Name: 近接ライゲーションアッセイを用いたC.エレガンス生殖細胞系列におけるリボヌクレオプロテイン複合体集合体のSITU検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 学ぶ近接ライゲーションアッセイを用いたC. elegans生殖細胞系列におけるタンパク質間相互作用のin situ検出法。この技術は発生調節メカニズムの解明に有用です。

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この研究で使用されるいくつかの線虫株は、NIH(P40OD010440)が資金を提供するカエノールハブディティス遺伝学センターによって提供された。共焦点顕微鏡は、NIHアワードP20GM103546およびS10OD021806の支援を受けて運営されているモンタナ大学バイオスペクトロスコピーコア研究所で行われました。この研究の一部は、NIHがE.V.にGM109053を付与し、アメリカ心臓協会フェローシップ18PRE34070028をX.W.に、モンタナ科学アカデミー賞X.W.に支援しました。資金提供者は研究デザインや報告書の執筆に関与していなかった。M・エレンベッカーの話し合いに感謝します。

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<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+proteins+and+their+interactions+in+cells+and+tissues+using+the+in+situ+proximity+ligation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay.</a> Methods. 45 (3), 227-232 (2008).</li>
<li>Wilson, M. J., Salata, M. W., Susalka, S. J., Pfister, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+chains+of+mammalian+cytoplasmic+dynein%3A+identification+and+characterization+of+a+family+of+LC8+light+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motility+and+Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Light chains of mammalian cytoplasmic dynein: identification and characterization of a family of LC8 light chains.</a> Cell Motility and Cytoskeleton. 49 (4), 229-240 (2001).</li>
<li>Erdős, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+linear+motif+filtering+protocol+reveals+the+role+of+the+LC8+dynein+light+chain+in+the+Hippo+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Novel linear motif filtering protocol reveals the role of the LC8 dynein light chain in the Hippo pathway.</a> PLoS Computational Biology. 13 (12), e1005885(2017).</li>
<li>Navarro-Lérida, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+identification+of+brain+proteins+that+interact+with+dynein+light+chain+LC8%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic identification of brain proteins that interact with dynein light chain LC8.</a> Proteomics. 4 (2), 339-346 (2004).</li>
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<li>Rapali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+reveals+the+binding+motif+preference+of+the+LC8%2FDYNLL+hub+protein+and+predicts+large+numbers+of+novel+binders+in+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Directed evolution reveals the binding motif preference of the LC8/DYNLL hub protein and predicts large numbers of novel binders in the human proteome.</a> PLoS One. 6 (4), e18818(2011).</li>
<li>Clark, S. A., Jespersen, N., Woodward, C., Barbar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivalent+IDP+assemblies%3A+Unique+properties+of+LC8-associated%2C+IDP+duplex+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Multivalent IDP assemblies: Unique properties of LC8-associated, IDP duplex scaffolds.</a> FEBS Letters. 589 (19 Pt A), 2543-2551 (2015).</li>
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<li>Dorsett, M., Schedl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+dynein+in+the+inhibition+of+germ+cell+proliferative+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">A role for dynein in the inhibition of germ cell proliferative fate.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (22), 6128-6139 (2009).</li>
<li>Ellenbecker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+Light+Chain+DLC-1+Facilitates+the+Function+of+the+Germline+Cell+Fate+Regulator+GLD-1+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Dynein Light Chain DLC-1 Facilitates the Function of the Germline Cell Fate Regulator GLD-1 in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 211 (2), 665-681 (2019).</li>
<li>Day, N. J., Ellenbecker, M., Voronina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+DLC-1+associates+with+ribonucleoprotein+complexes+to+promote+mRNA+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans DLC-1 associates with ribonucleoprotein complexes to promote mRNA regulation.</a> FEBS Letters. 592 (22), 3683-3695 (2018).</li>
<li>Detwiler, M. R., Reuben, M., Li, X., Rogers, E., Lin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+zinc+finger+proteins%2C+OMA-1+and+OMA-2%2C+are+redundantly+required+for+oocyte+maturation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Two zinc finger proteins, OMA-1 and OMA-2, are redundantly required for oocyte maturation in C. elegans.</a> Developmental Cell. 1 (2), 187-199 (2001).</li>
<li>Spike, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+of+the+oogenic+program+by+components+of+OMA+ribonucleoprotein+particles+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Translational control of the oogenic program by components of OMA ribonucleoprotein particles in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 198 (4), 1513-1533 (2014).</li>
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<li>Gervaise, A. L., Arur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+Temporal+Analysis+of+Active+ERK+in+the+C.+elegans+Germline%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), (2016).</li>
<li>Duerr, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+staining+in+C.+elegans+using+%22freeze-cracking%22%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Antibody staining in C. elegans using "freeze-cracking".</a> Journal of Visualized Experiments. (80), (2013).</li>
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</ol>

