Name: ルシファーゼベース成長アッセイを用いた細胞内トキソプラズマゴンディ成長に対する化学阻害剤の効率の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: 学ぶルシファーゼベース成長アッセイを用いたToxoplasma gondiiの細胞内増殖に対する化学阻害剤の効率評価法。CRISPR-Cas9遺伝子欠失と組み合わせて薬剤標的を探索し、ハイスループットスクリーニングに応用可能です。

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著者らは、pSAG1-Cas9-SgRNA-TgUPRTプラスミドおよび抗TgCPLおよびTgActin抗体を共有してくれたシブリー博士とカルーサーズ博士に感謝したいと考えています。この研究は、クレムソンスタートアップファンド(Z.D.へ)、ナイツテンプラー眼科財団小児眼科キャリアスターター研究助成金(Z.D.)、NIH COBRE助成金P20GM109094(Z.D.)、NIH R01AI143707(Z.D.へ)によって支援されました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、原稿の作成に何の役割も持っていませんでした。

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<li>Parussini, F., Coppens, I., Shah, P. P., Diamond, S. L., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+L+occupies+a+vacuolar+compartment+and+is+a+protein+maturase+within+the+endo%2Fexocytic+system+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Cathepsin L occupies a vacuolar compartment and is a protein maturase within the endo/exocytic system of Toxoplasma gondii.</a> Molecular Microbiology. 76 (6), 1340-1357 (2010).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

++このプロトコルは、細胞内トキソプラズマの成長を評価し、寄生虫の成長に対する化学化合物の阻害効果を評価するルシファーゼベースのプロトコルを記述します。細胞内トキソプラズマの成長を測定するために利用可能な既存の戦略と比較して、この方法は高感度および特異性を示す。寄生虫の成長を監視している間、明確な96ウェルマイクロプレートの模擬アッセイは、試験された株が評価期間の終了前に宿主細胞を早期にライゼしないことを確認することを推奨する。それ以外の場合、トキソプラズマは宿主細胞内でのみ複製されるため、発光測定値は寄生虫の増殖を正確に反映しません。
フェノールレッド染料はルシファーゼ活性を素早くクエンチすることが確認されており、プレートリーダーによる個々の井戸測定の遅れにより、技術的複製の間でルシファーゼの読み取り値に有意な差が生じる可能性があります。従って、96ウェルマイクロプレートに播種する前にフェノールレッドフリー培地でHPFを調製するのが最適である。また、高いルシファーゼ活性の場合、交差性干渉は、強いルシファーゼ活性を示す近隣のウェ...

