、INMC固有の動作10,11の側面をマスクできる。レーザーアブレーションプロトコルが採用されているが、それらは、必ずしも平均的な実験室またはイメージング施設に存在しない特殊な機器の使用を必要とする(すなわち、高出力パルスUVレーザー12)。ここで説明する方法は、一般的な405 nmレーザーを装備したレーザースキャン共焦点顕微鏡で、通常DAPIおよび他の青色蛍光体のイメージングに使用される。この方法の利点は、付加的なレーザー制御システムを従事させたり、パルスレーザーを搭載した別の顕微鏡に移したりすることなく、細胞損傷の前後に即座に行うことができるという点です。
同様の方法がゼブラフィッシュ脊髄13におけるニューロンを切除するために説明されている。ただし、前の方法では、このプロトコルの要件ではないセルアブレーションのための FRAP モジュールが必要です。さらに、異なる細胞タイプの特性(すなわち、トランスジーン蛍光の明るさ、体内の深さ、および細胞形状)を考えると、使用される細胞の種類に応じて大きな改変が必要になる可能性がある。ここで詳述するプロトコルは、同じ方法を用いた感覚性毛細胞切血のデモンストレーションによって支持されるように、より表面的な細胞に対して有効である可能性が高い。また、アブレーション後のINMC回収率を評価するための再生アッセイも概説されているが、これは前述の研究の特徴ではなかった。
本明細書に詳述されるレーザーベースの細胞アブレーションプロトコルは、レーザー条件の最適化、アブレーション前およびポストアブレーションイメージング、およびタイムラプス顕微鏡を通じてINMCの回生能力を捕捉する。これらの要素は、INMCの再成長とギャップの閉鎖を包括的に描写するために一緒に来ます。このプロトコルはINMCを破壊するためにここで使用されますが、細胞切除の信頼性と効果的な評価を必要とする他の作業に適用される可能性があります。405 nmレーザーを搭載した任意の共焦点顕微鏡で行うことができるので、それはまた、アクセス可能な技術です。

<table><tbody><tr><td>12ウェルPTFEプリントスライド電子</td><td>顕微鏡科学</td><td>63425-05</td><td></td></tr><tr><td>15 mMトリカインストック溶液</td><td>シグマ</td><td>E10521</td><td>15 mM逆浸透水</td></tr><tr><td>1X E3 + 600 &micro;M トリカイン</td><td></td><td></td><td>1X E3 培地に 15 mM トリカインストック 25X</td></tr> 希釈 <tr><td>1X E3 培地</td><td></td><td></td><td>60X E3 培地を逆浸透水 (16.7 ml/L)</td></tr> <tr><td>60 X E3 培地</td>で 1X に希釈 <td>Sigma-Aldrich</td><td></td> から購入したすべての成分 <td>34.4 g Nacl、1.52 g Kcl、5.8 g CaCl2.2H2O、 9.8 g MgSO4.7H20 1リットル逆浸透水</td></tr><tr><td>Bx60 水銀アークランプ蛍光付き複合顕微鏡</td> 405 nm、488 nm、555 nm または 561 nm レーザーを搭載した<td>オリンパス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 700 共焦点顕微鏡</td><td>Carl Zeiss Microscopy, LLC</td><td></td><td>アブレーションには 5 mW 405 nm レーザーを使用しました。アブレーションとイメージングは、NAが1.40の63倍プランアポクロマート対物レンズを介して行われました</td></tr><tr><td>FIJI/ImageJ 画像処理ソフトウェア</td><td>複数の寄稿者</td><td></td><td>https://fiji.sc/ でダウンロード可能</td></tr> 解<tr><td>剖針をヘアナイフに変更</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>19010</td><td>まつげは、木製の柄の解剖針の端に接着されました</td></tr><tr><td>Microsoft Excelソフトウェア</td><td>Microsoft Corp.</td><td></td><td>Googleのシートは、Microsoft Excelの</td></tr><tr><td>ガラス底35ミリメートル皿、No.1.5カバースリップ、20ミリメートルの窓</td><td>Mattek株式会社</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td>35ミリメートルのシャーレ、20ミリメートルのガラス窓</td></tr><tr><td>の無料の代替品です イマーソール518F浸漬油</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-624-66A</td><td></td></tr><tr><td>低ゲル化アガロー</td>ス<td>シグマライフサイエンス</td><td>A9414-256</td><td></td></tr><tr><td>74 umポリエステルメッシュ、24 mmインサートミル</td><td>ポアシグマ</td><td>CLS3479-48EA</td><td></td></tr><tr><td>Rstudioソフトウェア</td><td>Rstudio PBC</td><td></td> https://rstudio.com/ SMX-168-BL<td>でダウンロード可能</td></tr> <tr><td>実体顕微鏡</td><td>Motic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transfer ピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>ZENソフトウェア</td><td>Carl Zeiss Microscopy, LLC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュインターニューロマスト細胞における共焦点顕微鏡ベースレーザーアブレーションと再生アッセイ

