近接ライゲーションアッセイを用いたC.エレガンス生殖細胞系列におけるリボヌクレオプロテイン複合体集合体のSITU検出
2020年5月5日
このプロトコルは、C.エレガンス生殖細胞リンにおけるその場でのタンパク質相互作用をプローブするための近接ライゲーションアッセイの使用を実証する。
近接ライゲーションアッセイを使用すると、その場でタンパク質とタンパク質の相互作用を検出し、相互作用の空間的および時間的パターンを明らかにすることができます。この技術は、C.elegans開発の調節に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術は、FRETやBiFCなどの他の技術の複雑さなしにタンパク質相互作用を検出するための同等の感度を提供します。
生殖腺を解放するためにワームを解剖したことがない人は、このステップに苦労するかもしれません。ワームを解剖する練習をし、PLAに移る前に取り扱いと解剖の技術を完成させるために免疫蛍光のためにそれらを使用してください。まず、1x M9とレバミソールの500マイクロリットルを含む時計ガラス皿に30〜40の若い成虫を選びます。
ワームを収集した後、慎重に除去し、ワームと一緒に転送される細菌を除去するためにメディアのほとんどを破棄します。1x M9とレバミソールの新鮮な500マイクロリットルを追加し、ピペットを使用して穏やかに描画し、ワームをすすいするためにメディアを分配します。ほとんどのメディアを慎重に取り外して破棄します。
洗浄を2~3回繰り返します。打ち上がった後、約100マイクロリットルの培地に8分以上放置します。ガラスまたはポリエチレンピペットを使用して、001%ポリL-リジンでコーティングされた25ミリメートルx75ミリメートルの顕微鏡スライドにワームを移します。
余分なメディアを取り外して、約15マイクロリットルのメディアがスライドに残るようにします。余分なバッファの除去は、解剖されたワームと生殖腺がスライドに付着することを保証するために重要です。解剖顕微鏡の下で、2つの26 1/2ゲージ針で、片方の針をもう一方の針の上に置き、端がはさみを形成するようにします。
この方法で向いている針を使用して、生殖細胞を解放するために咽頭の後ろのワームをカットします。5分以内にすべてのワームを解剖します。すべてのワームを解剖した後、スライドの上に22ミリメートルx40ミリメートルのカバースリップをそっと置き、スライドに垂直になるようにします。
カバースリップの端部がスライドから垂れ下がるはずです。ドライアイスに保持されている冷やされたアルミニウムブロックのスライドを少なくとも20分間凍結します。カバースリップの上に冷やした鉛筆をそっと置き、氷の膨張によってカバースリップが緩むのを防ぎます。
固定の準備ができたら、鉛筆でカバースリップをフリックし、すぐに新鮮な氷冷メタノールを含む瓶にスライドを1分間浸します。その後、サンプルを取り巻くスライドの端を静かに拭き取り、室温で150マイクロリットルのホルムアルデヒド固定剤を塗布して5分間固定します。固定剤がスライドから飛び出してペーパータオルに吸収できるように、スライドをペーパータオルに90度垂直に触れます。
50ミリリットルのPBT /BSAを持つコプリン瓶の室温で15分間スライドを2回ブロックします。その後、10%正常なヤギの血清を含むPBT / BSA溶液でスライドをブロックします。スライドを囲むエッジを静かに拭き取り、各スライドに100マイクロリットルの溶液を塗布します。
そして、穏やかに溶液を広げるのに役立つスライドを攪拌します。湿気の多いチャンバーで室温で1時間インキュベートします。ペーパータオルの上にスライドを置き、溶液をスライドから取り除き、端を軽く拭きます。
スライドをブロックするには、ブロッキング試薬の1滴を14ミリx14ミリメートルのスペースに塗布します。湿度の高いチャンバーで37°Cで1時間スライドをインキュベートします。スライドをペーパータオルの上に置き、ブロッキング試薬をスライドから外し、端を静かに拭きます。
抗体希釈剤を使用して、一次抗体を希釈します。スライド上の14~14ミリメートルの空間ごとに希釈された一次抗体溶液の40マイクロリットルを塗布します。スライドを湿気の多いチャンバーに置き、摂氏4度で一晩インキュベートします。
午前中は、スライドを5分間2回洗い、それぞれにコプリン瓶の室温で50ミリリットルの1x洗浄バッファーAを入れます。軌道シェーカーのコプリンジャーを60 rpmに設定します。ペーパータオルの上にスライドを置き、洗浄バッファーをスライドから外し、端を静かに拭きます。
プラスとマイナスのプローブを含む40マイクロリットルの溶液を準備します。14ミリメートルのスペースごとに溶液を追加します。湿度の高いチャンバーにスライドを摂氏37度で1時間インキュベートします。
コップリン瓶の室温で50ミリリットルの1x洗浄バッファーAでスライドを5分間2回洗います。軌道シェーカーのコプリンジャーを60 rpmに設定します。ライゲーションバッファーを超純水で 1 ~ 5 個希釈します。
このバッファーを使用してリガーゼを1〜40まで希釈し、ライゲーション溶液の作業ストックを調製する。スライドをペーパータオルの上に置いて、洗面バッファーを側面から流し、端を静かに拭きます。各14〜14ミリメートルの空間に40マイクロリットルのライゲーション溶液を加えます。
湿度の高いチャンバーに30分間、37°Cでスライドをインキュベートします。先に説明したようにスライドを洗浄して乾燥させた後、光から保護された40マイクロリットルの新しく調製された増幅溶液を各14〜14ミリメートルの空間に加える。湿気の多い暗い部屋の中のスライドを摂氏37度で1時間40分インキュベートします。
スライドを1x洗浄バッファーB50ミリリットルでそれぞれ10分間2回洗い、スライドを50ミリリットルの01xウォッシュバッファBで1分間1分間洗います。カバースリップとスライドを密封するためにマニキュアでカバースリップの端の周りにペイントします。カバースリップを動かさないようにしてください。
マニキュアを室温で少なくとも20分間硬化させ、光から保護します。FLAGおよびGFP抗体による生殖細胞系列の共免疫染色は、生殖細胞系列におけるそれらの発現パターンを明らかにした。GFPは生殖細胞系列全体に発現したが、OMA-1:GFP発現は後期パキテーンおよび卵母細胞に限定された。
FLAG免疫染色は、3xFLAG:DLC-1が両方の株で生殖細胞系列全体に発現したことを示す。生殖細胞系におけるPLA定量化の対象領域は、全生殖細胞中の卵母細胞を通る後期パキテーンを包含した。これは OMA-1 式の領域です。
3xFLAG:DLC-1、OMA-1:GFP生殖細胞は、3xFLAG:DLC-1、GFP生殖細胞系と比較して、この領域内でより多くの量のPLA病巣を有するように見えた。チャンバーの湿度を上げるのに十分な水があることを確認してください。また、試薬の流出を防ぐために、スライドがチャンバー内のレベルであることを確認してください。
近接ライゲーションアッセイの後、押し出された生殖腺を共焦点顕微鏡で画像化し、フィジー、ImageJワークフローを使用して定量することができます。この定量化は、相互作用が統計的に有意であるかどうかを判断するのに役立ちます。PLAは、線虫芽細胞系列の発達の重要な調節因子間のその場での相互作用を評価することを可能にしました。
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概要
このプロトコルは、線虫の生殖系におけるタンパク質-タンパク質相互作用の検出に近接リガーゼアッセイを使用することを示しています。この技術により、これらの相互作用の空間的および時間的パターンを検出でき、線虫の発達の調節に関する洞察を提供します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 発生生物学
背景
- 近接リガーゼアッセイ（PLA）はタンパク質-タンパク質相互作用を検出する方法です。
- FRETやBiFCなどの他の技術と同等の感度を提供します。
- タンパク質相互作用の理解は発達プロセスを研究する上で重要です。
- このアッセイのために線虫を扱うには解剖技術が必要です。
研究目的
- 線虫の生殖系におけるタンパク質-タンパク質相互作用を調査すること。
- これらの相互作用の空間的および時間的ダイナミクスを明らかにすること。
- より複雑な相互作用検出方法のより簡単な代替案を提供すること。
使用した方法
- 相互作用を検出するための近接リガーゼアッセイ。
- 生殖腺にアクセスするための線虫の解剖。
- 可視化のための免疫蛍光技術。
- 最適な結果を得るための若い成虫の線虫の使用。
主要な結果
- in situでのタンパク質-タンパク質相互作用の成功した検出。
- 線虫の発達の調節に関する重要な洞察の明らか化。
- 他の方法と比較してPLAの有効性の実証。
- ワームの解剖に新しい研究者のための実践的なガイドの提供。