トキソプラズマ・ゴンディは、ヒト集団の約3分の1に感染する、非常に成功した細胞内寄生虫です。その高い伝染率は、主に、調理されていない肉の消費、哺乳類の貯水池への暴露、出生時の先天性伝染を含む多様な伝染経路によるものである。T. gondiiは主に、免疫不全個体,,11、2、3、4、5、62,3において重度の罹患率および死亡率を引き起こす可能性のある日和見感染5を6引き起こす。4急性トキソプラズマ症の治療に現在使用されている抗生物質は、特に先天性および潜在感染の治療において非効率的であり、一部の個体33、7、87,8において重篤な反応を引き起こす。したがって、新しい治療法を同定する緊急の必要性が存在する。トキソプラズマとその宿主における細胞内プロセスの違いを理解することは、潜在的な薬物標的を特定するのに役立ちます。したがって、トキソプラズマ内の個々の遺伝子の役割を研究するために、効率的で便利なゲノム操作技術が必要である。さらに、トキソプラズマは、プラスモジウム属やクリプトスポリジウム属などの他のいくつかの重要なヒト病原体を含むフィラム・アピコンプレックスに属しています。したがって、トキソプラズマは、他のアピコンプレックス寄生虫の基礎生物学を研究するのに役立つモデル生物として使用することができます。
微生物病原体に対する新規の抗生物質を同定するために、化学化合物のライブラリーのハイスループットスクリーニングは、微生物増殖の抑制におけるその有効性を決定するために最初に行われる。これまでに、Tの細胞内成長を測定するために、マイクロプレートベースの成長アッセイがいくつか開発されてきました。 gondii(すなわち、放射性3H-ウラシル系組み込み定量9、T.ゴンディ特異的抗体10、11を用いた定量ELISAベースの寄生虫検出、β-ガラクトシダーゼまたはYFP発現トキソプラズマ株12、13、および最近開発された高画像化性の高画像化性株12、13、および最近開発された高画像化性の高画像化物を用いたT.ゴンディ特異的抗体12,10、11、レポータータンパク質ベースの測定を行う。13
これらの個々の戦略はすべてユニークな利点を持っています。ただし、一部の制限によってアプリケーションが制限されます。例えば、トキソプラズマは有核動物細胞内でのみ複製できるため、宿主細胞に対する抗T.ゴンディ抗体の自己蛍光および非特異的結合は、蛍光ベースの測定において干渉を引き起こす。また、放射性同位体の使用には、特別な安全コンプライアンスと潜在的な安全上の問題が必要です。これらのアッセイの中には、成長の継続的なモニタリングではなく、単一の時点で成長を評価するのに適したものもある。
ここで提示される細胞内トキソプラズマの増殖の定量化のためのルシメラーゼベースのプロトコルです。以前の研究では、NanoLucルシファーゼ遺伝子をトキソプラズマチューブリンプロモーターの下でクローニングし、このルシファーゼ発現構築物を野生型(RHΔhxg株)hxg寄生虫にトランスフェクトku80してRHΔhxgをku80作成しました::NLuc株(RHΔku80::NLuc以降)15。hxgNLucこの株は、この研究で細胞内増殖決定および遺伝子欠失のための親株として役立った。RHΔku80を用いて::NLuc株は、ヒト包皮線維芽細胞(HPF)の寄生虫増殖を96時間にわたってモニタリングし、寄生虫の倍増時間を算出した。
さらに、寄生虫増殖に対するLHVSの阻害効果は、IC50値を同定するために、シリアルLHVS濃度に対するトキソプラズマ増殖率をプロットすることによって決定することができる。以前の文献は、TgCPLが寄生虫におけるLHVSの主要な標的であり、LHVSによる治療が急性および慢性トキソプラズマ感染の発症を減少させることが報告されている16、17、18、19。16,17,18,19さらに、RHΔku80 ::NLucは、TgCPL欠損株(RHΔcpl::NLuc)を生成するゲノム改変のための親株cplとして使用され、NLucこの変異体に対するLHVSの阻害を測定した。ku80ku80WT株と比較してTgCPL-欠損性寄生虫におけるLHVSのIC50値のアップシフトを観察することにより、TgCPLがインビボのLHVSによって標的とされることを検証した。
このプロトコルにおいて、RHΔku80::NLucは、効率的な非相同的な末端結合経路(NHEJ)を欠く親株として使用され、それによって二重交差相同性依存組換え(HDR)20,21を促進する。20,21さらに、50 bpの相同領域は、PCRにより薬剤耐性カセットの両端に横たわっています。PCR製品は、CRISPR-Cas9ベースのゲノム編集ツールを使用してHDRを介して遺伝子遺伝子軌跡全体を除去するための修復テンプレートとして機能します。このような短い相同領域は、簡単にプライマーに組み込むことができるので、修復テンプレートの製造に便利な戦略を提供します。このプロトコルは、普遍的な遺伝子欠失および内因性遺伝子タグ付けを行うために変更することができる。
例えば、最新の出版物では、TgCPL、TgCPB(トキソプラズマカテプシンBTgCPB様プロテアーゼ)、TgSUB1(トキソプラズマサブチライシン様プロテアーゼ1)の3つのプロテアーゼ遺伝子が、TgCRT(トキソプラズマクロロキン耐性輸送体)で遺伝的に可軟化した。 TgSUB1また、TgAMN(推定アミノペプチダーゼN[TgAMN,TGGT1_221310])を内因的に15にタグ付けした。Louridoラボはまた、トキソプラズマゲノムにおける部位指向遺伝子変異および内因性遺伝子タグの導入に40〜43bpの範囲で短い相同領域を用いて、同様の方法22を用いて報告した。これらの成功したゲノム改変は、40-50bp相同領域がTgKU80欠損株における効率的なDNA組換えに十分であり、トキソプラズマ・ゴンディにおけるゲノム操作を大幅に簡素化することを示唆している。