Confocal Microscope-Based Laser Ablation and Regeneration Assay in Zebrafish Interneuromast Cells

毛細胞は、聴覚を媒介するメカノ感覚細胞である。これらの細胞はヒトの損傷後に再生されませんが、ゼブラフィッシュのような非哺乳類の脊椎動物では自然に補充されます。ゼブラフィッシュ横線系は、感覚的な毛細胞再生を特徴付けるための有用なモデルである。横線は神経乳房と呼ばれる毛細胞を含む器官で構成され、一連の神経間肥満細胞(INMCs)によって結ばれている。INMCは、開発中に新しい神経マストを生み出す前駆細胞として機能します。INMCは、細胞死によって生じる横線系のギャップを修復することができます。ここでは、従来のレーザー走査型共焦点顕微鏡と、INMCsで緑色蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック魚を用いた選択的INMCアブレーションの方法について説明する。その後、タイムラプス顕微鏡を使用してINMCの再生を監視し、ギャップクロージャの速度を決定します。これは、高出力のパルス紫外線レーザーなどの特殊な装置を必要としないセルアブレーションのためのアクセス可能なプロトコルを表します。アブレーション プロトコルは、多くのユーザーが既に使用できるツール セットを使用して、追加のセル タイプのアブレーションに役立つ可能性があるため、より広範な利益に役立つ可能性があります。この技術は、異なる条件下で、異なる遺伝的背景からのINMC再生の特徴付けをさらに可能にし、感覚前駆細胞再生の理解を進める。