著者には利益相反はありません。

C.エレガンス生殖細胞系列でPPIを研究する際、PLAが提供する高解像度は、共免疫染色と比較して、生殖細胞系列で相互作用が起こる場所の視覚化と定量化を可能にする。DLC-1は、IN VITRO GSTプルダウンアッセイ26を使用してOMA-1と直接相互作用することが報告されました。しかし、この相互作用は in vivo プルダウンでは回復されませんでした。3xFLAG::DLC-1の蛍光共免疫染色;OMA-1::GFP生殖細胞系は、DLC-1とOMA-1の発現パターンに重複を示す。しかし、生殖細胞系列でどこで相互作用が起こるかの兆候はなく、重複自体は3xFLAG::DLC-1とGFPの間のタンパク質(陰性対照)との間のそれより大きくはない。Situ PLAを用いて、DLC-1が生殖細胞系列のOMA-1と相互作用することが判明し、PLAは他のアプローチと比較してPPIの検出に対してより敏感である可能性があることを示唆した。このアプローチを通じて、RBPの補因子としてのDLC-1の新たな役割を拡大し続けています。この研究は、生殖細胞系列中の...

タンパク質の80%以上が他の分子1との相互作用を有すると推定されており、細胞2における特定の生物学的機能の実行においてPPIがいかに重要であるかを強調している。一部のタンパク質は、細胞生存に必要なより大きな複合体の組立を促進するハブとして機能する1.これらのハブは複数の PPI を仲介し、細胞3の特定の機能を容易にするネットワークにタンパク質を整理するのに役立ちます。タンパク質複合体の形成は、特異的相互作用パートナー4の有無、細胞シグナル伝達事象、および細胞の発達段階などの生物学的文脈によっても影響される。
C.エレガンスは、開発を含む様々な研究のためのモデル生物として一般的に使用されています。この動物の単純な解剖学は、生殖腺、腸、透明キューティクルを含むいくつかの器官で構成されており、ワームの発達の分析を容易にする。生殖腺に存在する生殖細胞は、生殖細胞幹細胞が胚に成長し、最終的には次世代の子孫に成長するジテ5に成熟する方法を研究するのに最適なツールです。生殖細胞系列の遠位先端領域には、自己更新幹細胞のプールが含まれています(図1)。幹細胞がニッチを離れると、それらは大乳頭蓋に進行し、最終的には若年成人期に卵母細胞に発展する(図1)。生殖細胞系列におけるこの開発プログラムは、RNA結合タンパク質(RRP)6によって促進される転写後調節ネットワークを含む異なるメカニズムを介して厳しく調節される。6PPPは、RPPが他の補因子と関連付けて機能を発揮するので、この規制活動にとって重要です。
ワームの PPI をプローブするために使用できる方法はいくつかありますが、それぞれに固有の制限があります。インビボ免疫沈降(IP)は、ワーム抽出物全体からタンパク質-タンパク質複合体を分離するために使用することができます。ただし、このアプローチは、ワーム内で PPI が発生する場所を示すものではありません。さらに、開発の特定の段階または限られた数の細胞の中で一過性で唯一形成されるタンパク質複合体は、共免疫沈降法によって回収することが困難であり得る。最後に、IP実験では、アフィニティーマトリックス上のタンパク質のリシスおよび非特異的保持後のタンパク質複合体再分類の懸念に対処する必要があります。
PPIのインシチュ検出における代替アプローチは、共免疫染色、フェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)、および二分子蛍光相補(BiFC)である。コ免疫染色は、固定ワーム組織での目的とする2つのタンパク質の同時検出と、シグナルの共局在化の程度の測定に依存します。標準的な顕微鏡検査7よりも詳細な超解像顕微鏡の使用は、200-300nm8の回折限界障壁を越えてタンパク質の共局在化をより厳格にテストするのに役立ちます。しかし、従来の顕微鏡と超解像顕微鏡の両方を使用した共同免疫染色は、明確に定義されたローカリゼーションパターンを持つタンパク質に最適です。対照的に、拡散分散型の相互作用パートナーにとってはあまり有益ではありません。重複に基づいてシグナルの共局在化を測定しても、タンパク質が互いに複雑であるかどうかについては正確な情報を提供しません9,,10.
さらに、タンパク質複合体の共免疫沈降と共免疫染色は定量的ではなく、そのような相互作用が有意であるかどうかを判断することは困難です。FRETとBiFCは、いずれも蛍光ベースの技術です。FRETは、あるFP(ドナー)からのエネルギーが別のFP(アクセプタ)11に伝達されるスペクトル重複を有する蛍光タンパク質(FP)と関心のあるタンパク質をタグ付けすることに依存する。このエネルギーの非放射移動は、それぞれの発光波長で検出することができるアクセクサFPの蛍光をもたらす。BiFCは、インビボの蛍光タンパク質の再構成に基づいています。これは、ヘリックス1-10とヘリックス1112などの2つの相補的な断片にGFPを分割し、その後、対象となる2つのタンパク質に融合することを必要とします。これら2つのタンパク質が相互作用する場合、GFPの相補的な断片は、折り畳み式と組み立てに十分近く、GFPフルオロフォアを再構成するほど近くなります。再構成されたGFPは、蛍光として直接観察され、PPIが発生した場所を示す。