<table><tbody><tr><td>アガロースゲル抽出キット</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>T1020L</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>R0316S</td><td></td></tr><tr><td>バイオテック シナジー H1 ハイブリッドマルチモードマイクロプレートリーダー</td><td>バイオテックインストゥメント</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BTX ジェミニツイン波形エレクトロポレーションシステム</td><td>ハーバード大学装置</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ケミカルコンピテント E. coli細胞</td><td>New England BioLabs</td><td>C29871</td><td></td></tr><tr><td>CloneAmp HiFi PCR premix</td><td>Takara Bio</td><td>639298</td><td></td></tr><tr><td>Coelenterazine h</td><td>Prolume</td><td>301-10 hCTZ</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV</td><td>New England BioLabs</td><td>R3195S</td><td></td></tr><tr><td>Phire Tissue Direct PCR Master Mix</td><td>Thermo Scientific</td><td>F170L</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid miniprep kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4054</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Site Directed Mutagenesis kit</td><td>New England BioLabs</td><td>E0554S</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Geneious software for sgRNA design (version: R11)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism software (8thversion)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SnapGene for molecular cloning (version: 4.2.11)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ルシファーゼベース成長アッセイを用いた細胞内トキソプラズマゴンディ成長に対する化学阻害剤の効率の測定

Determination of Chemical Inhibitor Efficiency against Intracellular Toxoplasma Gondii Growth Using a Luciferase-Based Growth Assay

トキソプラズマゴンディは、ヒト集団に広く影響を与える原虫病原体である。臨床トキソプラズマ症の治療に使用される現在の抗生物質は限られています。さらに, 彼らは人々の特定のグループに悪影響を示します。.したがって、臨床的トキソプラズマ症に対する新規治療薬の発見が不可欠である。新しい抗生物質の開発の最初のステップは、高スループットスクリーニング戦略を用いて寄生虫増殖の阻害において高い有効性を示す化合物を同定することです。細胞内病原体として、トキソプラズマは宿主細胞内でのみ複製することができ、成長の迅速な指標として光学吸光度測定の使用を禁止しています。ここで提示されるルシファーゼベースの成長アッセイのための詳細なプロトコルです。一例として、野生型トキソプラズマ寄生虫の倍増時間を計算し、細胞内増殖の阻害に関するモルホリン尿素-ロイシル-ホモフェニルビニル・スルホンフェニル(LHVS、システインプロテアーゼ標的化合物)の有効性を測定するために使用されます。また、ホモロジー依存組換え(HDR)に50bp相同領域を用いたトキソプラズマにおけるCRISPR-Cas9ベースの遺伝子欠失プロトコルである。野生型およびTgCPL(トキソプラズマカテプシンL様プロテアーゼ)欠損性寄生虫におけるLHVSの阻害効果を定量化することにより、LHVSがΔcpl増殖よりも効率的に野生型寄生虫の増殖を阻害することが示され、TgCPLがThVSがトホソプラズマ中に結合する標的であることを示唆している。このルシファーゼベースの増殖アッセイの高感度かつ容易な操作により、トキソプラズマの増殖をモニタリングし、高スループットでの薬剤有効性の評価に適しています。

図1は、RHΔku80の成長曲線の例::NLuc歪みとその倍率の計算を示す。NLuc一般に、アッセイは、ルシファーゼ活性測定値の変動を考慮して、3つの生物学的複製のそれぞれについて3つの技術的複製で行われる。寄生虫の増殖の正常化された折り目変化を計算するために、感染後24〜96時間の各読み取り値を、アッセイ中の生きた寄生虫の開始量を反映した感染後4時間の初期読み取り値で割った(図1A,B)。寄生虫の倍増時間を決定する観点から、パラサイト成長の正規化された折り目変化のlog2値を各時点に対してプロットした。次に、プロットを線形回帰関数に施し、倍倍時間を表す傾きを求めた(図1C)。
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="...

ここで提示されるプロトコルは、ルシファーゼベースの増殖アッセイを用いたトキソプラズマゴンディの細胞内成長に対する化学化合物の阻害効果を評価するプロトコルである。この技術は、対応する標的遺伝子の遺伝的欠失による阻害特異性を確認するために用いられる。TgCPLプロテアーゼに対するLHVSの阻害を例として評価する。

Toxoplasma gondii is a protozoan pathogen that widely affects the human population. The current antibiotics used for treating clinical toxoplasmosis are ...

