Name: マイクロ流体室システムを用いた運動ニューロン培養におけるオルガネラの軸索輸送 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学ぶマイクロ流体室システムを用いた運動ニューロン培養におけるミトコンドリアと酸性区画の軸索輸送の可視化手法。マウス胚由来培養を用いて神経変性疾患のメカニズム解明と治療法開発に貢献します。

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この研究は、イスラエル科学財団(ISF、561/11)と欧州研究評議会(ERC、309377)からの助成金によって支えられました。

<ol><li>Misgeld, T., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitostasis+in+Neurons%3A+Maintaining+Mitochondria+in+an+Extended+Cellular+Architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture.</a> Neuron. 96, 651-666 (2017).</li>
<li>Devine, M. J., Kittler, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+at+the+neuronal+presynapse+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mitochondria at the neuronal presynapse in health and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 19, 63-80 (2018).</li>
<li>Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+axonal+transport+in+murine+motor+and+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons.</a> Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).</li>
<li>Mandal, A., Drerup, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+Transport+and+Mitochondrial+Function+in+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Axonal Transport and Mitochondrial Function in Neurons.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 373(2019).</li>
<li>Magrané, J., Cortez, C., Gan, W. B., Manfredi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+mitochondrial+transport+and+morphology+are+common+pathological+denominators+in+SOD1+and+TDP43+ALS+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Abnormal mitochondrial transport and morphology are common pathological denominators in SOD1 and TDP43 ALS mouse models.</a> Human Molecular Genetics. 23, 1413-1424 (2014).</li>
<li>Anderson, R. G. W., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+view+of+acidic+intracellular+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A view of acidic intracellular compartments.</a> Journal of Cell Biology. 106, 539-543 (1988).</li>
<li>Kiral, F. R., Kohrs, F. E., Jin, E. J., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab+GTPases+and+Membrane+Trafficking+in+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Rab GTPases and Membrane Trafficking in Neurodegeneration.</a> Current Biology. 28, R471-R486 (2018).</li>
<li>Ya-Cheng Liao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Granules+Hitchhike+on+Lysosomes+for+Long-Distance+Transport%2C+Using+Annexin+A11+as+a+Molecular+Tether%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">RNA Granules Hitchhike on Lysosomes for Long-Distance Transport, Using Annexin A11 as a Molecular Tether.</a> Cell. 179, 147-164 (2019).</li>
<li>Gluska, S., Chein, M., Rotem, N., Ionescu, A., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+Quantum-Dot+labeled+neurotropic+factors+transport+along+primary+neuronal+axons+in+compartmental+microfluidic+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracking Quantum-Dot labeled neurotropic factors transport along primary neuronal axons in compartmental microfluidic chambers.</a> Methods in Cell Biology. 131, 365-387 (2016).</li>
<li>Gershoni-Emek, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+RNAi+Machinery+to+Axonal+Branch+Points+and+Growth+Cones+Is+Facilitated+by+Mitochondria+and+Is+Disrupted+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Localization of RNAi Machinery to Axonal Branch Points and Growth Cones Is Facilitated by Mitochondria and Is Disrupted in ALS.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 311(2018).</li>
<li>Neto, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmentalized+Microfluidic+Platforms%3A+The+Unrivaled+Breakthrough+of+In+Vitro+Tools+for+Neurobiological+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Compartmentalized Microfluidic Platforms: The Unrivaled Breakthrough of In Vitro Tools for Neurobiological Research.</a> Journal of Neuroscience. 36 (46), 11573-11584 (2016).</li>
<li>Ionescu, A., Zahavi, E. E., Gradus, T., Ben-Yaakov, K., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compartmental+microfluidic+system+for+studying+muscle-neuron+communication+and+neuromuscular+junction+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Compartmental microfluidic system for studying muscle-neuron communication and neuromuscular junction maintenance.</a> European Journal of Cell Biology. 95, 69-88 (2016).</li>
<li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+co-culture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">A compartmentalized microfluidic neuromuscular co-culture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li>
<li>Altman, T., Geller, D., Kleeblatt, E., Gradus-Perry, T., Perlson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+compartmental+system+underlines+the+contribution+of+mitochondrial+immobility+to+the+ATP+supply+in+the+NMJ%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">An in vitro compartmental system underlines the contribution of mitochondrial immobility to the ATP supply in the NMJ.</a> Journal of Cell Science. 132 (23), (2019).</li>
<li>Schaller, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+combinatorial+screening+identifies+neurotrophic+factors+for+selective+classes+of+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Novel combinatorial screening identifies neurotrophic factors for selective classes of motor neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114, E2486-E2493 (2017).</li>
<li>Ionescu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+Sigma-1+Receptor+via+Pridopidine+Ameliorates+Central+Features+of+ALS+Pathology+in+a+SOD1G93A+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Targeting the Sigma-1 Receptor via Pridopidine Ameliorates Central Features of ALS Pathology in a SOD1G93A Model.</a> Cell Death & Disease. 10 (3), 210(2019).</li>
<li>Zahavi, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compartmentalized+microfluidic+neuromuscular+coculture+system+reveals+spatial+aspects+of+GDNF+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">A compartmentalized microfluidic neuromuscular coculture system reveals spatial aspects of GDNF functions.</a> Journal of Cell Science. 128, 1241-1252 (2015).</li>
<li>Maimon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mir126-5p+downregulation+facilitates+axon+degeneration+and+nmj+disruption+via+a+non-cell-autonomous+mechanism+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mir126-5p downregulation facilitates axon degeneration and nmj disruption via a non-cell-autonomous mechanism in ALS.</a> Journal of Neuroscience. 38, 5478-5494 (2018).</li>
</ol>