そのため、FRETとBiFCの両方が、タグ付きタンパク質の機能を破壊する可能性のある大きな蛍光タグに依存しています。さらに、FRETとBiFCは、正確なデータを得るためにタグ付きタンパク質の豊富で同等の発現を必要とします。FRETは、一方のパートナーが他方を超えている実験には適しておらず、高い背景13につながる可能性がある。BiFC実験における過剰発現は、背景の増加をもたらす非特異的アセンブリ14を誘発する可能性もあるので、避けるべきである。どちらの手法でも、タグ付きタンパク質の発現条件と画像化条件の最適化が必要であり、実験の完了に必要な時間が長くなる可能性があります。
近接ライゲーションアッセイ(PLA)は、上述の技術の限界に対処できる代替アプローチである。PLAは、目的のタンパク質(またはそのタグ)を認識する一次抗体を利用します。これらの一次抗体は、40nm(または短い)距離15内で互いにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドプローブを含む二次抗体によって結合される。得られたハイブリダイズされたDNAはPCR反応を通じて増幅され、DNAを補うプローブによって検出される。これは顕微鏡によって視覚化される病巣で起因する。この技術は、複雑な組織(すなわち、ワーム生殖腺)においてPPIを検出することができ、これは、開発および分化の様々な段階で細胞を含む組立ラインとして組織される。PLAを使用すると、PPIは固定ワーム生殖腺で直接視覚化することができ、開発の特定の段階でPPIが発生するかどうかを調査する上で有利です。PLAは、正確な測定に最適な共ローカリゼーションベースのアッセイとは対照的に、PPIの解像度を高めます。使用する場合、超解像顕微鏡は、細胞内のPLA病巣の位置についてのより細かい詳細を提供する可能性を有する。もう1つの利点は、PLA反応に起因する病巣をImageJベースの解析ワークフローで数えることができることであり、この技術を定量化する。
ダイニン軽鎖のLC8ファミリーは、最初にダイニンモーター複合体16のサブユニットとして記述され、貨物アダプタとして機能すると仮定した。,最初の発見以来、LC8はダイニンモーター複合体17、18、19、20,18,19に加えて複数のタンパク質複合体で発見された。20LC8相互作用モチーフ19を含むタンパク質配列のスキャンは、LC8,が,17、18、19、20、21、22の異なるタンパク質の広い配列との多くの相互作用17,18,1921を22有し得る可能性があることを示唆している。20その結果、LC8ファミリータンパク質は現在、より大きなタンパク質複合体19,22,22の組立を促進するのに役立つハブと考えられている。
1つのC.エレガンスLC8ファミリータンパク質は、ダイニン軽鎖-1(DLC-1)が、多くの組織にわたって広く発現しており、特異的な細胞下構造23,24,24では濃縮されていない。その結果、C.エレガンスにおけるDLC-1の生体内パートナーの生物学的に関連する同定は、いくつかの理由で困難である:1)共免疫沈降は、相互作用が起こる組織源を示さない。2)特定のパートナーの限定的な発現または一時的相互作用は、共免疫沈降による相互作用を検出する能力を妨げる可能性がある;3) DLC-1の拡散分布は、共免疫染色により、潜在的なパートナータンパク質と非特異的な重複を招く。これらの課題に基づいて、PLAは、DLC-1とのインビボ相互作用をテストするための理想的なアプローチです。
DLC-1はRNA結合タンパク質(RRP)FBF-223およびGLD-125と直接相互作用し、補間因子として機能することが以前に報告25されている。我々の研究は、ハブタンパク質として機能するDLC-1のモデルをサポートし、DLC-1がdynein19,22,22を超えた相互作用ネットワークを促進することを示唆している。GST プルダウンアッセイを使用して、OMA-1 という名前の新しい DLC-1 相互作用 RBP が26と特定されました。OMA-1は、卵母細胞の成長および大動脈成熟27および多数の翻訳リプレッサーおよび活性化剤28と共に機能する重要である。FBF-2およびGLD-1は幹細胞領域および重症パキテーン領域でそれぞれ発現しているが、OMA−1は、大母細胞27を通る大動脈パキテーンから生殖細胞で拡散的に発現される(図1)。これは、DLC-1が生殖腺の異なる領域にRMPを有する複合体を形成することを示唆している。また、インビトロで観察されたDLC-1とOMA-1の間の直接相互作用は、in vivo IPによって回収されないことも判明した。PLAは、C.エレガンス生殖細胞系列におけるこの相互作用をさらに研究するための代替アプローチとしてうまく使用されており、その結果、PLAを使用してワーム内の他の多くのPPIを探査できることを示唆している。