これらの高感度戦略は、化学物質阻害剤の阻害効果を評価するために使用することができ、CRISPR-Cas9遺伝子欠失と組み合わせて薬物標的を調査することができます。エンドポイントアッセイを使用する代わりに、経時に寄生虫の成長を監視して、感受性レポータータンパク質を使用して寄生虫の倍増時間の計算を可能にすることができます。このアッセイは、複数の化合物の試験や高スループット方式でのライブラリのスクリーニングのために、384または1、536ウェルマイクロプレートにスケールアップできる可能性があります。この戦略は、他の細胞内微生物病原体の成長と関心のある薬物に対するそれらの反応を定量化するために変更することができます。ルシファーゼベースのトキソプラズマ増殖アッセイを行うために、ヒト包皮線維芽細胞の前播種96ウェルマイクロプレート培養物から培地を注意深く吸着し、150マイクロリットルの寄生虫B懸濁液を3列5列形式でウェルに接種することから始める。細胞培養インキュベーターで4時間のインキュベーションの後、各ウェルから慎重に吸引して非侵入性寄生虫を除去し、室温フェノール赤色フリー培地を含む最初の行のウェルを充填する。その後、PBSの12.5マイクロモルルシメラーゼ基質溶液の100マイクロリットルを上段の各ウェルに加え、マイクロプレートを室温で10分間インキュベートして完全な細胞溶解を可能にします。インキュベーションの終了時に、マイクロプレートリーダー上のルシファーゼ活性を測定する。各読み取り値は、感染後4時間で侵入した寄生虫の初期数を表します。培地を変更せずに、次の4日間、24時間ごとに分析を繰り返します。寄生虫の成長の正規化された折り畳み変化を計算するために、各測定値を感染後4時間の最初の読み取り値で割ることができる。そして、準サイト成長の正規化されたフォールド変化の対数2を各時点に対してプロットし、線形回帰関数に供し、倍倍時間を表す傾きを求めることができる。トキソプラズマの成長に関心のある化合物の阻害の有効性を評価するために、ヒト包皮線維芽細胞を96ウェルマイクロプレートで少なくとも7日間培養してから、摂氏37度と5%の二酸化炭素で4時間実証したように、150マイクロリットルの寄生虫を有する細胞の各井戸を接種した。インキュベーション中、連続希釈により12ウェル貯留槽内の8つの異なる濃度で目的の化合物を調製する。1~3の希釈液で12ウェルのリザーバで化合物を希釈し、各混合物を1ミリリットルのピペットで数回上下にピペット化します。感染後4時間で、2~9列目の各ウェルの培地を、化合物の希釈ごとに150マイクロリットルの培地を補充し、第1列を通常の培地で満たして非治療対照として機能させる。次いで、細胞培養液を培養インキュベーターに96時間戻し、各ウェルのルシファーゼ活性を測定し、各濃度の化合物における培養における増殖阻害の割合を決定する。正規化されたルシファーゼ活性をパーセントで計算するには、各化合物濃度の平均ルシファーゼ活性を非処理パラサイトに由来する平均ルシファーゼ活性で割る。次に、適切なグラフ化ソフトウェアプログラムを使用して、個々の化合物に対する正規化されたルシファーゼーゼ活性をプロットし、各化合物の半分の最大阻害濃度を計算します。目的の遺伝子を削除するためのシングルガイドRNAとCas9を発現するプラスミド構築物を生成するには、トキソプラズマゲノミクスリソースページに移動し、1.5キロベース5および3つの素数未翻訳領域とともにイントロンおよびエキソンを含む遺伝子コード配列全体を取得します。取得した TgCPL シーケンスをシーケンス解析ソフトウェアにコピーし、5 個の主要な未変換領域と 3 つの主要領域にラベルを付けます。トキソプラズマゲノミクスリソースページで、ダウンロード、データファイル、Current_Releaseをクリックします。T.gondii GT1 フォルダーで、[FASTA] を選択します。データフォルダから、トキソプラズマゴンディGT1株ゲノム配列ファイルをダウンロードします。次に、DNA配列解析ソフトウェアにトキソプラズマゲノムという名前のローカルフォルダを作成し、トキソプラズマゲノム配列ファイルをフォルダにインポートします。[ツール]、[クローニング]、[CRISPR サイトの検索] を選択し、PAM サイトの場所に 3 つの素数 Cas9 プライムを設定します。高い特異性スコアを示すシングルガイドRNAを選択し、一般的に98%を超え、NGGに続くGを欠きます。選択された単一ガイドRNAは、通常、対象遺伝子の開始および停止コドンに近い部位に位置する。