INMCをアブレートし、再生を記録するために、ET20トランスジェニックラインのスクリーニングされたGFP発現ゼブラフィッシュ幼虫は、ステップ5.4に記載されているようにアブレーションのために2日または3日の受精後に取り付けられた。複数の魚を同時に取り付けることができるので、複数のタイムラプスを1回の実験で捕捉することができます。primIL3とprimIL4ニューロマストの間に位置する横線の領域が同定され、アブレーション前画像がステップ6.5~6.7(図1A,B)に記載されているように撮影された。
3つの細胞体がレーザーアブレーションを対象とし、約40μmのINMCストリングにギャップを作り出しました。高ゲインおよびそれに続くイメージングによるアブレーション後のスキャンでは、細胞体がアブレート領域に残っていないことが確認され、隣接するINMCsの細長い投影間にギャップが残っている(図1C)。細胞死は、アブレーション後のT-PMTチャネルを調べることによってさらに実証された。損傷を受けた細胞と死にかけている細胞は、腫れ、不規則な形の核、ならびに粒状の外観によって特徴づけられた(図2、概説)。いくつかのケースでは、タイムラプスイメージングはまた、マクロファージである可能性が高い大きなアメーブイド細胞の動員を明らかにした(図2、アスタリスク)。アブスレートされたINMCsを取り巻く暗い領域は、上にあるペライダーの細胞のフォトブリーチングを示した。これらの細胞は、これらの実験でレーザー照射によって損傷または破壊されているようには見えませんでした。むしろ、彼らの蛍光は一時的に減少した。タイムラプス顕微鏡は、これらの細胞が通常アブレーション後に回復し、形状を変化させたり、損傷を受けたように見えないことを明らかにします(未発表の結果、Volpeら)。
INMC破壊の特異性をサポートするために、アブレーションは、横線神経(神経間肥満細胞の下にミクロンを実行する)が赤い蛍光タンパク質で標識されている二重トランスジェニックET20および Tg(neuroD:tdTomato) 幼虫で行われました。INMCストリングに大きなギャップを生み出した複数の細胞のアブレーションは、赤色蛍光に基づく横線神経にほとんどまたは全く影響を及ぼさなかった(図3)。表在細胞を切り出す技術の柔軟性は、横線の神経乳房内の個々の感覚性毛細胞を選択的に破壊することによって実証された。上記で詳述した基本的に同じプロトコル(セクション7と8)を用いて、トランスジェニック Tg(myo6b:βactin-GFP)の 単一の毛髪細胞が隣接する細胞に明らかな損傷を与えることなく破壊された(図4)。脱皮した毛髪細胞は、経時顕微鏡後に蛍光を回復せず、その核はレーザー露光後に顕著に粒状で不整形であった(図4B)。INMCアブレーションと同様に、明らかなマクロファージがレーザー暴露部位に頻繁に募集された(未発表の結果、Volpeら)。
レーザーアブレーションとアブレーション後の画像キャプチャに続いて、自由に利用できる画像解析ソフトウェアを用いてギャップサイズを測定した。測定ツールは、個々のINMCの幅とアブレーションのために選択された細胞の数に応じて、わずか数ミクロンから100ミクロンまでのギャップサイズを実証しました(図5)。タイムラプス顕微鏡は、再生中にINMCの行動を記録するために採用された。50回の試験で、15のギャップ(30%)24時間以内の再生によって閉鎖された。ほとんどの場合、回復できた INMC は、イメージングの最初の数時間内に回復しました。回復は、隣接する細胞からの突起が接触した時点で定義され、約40μmのギャップに対してアブレーション後16時間発生した(Movie 1)。Z-スタックは、Z投影によるアーティファクトの可能性を避け、セルとセルの接触が単一のZ平面内で発生することを確認するために慎重に検討しました。ロジスティック回帰分析では、ギャップクロージャの確率がギャップサイズ(p = 0.0453)と相関し、ギャップが小さくなり、治癒する可能性が高いことがわかります。55.5 μmのギャップは50%の閉鎖確率を生み出した(図5)。
70%のケースでは、INMCはアブレーションによって生じるギャップを完全に埋めることができませんでした。しかし、これらの場合でも、我々はいくつかの点でニューロンの成長コーンを拡張する類似した隣接INMCからの長い投影の形成を監視することができました (ムービー 2).したがって、これらの実験は、損傷後のINMCの挙動に関する洞察を提供することもできる。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60966/60966fig01.jpg"> 図1:レーザー照射による神経間肥満細胞の選択的切り出し(A) 神経マストprimIL3とprimIL4の間の神経間細胞がアブレーションのために選択された。これらの細胞は、隣接する細胞体を重ね合わせた細長い突起を有する特徴的な紡錘形状を示す。(B) アブレーション前画像化により、切断してギャップを生じさせる細胞体を同定した。(C)アブレーション後のイメージングは、ギャップ領域内の細胞体の不在によって示されるように、アブレーションが成功したことを確認する。スケールバー= 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60966/60966fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60966/60966fig02.jpg"> 図2:アブレーション後のイメージングは、GFP標識された神経間肥満細胞におけるレーザー暴露に応答して細胞死を示す。透過光増倍光イメージング(T-PMT)は、粒状の外観(包囲)を有する壊死細胞の存在と、マクロファージ(*)である可能性が高い不規則な形状の細胞の募集を示す。GFPとT-PMTチャネルの結合は、細胞死およびマクロファージ活性がアブレーションの部位で起こったことを確認する。スケールバー= 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60966/60966fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60966/60966fig03.jpg"> 図3:神経間マストアブレーションの特異性(A) 二重トランスジェニックTg(ET20)におけるプレアブレーションGFP標識インターニューロマスト細胞(緑色)およびtdTomato標識横線神経 (赤)神経D:tdトマト) 幼虫。横線神経に近い細胞体はアブレーションの標的となった。(B)アブレーション後の画像化は、無傷の横線神経を有する標的細胞体のアブレーションを示す。スケールバー= 10 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60966/60966fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60966/60966fig04.jpg"> 図4:共焦点顕微鏡による感覚性毛細胞の切り出し(A)アブレーション前イメージングは、二重トランスジェニックTg(ET20;myo6b:βactin-GFP)ゼブラフィッシュのアブレーションを標的とするGFP標識官能毛細胞(*)を同定した。透過光増倍管(T-PMT)画像は、円形断面を有する正常な毛細胞形態を開示する。(B)アブレーション後のイメージングは、標的となる毛細胞の切開が成功したことを確認する。T-PMT画像は、毛髪細胞の形状の不規則性とレーザー暴露後の粒度の増加を示し、光漂白ではなく細胞死を示唆している。スケールバー= 10 μm<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60966/60966fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60966/60966fig05.jpg"> 図5:ロジスティック回帰は、ギャップの閉じる確率をギャップ幅の関数(μm)としてモデル化したものです。スコア 0 は完全なギャップのクロージャを表し、スコア 1 は不完全なギャップクロージャを表します。結果は、それぞれのギャップを閉じる神経間肥満細胞の能力に対するギャップ幅の影響が統計的に有意であることを示している(p = 0.0453, n = 24合計; n = 12閉じたギャップ, n = 12 不完全に閉じたギャップ). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60966/60966fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
動画1:16時間後にギャップ閉鎖(〜40μm)を示すタイムラプス顕微鏡。 画像は15分ごとに撮影され、すべてのタイムポイントに対して最大強度のZ投影が行われました。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60966/Suppl_Movie_1.avi" target="_blank">こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。</a>
動画2:閉じなかったINMCギャップのタイムラプス顕微鏡。 残りの INMC の細長い分岐の投影を示します。 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60966/Suppl_Movie_2.avi" target="_blank">こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。</a>