<table><tbody><tr><td>16% パラホルムアルデヒド溶液</td><td>電子顕微鏡サービス</td><td>15710</td><td>4% 作業溶液</td></tr><tr><td>1M KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P0662</td><td>1M ワーキングストック</td></tr><tr><td>1x M9</td><td>様々な</td><td></td><td>10x ストックとして調製 1x 1x で使用され、プロトコル</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>の wormbook.org 様々な</td><td></td> various <td>を参照してください。プロトコル</td></tr><tr><td>26.5ゲージニードルエク</td><td>セルインターナショナル</td><td>26402</td>の <td>wormbook.org 解剖に使用される針</td></tr><tr><td>BSA</td><td>ランパイア</td><td>7500802</td><td></td></tr><tr><td>遠心チューブ</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>05-529C</td><td>50ml オークリッジ遠心分離管同期に使用される</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>880</td><td></td></tr><tr><td>Coplin</td><td>ジャーPolyLab</td><td>62101</td><td></td></tr><tr><td>サンプル凍結用カバースリップ</td><td>Globe Scientific</td><td>1411-10</td><td>22x40mm、No. 1</td></tr><tr><td>スライドシール用カバースリップ</td><td>Globe Scientific</td><td>1404-15</td><td>22x22mm、No. 1.5</td></tr><tr><td>免疫蛍光ベクター用DAPI封入剤</td><td></td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>リガーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82029</td><td>Duolink 1x Ligase, Comes as the Part of the Duolink In Situ Detection Reagents Red kitDUO92008</td></tr><tr><td>増幅赤色バッファー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82011</td><td>Duolink 5x Amplification 赤色バッファーは、Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td></tr><tr><td>Ligation Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82009の 5x</td><td>Ligation バッファーの一部として提供され、Duolink In Situ Detection Reagents Red kit DUO92008</td></tr><tr><td>抗体希釈剤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82008</td><td>Duolink抗体希釈剤、DUO92004とDUO92002が付属しています、注:1x PBS / 1%BSA溶液も抗体を希釈するための代替品として使用できます。</td></tr><tr><td>ブロッキングソリューション</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82007</td><td>Duolinkブロッキングソリューション、PLA用DUO92004およびDUO92002</td></tr><tr><td>封入剤</td>が付属 <td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82040</td> DAPI MINUSプローブ<td>付きDuolink In Situ封入剤</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92004</td><td>Duolink In Situプローブ Anti-Mouse</td></tr><tr><td>MINUS PLUSプローブ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92002</td><td>Duolink In Situプローブ抗ウサギPLUS</td></tr><tr><td>洗浄バッファーA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82046</td><td>Duolink In Situ洗浄バッファーA</td></tr><tr><td>洗浄バッファーB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82048</td><td>Duolink In Situ洗浄バッファーB</td></tr><tr><td>ポリメラーゼ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82030</td><td>Duolinkポリメラーゼは、ライカ</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>のエピ蛍光顕微鏡DUO92008 Duolink In Situ検出試薬レッドキットの一部として提供されますDFC300Gカメラ、DM5500B顕微鏡</td></tr><tr><td>ヤギ反マウス