次に、表に示された設定で PCR プレミックスを使用して PCR 反応を行い、TgUPRT 遺伝子を標的とする単一ガイド RNA を発現する既存のプラスミドを修飾します。トキソプラズマトランスフェクションの場合、修復されたテンプレートDNAを2マイクログラムのシングルガイドRNA Cas9発現プラスミドと混合し、400マイクロリットルの寄生虫リセウ、DNA、および200ミリモルATP 500ミリモル還元グルタチオン500ミリモル還元グルタチオンを1.5ミリリットルの遠心管に混ぜます。サイトミックスバッファーを追加して、必要に応じて最大 500 マイクロリットルの総容量を持ち、エレクトロポレーションキュベットで 4 ミリの隙間に寄生虫 DNA 混合物を転送します。その後、2キロボルトと抵抗の50オームで寄生虫を電気ポレートします。ノックアウト寄生虫をクローン化するには、まず、適切な抗生物質濃度を添加したD10培地の1ミリリットル当たり10個の寄生虫を達成するために寄生虫の2段階希釈を行う。次に、再懸濁精製された寄生虫150マイクロリットルを包皮線維芽細胞で前播種した96ウェルマイクロプレートの各ウェルに移し、マイクロプレートを摂氏37度、5%の二酸化炭素を7日間インキュベートする。インキュベーションの終わりに、単一のプラークを含むウェルを特定し、再懸濁したトキソプラズマ感染ヒト包皮線維芽細胞の75マイクロリットルを、96ウェルマイクロプレート培養物の各ウェルから個々の1.5ミリリットルのチューブに移す。遠心分離によって細胞を収集し、DNA放出添加剤中の希釈バッファーを含む溶解バッファーの10.25マイクロリットルでペレットを再懸濁します。次に、PCRを実行する前に、室温で4分間、摂氏98度で2分間インキュベートし、薬剤耐性カセットの統合と目的の遺伝子の損失をテストします。デルタCPL株におけるLHVSおよび野生型の阻害効果は、異なる阻害剤濃度に対するそれらのルシファーゼ活性をプロットすることによって決定することができる。PCR後、変異したプラスミドを線形化し、1%アガロースゲルにロードして、増幅が成功したことを検証します。ゲル抽出および大腸菌変換後、期待されるプラスミドを含むクローンを、DNAシーケンシングにおける制限エンドヌクレアーゼ消化によってスクリーニングすることができる。修復テンプレート増幅後、アガロースゲル電気泳動を使用して、PCR産物の正しいサイズを確認することができます。一般的に、対象遺伝子のコード配列の欠失をチェックするための初期スクリーニングには7~8個のクローンが選択され、その後にスクリーニングされるクローンの総数を最小限に抑えるために5本および3本の素腕を検出する。さらに、標的タンパク質を認識する抗体が利用可能であれば免疫ブロッティングにより、さらなる検証を完了することができる。ルシファーゼ活性測定を得る前に、模擬感染を伴う透明なマイクロプレートを顕微鏡でチェックし、寄生虫が宿主細胞を完全にライゼしていないことを確認する必要があります。

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(1)細胞内細菌性病原体を標的とする真核生物の細胞浸透性抗菌薬を同時に同定し、(2)真核生物の細胞毒性を評価するために、ハイスループットのリアルタイムアッセイが開発されました。その後、同じ技術のバリエーションをデジタル分注技術と組み合わせて、簡便で高解像度の用量反応、および 2 次元および 3...

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我々は、細胞内および細胞内のブロス増殖する細菌、ならびに哺乳動物宿主細胞に対する細胞毒性を標的、 結核菌に対する新規化合物を発見するためのモジュラーハイスループットスクリーニングシステムを開発しました。...

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学ぶルシファーゼベース成長アッセイを用いたToxoplasma gondiiの細胞内増殖に対する化学阻害剤の効率評価法。CRISPR-Cas9遺伝子欠失と組み合わせて薬剤標的を探索し、ハイスループットスクリーニングに応用可能です。

ルシファーゼベース成長アッセイを用いた細胞内トキソプラズマゴンディ成長に対する化学阻害剤の効率の測定

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