結論
- PLAは線虫におけるタンパク質相互作用を研究するための価値あるツールです。
- 感度を犠牲にすることなく、相互作用を検出するプロセスを簡素化します。
- この方法を成功裏に適用するには、解剖技術の習得が不可欠です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Proximity ligation assay (PLA) enables in situ detection of protein-protein interactions with spatial and temporal resolution, supporting target validation in disease-relevant systems. This approach provides mechanistic de-risking by clarifying interaction dynamics in germline development models, informing predictive confidence in early discovery. The method offers a scalable, reproducible alternative to complex techniques like FRET or BiFC for assay development pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by mapping protein interaction networks in stem cell and meiosis regulation.
- Operational Value: Supports functional target validation through direct visualization of interaction sites in intact tissue.
- Predictive Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing quantitative, spatially resolved interaction data for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative readouts suitable for high-content screening of modulators targeting protein interfaces.
- Operational Value: Establishes reproducible workflows for interaction detection across model systems with minimal specialized equipment.
- Scalability: Facilitates platform reuse in downstream validation campaigns due to compatibility with standard immunofluorescence infrastructure.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase interaction mapping to preclinical models through conserved germline regulatory pathways.
- Biomarker Alignment: Enables correlation of interaction patterns with phenotypic outcomes in disease-relevant contexts.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by validating target engagement in physiologically relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
PLA fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing interaction data that bridges phenotypic screening and mechanistic follow-up.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by revealing when and where key regulatory complexes assemble.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs for evaluating compound effects on protein interaction networks.
- Analytics: Enables statistical comparison of interaction frequencies across conditions using standardized image quantification workflows.
- Translational Research: Advances preclinical continuity by linking interaction dynamics to developmental phenotypes in validated models.
- Enterprise Reuse: Functions as a modular capability for interaction validation across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target mechanisms through direct, in situ interaction evidence.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across labs via well-defined fixation, probing, and amplification steps.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing reliance on complex, low-throughput interaction assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated interaction profiles in disease-relevant tissues.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue preparation and immunofluorescence techniques for optimal signal-to-noise.
- Depends on access to confocal microscopy and image analysis tools (e.g., Fiji/ImageJ) for quantification.
- Necessitates antibody validation and optimization for specific protein targets in the model system.
- Involves standardization of blocking, probing, and incubation conditions to minimize background.
- Limited by tissue accessibility and fixation compatibility in certain sample types.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:49
Dissection/Gonad Extrusion
2:46
Fixation/Blocking
4:14
Primary Antibody Incubation and PLA Probe (Secondary Antibody) Incubation
5:21
Ligation
6:09
Amplification and Final Washes
6:45
Coverslip Mounting
7:15
Results: Germlines Following Co-immunostaining or PLA
8:10
Conclusion