Alexa 594</td><td>JacksonImmuno</td><td>115-585-146</td><td>1:500で使用</td></tr><tr><td>ヤギ反ウサギ Alexa 488</td><td>JacksonImmuno</td><td>111-545-144</td><td>1:200で使用</td></tr><tr><td>画像処理ソフトウェア</td><td>Adobe</td><td></td><td>Adobe Photoshop + Illsutrator CS3</td></tr><tr><td>ガラスピペット</td><td>コーニング</td><td>7095B-5X</td><td></td></tr><tr><td>レバミゾール</td><td>ACROS有機物</td><td>187870100</td><td>250mMの作業用ストックを準備し</td></tr><tr>ます<td>メタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A454</td><td></td></tr><tr><td>マウス 抗FLAG</td><td>シグマ</td><td>F1804</td><td>免疫蛍光とPLAのために1:1000で使用し、正常なヤギの血清で事前にブロックすることをお勧めします</td></tr><tr><td>マニキュア</td><td>L.A.カラー</td><td>CNP195</td><td></td></tr><tr><td>線虫成長培地 (NGM)</td><td>さまざまな</td><td></td><td>wormbook.org を参照してくださいプロトコル</td></tr><tr><td>正常なヤギ</td><td>の血清 JacksonImmuno</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレン パスツールピペット</td><td>地球</td><td>科学 135030</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-リジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1524</td><td>水で0.1%のストック溶液として調製され、-20°Cで保存され、水で1:100に希釈されてスライドをコーティングします</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>Tritech</td><td>PD7060</td><td>直径60</td></tr><tr><td>mmのウサギ抗GFP</td><td>サーモフィッシャー</td><td>G10362</td><td>免疫蛍光法は1:200、PLAスライドは1:4000で使用</td></tr><tr><td></td><td>サーモフィッシャー</td><td>30-2066A-ブラウン</td><td>バー付き3角14x14mmオートクレーブ可能なスライドは、フィッシャーサイエンティフィックを通じてカスタムオーダーされています。ポリ-L-リジンは、ラボのスライドに追加</td></tr>次<tr><td>亜塩素酸ナトリウム溶液</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>SS290-1</td><td></td></tr><tr><td>タスクワイプ</td><td></td><td>Kimtech34120</td><td>4.4x8.4インチタスクワイプトレイ</td></tr><tr><td>(242x241x20mm)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>240845</td><td>湿度の高いチャンバートリ</td></tr><tr><td>トンX-100</td><td>ACROS有機物</td><td>327372500</td><td></td></tr><tr><td>超純水</td><td>Milli-Q</td>を作るために使用されます<td></td><td>Milli-Q Integral Water Purification System</td></tr><tr><td>Watchglass</td><td>Carolina Biological</td><td>742300-20</td><td></td></tr> <tr><td>&degから得られた超純水。C冷凍庫</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-80°;C冷凍庫</td>アルミホイ<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>ル<tr><td>OP50株大腸菌</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>テープ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>この研究で使用した線虫株(どちらもリクエストに応じて利用可能)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mntSi13[pME4.1] II;UNC-119(ED3)III;teIs1 [pRL475]</td><td></td><td>UMT 376</td><td>dlc-1 prom::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; oma-1 prom::oma-1::GFP;参考文献 24</td></tr><tr><td>mntSi13[pME4.1] II; mntSi21[pXW6.22] unc-119(ed3) III</td><td></td><td>UMT 422</td><td>dlc-1 prom::3xFLAG::d lc-1::d lc-1 3'UTR; gld-1 prom::ceGFP::fbf-1 3'UTR + unc-119(+);参考:本研究</td></tr></tbody></table>