レーザーアブレーションは、生物系の再生を研究するための広く応用できる技術です。提示されたプロトコルは、ゼブラフィッシュ横線で神経間細胞を再生するレーザーアブレーションとその後のタイムラプスイメージングのための標準的なレーザー走査共焦点顕微鏡の使用を記述する。

Hair cells are mechanosensory cells that mediate the sense of hearing. These cells do not regenerate after damage in humans, but they are naturally ...

このプロトコルを使用すると、405ナノメートルレーザーを搭載した標準的な共焦点顕微鏡を備えたラボは、ヘアセル前駆細胞レーザーアブレーションを実行し、その再生を監視することができます。エレクトロアブレーションとは異なり、この技術は、周囲の細胞の損傷を制限し、強力なパルスUVレーザーセットアップよりもアクセスしやすいです。共焦点イメージングは、アブレーションの直前と直後に行うこともできます。この技術は、人間の難聴の治療法の開発に役立つかもしれない感覚前駆物質の再生行動をよりよく理解することを可能にする。取り付けのために、最初のピペット3〜4ピペットは、14ミリメートル番号1.5カバースリップボトムで、35ミリメートル皿の中央にE3トリケーヌ溶液の小さな液滴に幼虫を麻酔します。余分な溶液を取り除き、幼虫がそれらを含むのに十分な大きさの小さな液滴に残るようにします。そして、双眼鏡ステレオ顕微鏡のステージに皿を置きます。すべての幼虫が視野に入るようにズームとフォーカスを操作し、トランスファーピペットを使用してカバースリップにアグロ溶液の薄い層を追加します。余分なアグロスを取り除き、液体が皿の底の井戸を満たすまで、幼虫を吸引しないように注意してください。そして、ヘアナイフを使用して、左向きのロストラル側でアグロ溶液中の幼虫を素早く向けます。幼虫をガラスに押し付け、右側を下に向けてプロファイルに幼虫が置きます。約60秒後、アグロは固まり始め、幼虫の向きを変えることができない。5分後、トランスファーピペットを使用して、1Xトリカインを補充したE3で途中で皿を満たします。将来のターゲットを見つけるには、レーザースキャン共焦点顕微鏡システムの電源をオンにし、統合イメージングソフトウェアを介してレーザーを初期化します。63X プラン-アポクロマートオイル浸漬目的を選択し、水浸油をレンズに塗布します。幼虫のロストラル面を左に向けた円形の段の挿入物で皿を固定します。明視野または差動干渉コントラスト照明を使用して、撮像用に取り付けられた幼虫の1つを選択し、フォーカスノブを使用して、カバースリップに最も近い魚の側面の皮膚を焦点にします。GFPチャネルで蛍光灯に切り替え、水平ミオセプタムに沿ってGFP発現により後方横線を見つけます。蛍光細胞の環は神経マストマントル細胞を示し、細胞の細長鎖は神経間肥満細胞である。最初の移行プリモジウム神経マストから始めて、ステージコントロールジョイスティックを使用して、水平筋膜に沿って尾を向いて視覚的にスキャンします。第3および第4の移行プリモジウム神経マストの間の領域が到達するまで、神経間肥満細胞の文字列に続く。複数の幼虫を画像化する場合は、最初のステージ位置を設定する位置を選択します。L3、L4領域の細胞体が特定された後、取得モードに切り替え、適切なレーザーを使用してGFPイメージングトラックをアクティブ化します。アクティブ化されたレーザー トラックに送信光チャンネルを追加するには、イメージング設定ドロップダウン メニューの T-PMT ボックスをクリックします。ET20幼虫を画像化するには、488ナノメートルレーザーを選択し、レーザーパワーをピンホールサイズを1つの面積単位に6%、デジタルゲインを750に設定します。それ以外の場合は薄暗い投影とフィロポディアをキャプチャするために細胞体が飽和するようにゲインを調整します。フレームサイズを 1,024 x 1,024 ピクセルに設定し、平均を 2 ピクセルに、デジタルズームを 0.7 に設定します。Z スタックボックスをオンにして、[Z 位置]ドロップダウンメニューを表示します。高速スキャン中に, インターニューロマスト細胞がちょうど焦点を合わせなくなるまで焦点を合わせ、最初のスライスを設定します。ニューロマスト細胞が再び焦点を合わせなくなるまでサンプルを通して焦点を合わせ、最後のスライスを設定します。