近接ライゲーションアッセイを用いたc.エレガンス生殖細胞系列におけるリボヌクレオプロテイン複合体集合体のsitu検出

In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline using Proximity Ligation Assay

タンパク質相互作用(PPI)がいつどこで起こっているのかを理解することは、細胞内のタンパク質機能を理解し、開発などのより広範なプロセスがどのように影響を受けるかを理解するために重要です。カエノハブディティス・エレガンス生殖細胞系列は、幹細胞の調節、髄膜炎、および発達に関連するPPIを研究するための素晴らしいモデルシステムです。標準的な抗体による認識のために目的のタンパク質をタグ付けすることを可能にする様々な開発された技術があり、このシステムは近接ライゲーションアッセイ(PLA)反応に有利です。その結果、PLAは、PPIが代替アプローチよりも効果的に生殖系列で空間的および時間的に起こる場所を示すことができる。ここで説明するC. エレガンス生殖細胞系列の PPI をプローブするこの技術の適用および定量化のためのプロトコルです。

両方の 3xFLAG::DLC-1 の共同免疫染色;GFP と 3xFLAG::DLC-1;OMA-1::FLAG抗体とGFP抗体を用いたGFP生殖細胞は、生殖細胞系列における発現パターンを明らかにした(図3Aii-iii,3Bii-iii)。GFPは生殖細胞系列全体に発現した(図3Aiii),OMA-1::GFP発現は後期パキテネ及び卵母細胞に限定された(図3AiiiBiii)27。27FLAG免疫染色は、3xFLAG::DLC-1が両方の株で生殖細胞系列全体に発現したことを示す(図3Aii,3Bii)。共免疫染色によって、3xFLAG::DLC-1とO...