次に、[停止]をクリックし、[実験を開始]をクリックして、アブレーション前 Z スタックをキャプチャします。ステージ位置が追加されている場合は、position オプションを無効にして、現在の位置のみがイメージ化され、キャプチャされたファイルを保存します。ターゲット セル ボディのレーザー アブレーションの場合は、[取得インターフェイスのすべてのツールを表示] をクリックし、イメージング設定メニューで [新しいトラックの追加] を選択します。[仕分け]をクリックし、[DAPI]を選択します。チャンネルの下で、レーザー設定に405を選択し、75%にレーザーパワーを上げる DAPI チャンネルをオフにし、候補細胞体をスキャンしてアブレーションをスキャンします。ライブをクリックし、視野の中央に神経間肥満細胞の体を持って、20〜22倍にスキャンフレームにズームインします。セル本体が視野に入り込み、すぐにライブスキャンを停止します。405ナノメートルのレーザーシャッターボックスをチェックしてトラックをアクティブにし、45秒間タイマーを設定します。続いて、連続スキャンを有効にして、タイマーを開始します。スキャンを45秒で直ちに停止します。アブレーション後のセル ボディのイメージングの場合、チャネル メニューで DAPI トラックをクリック解除してアブレーション レーザーを無効にし、取得モード メニューを開きます。ズームをクリックし、0.7 にズームを縮小します。細胞切り出しの成功を評価するために、ビューのフィールドを高速スキャンします。アブレーション前のイメージングと同じ設定を使用して、アブレーション後の画像をキャプチャして保存します。送信光増倍管チャンネル画像を検査し、細胞の損傷をさらに確認します。損傷した細胞は粒状の外観を示し、核はしばしば膨らんだり、形状が不規則に見えたりします。アブレーション後の細胞の体の回復を評価するには、タイムラプス画像キャプチャのステージ位置と時間オプションの両方をアクティブにし、時間パラメータを適切な実験時間ポイントと15分間隔に設定します。次に、実験を開始して画像を取得し、完了したら結果のファイルを保存します。本代表的実験では、3番目と4番目の移行プリモジウム神経マストの間に位置する側線の領域を同定し、アブレーション前画像を撮影した。アブレーション後のスキャンでは、細胞体がアブレート領域に残っていないことが確認されました。隣接する神経間肥満細胞の細長い突起との間に隙間を残す。アブレーション後の透過光増倍管チャネルの分析は、損傷および死にかけている細胞を明らかにする。腫れと不規則な形状の核と粒状の外観によってマークされています。マクロファージの可能性が高い大きなアメーバ細胞の動員も観察され得る。この実験では、二重トランスジェニック幼虫のいくつかの細胞のアブレーションは、神経間肥満細胞の糸に大きなギャップを作り出したが、横線神経にはほとんどまたは全く影響を及ぼさなかった。レーザーアブレーションの後、ギャップサイズを測定することができます。個々の神経肥満細胞の幅とアブレーションのために選択される細胞の数に応じて、わずか数ミクロンから最大100ミクロンの範囲。アブレーション後、いくつかのインターニューロマスト細胞は、イメージングの最初の数時間以内に回復する。ギャップの閉鎖の確率がギャップサイズと負の相関を持つ。しかし、回復できない神経間肥満細胞においても、隣接する神経間肥満細胞からの長い突起の形成は、ニューロンの成長を延長することに似ている可能性があります。T-PMTチャネルを徹底的に検査し、不規則な形状の核および粒度を示す損傷細胞を検査し、これらの細胞死指標が目に見えるようにするのに十分な時間を確保することが重要です。得られたタイムラプス顕微鏡データのさらなる分析は、レーザーアブレーションによって誘発される新しい細胞行動を明らかにする可能性があり、再生の調節因子を同定するための実験の開発を導くことができる。この技術により、これらの細胞を選択的に損傷する迅速かつ費用対効果の高い方法を提供することにより、神経間肥満細胞再生の分子調節因子を研究することができました。

confocal-microscope-based-laser-ablation-regeneration-assay-zebrafish

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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