このプロトコルは、C.エレガンス生殖細胞リンにおけるその場でのタンパク質相互作用をプローブするための近接ライゲーションアッセイの使用を実証する。

近接ライゲーションアッセイを用いたC.エレガンス生殖細胞系列におけるリボヌクレオプロテイン複合体集合体のSITU検出

Understanding when and where protein-protein interactions (PPIs) occur is critical to understanding protein function in the cell and how broader processes ...

近接ライゲーションアッセイを使用すると、その場でタンパク質とタンパク質の相互作用を検出し、相互作用の空間的および時間的パターンを明らかにすることができます。この技術は、C.elegans開発の調節に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術は、FRETやBiFCなどの他の技術の複雑さなしにタンパク質相互作用を検出するための同等の感度を提供します。生殖腺を解放するためにワームを解剖したことがない人は、このステップに苦労するかもしれません。ワームを解剖する練習をし、PLAに移る前に取り扱いと解剖の技術を完成させるために免疫蛍光のためにそれらを使用してください。まず、1x M9とレバミソールの500マイクロリットルを含む時計ガラス皿に30〜40の若い成虫を選びます。ワームを収集した後、慎重に除去し、ワームと一緒に転送される細菌を除去するためにメディアのほとんどを破棄します。1x M9とレバミソールの新鮮な500マイクロリットルを追加し、ピペットを使用して穏やかに描画し、ワームをすすいするためにメディアを分配します。ほとんどのメディアを慎重に取り外して破棄します。洗浄を2~3回繰り返します。打ち上がった後、約100マイクロリットルの培地に8分以上放置します。ガラスまたはポリエチレンピペットを使用して、001%ポリL-リジンでコーティングされた25ミリメートルx75ミリメートルの顕微鏡スライドにワームを移します。余分なメディアを取り外して、約15マイクロリットルのメディアがスライドに残るようにします。余分なバッファの除去は、解剖されたワームと生殖腺がスライドに付着することを保証するために重要です。解剖顕微鏡の下で、2つの26 1/2ゲージ針で、片方の針をもう一方の針の上に置き、端がはさみを形成するようにします。この方法で向いている針を使用して、生殖細胞を解放するために咽頭の後ろのワームをカットします。5分以内にすべてのワームを解剖します。すべてのワームを解剖した後、スライドの上に22ミリメートルx40ミリメートルのカバースリップをそっと置き、スライドに垂直になるようにします。カバースリップの端部がスライドから垂れ下がるはずです。ドライアイスに保持されている冷やされたアルミニウムブロックのスライドを少なくとも20分間凍結します。カバースリップの上に冷やした鉛筆をそっと置き、氷の膨張によってカバースリップが緩むのを防ぎます。固定の準備ができたら、鉛筆でカバースリップをフリックし、すぐに新鮮な氷冷メタノールを含む瓶にスライドを1分間浸します。その後、サンプルを取り巻くスライドの端を静かに拭き取り、室温で150マイクロリットルのホルムアルデヒド固定剤を塗布して5分間固定します。固定剤がスライドから飛び出してペーパータオルに吸収できるように、スライドをペーパータオルに90度垂直に触れます。50ミリリットルのPBT /BSAを持つコプリン瓶の室温で15分間スライドを2回ブロックします。その後、10%正常なヤギの血清を含むPBT / BSA溶液でスライドをブロックします。スライドを囲むエッジを静かに拭き取り、各スライドに100マイクロリットルの溶液を塗布します。そして、穏やかに溶液を広げるのに役立つスライドを攪拌します。湿気の多いチャンバーで室温で1時間インキュベートします。ペーパータオルの上にスライドを置き、溶液をスライドから取り除き、端を軽く拭きます。スライドをブロックするには、ブロッキング試薬の1滴を14ミリx14ミリメートルのスペースに塗布します。湿度の高いチャンバーで37°Cで1時間スライドをインキュベートします。スライドをペーパータオルの上に置き、ブロッキング試薬をスライドから外し、端を静かに拭きます。抗体希釈剤を使用して、一次抗体を希釈します。スライド上の14~14ミリメートルの空間ごとに希釈された一次抗体溶液の40マイクロリットルを塗布します。スライドを湿気の多いチャンバーに置き、摂氏4度で一晩インキュベートします。午前中は、スライドを5分間2回洗い、それぞれにコプリン瓶の室温で50ミリリットルの1x洗浄バッファーAを入れます。軌道シェーカーのコプリンジャーを60 rpmに設定します。ペーパータオルの上にスライドを置き、洗浄バッファーをスライドから外し、端を静かに拭きます。プラスとマイナスのプローブを含む40マイクロリットルの溶液を準備します。14ミリメートルのスペースごとに溶液を追加します。湿度の高いチャンバーにスライドを摂氏37度で1時間インキュベートします。コップリン瓶の室温で50ミリリットルの1x洗浄バッファーAでスライドを5分間2回洗います。軌道シェーカーのコプリンジャーを60 rpmに設定します。ライゲーションバッファーを超純水で 1 ~ 5 個希釈します。このバッファーを使用してリガーゼを1〜40まで希釈し、ライゲーション溶液の作業ストックを調製する。スライドをペーパータオルの上に置いて、洗面バッファーを側面から流し、端を静かに拭きます。各14〜14ミリメートルの空間に40マイクロリットルのライゲーション溶液を加えます。湿度の高いチャンバーに30分間、37°Cでスライドをインキュベートします。先に説明したようにスライドを洗浄して乾燥させた後、光から保護された40マイクロリットルの新しく調製された増幅溶液を各14〜14ミリメートルの空間に加える。湿気の多い暗い部屋の中のスライドを摂氏37度で1時間40分インキュベートします。スライドを1x洗浄バッファーB50ミリリットルでそれぞれ10分間2回洗い、スライドを50ミリリットルの01xウォッシュバッファBで1分間1分間洗います。カバースリップとスライドを密封するためにマニキュアでカバースリップの端の周りにペイントします。カバースリップを動かさないようにしてください。マニキュアを室温で少なくとも20分間硬化させ、光から保護します。FLAGおよびGFP抗体による生殖細胞系列の共免疫染色は、生殖細胞系列におけるそれらの発現パターンを明らかにした。GFPは生殖細胞系列全体に発現したが、OMA-1:GFP発現は後期パキテーンおよび卵母細胞に限定された。FLAG免疫染色は、3xFLAG:DLC-1が両方の株で生殖細胞系列全体に発現したことを示す。生殖細胞系におけるPLA定量化の対象領域は、全生殖細胞中の卵母細胞を通る後期パキテーンを包含した。これは OMA-1 式の領域です。3xFLAG:DLC-1、OMA-1:GFP生殖細胞は、3xFLAG:DLC-1、GFP生殖細胞系と比較して、この領域内でより多くの量のPLA病巣を有するように見えた。チャンバーの湿度を上げるのに十分な水があることを確認してください。また、試薬の流出を防ぐために、スライドがチャンバー内のレベルであることを確認してください。近接ライゲーションアッセイの後、押し出された生殖腺を共焦点顕微鏡で画像化し、フィジー、ImageJワークフローを使用して定量することができます。この定量化は、相互作用が統計的に有意であるかどうかを判断するのに役立ちます。PLAは、線虫芽細胞系列の発達の重要な調節因子間のその場での相互作用を評価することを可能にしました。

in-situ-detection-ribonucleoprotein-complex-assembly-c-elegans

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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In Situタンパク質間相互作用を研究するための近接ライゲーションアッセイ

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蛍光を用いて観察し、テロメアの定量化と反復配列<em&gt;その場で</emPNAプローブのある&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em

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で活躍ERKの時空間解析<em&gt; C。エレガンス</em&gt;生殖細胞系列

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近接ライゲーションアッセイを用いたC.エレガンス生殖細胞系列におけるリボヌクレオプロテイン複合体集合体のSITU検出

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