著者らは利益相反を宣言しない。

本プロトコルでは、運動ニューロンにおけるミトコンドリアおよび酸性コンパートメントの軸索輸送を追跡するシステムについて述べている。この簡素化されたin vitroプラットフォームにより、細胞下の神経区画の精密な制御、監視、操作が可能になり、運動ニューロン局所機能の実験的解析が可能になります。このプロトコルは、ALSなどのMN疾患を研究するのに有用であり、疾患10,16,16における軸索輸送機能障害の基礎的なメカニズムを理解することに焦点を当てる。また、このシステムは、栄養因子99、16、microRNA1610、mRNA8、および健康および疾患を有するMNsまたは感覚9または交感神経軸索などの他のニューロンにおける標識タンパク質の輸送の研究に適用<sup class...

MNsは長い軸索を持つ非常に偏光細胞であり、成人の人間では最大1メートルに達する。この現象は、MN 接続性と機能の維持に重要な課題を生み出します。その結果、MNsは、細胞体からシナプスおよび背中への軸索に沿った情報、オルガネラ、および材料の適切な輸送に依存しています。タンパク質、RNA、オルガネラなどの様々な細胞成分は、軸索を介して定期的にシャトルされます。ミトコンドリアは、日常的にMNsで輸送される重要なオルガネラである. ミトコンドリアは、ATPの提供、カルシウムバッファリング、およびシグナリングプロセス11、22を担当するMNsの適切な活動および機能に不可欠である。ミトコンドリアの軸索輸送は、よく研究されたプロセス33、44です。興味深いことに、ミトコンドリア輸送における欠陥は、いくつかの神経変性疾患、特にMN疾患5に関与することが報告された。酸性コンパートメントは、MN軸索に沿って移動する固有のオルガネラの別の例として機能します。酸性コンパートメントは、リソソーム、エンドーソーム、トランスゴルジ装置、および特定の分泌小胞6を含む。酸性コンパートメントの軸索輸送の欠陥は、いくつかの神経変性疾患にも7で発見され、最近の論文はMN疾患におけるその重要性を強調した8。
効率的に軸索輸送を研究するために、体性および軸索コンパートメントを分離するマイクロ流体室は、多くの場合、9、10を10使用しています。マイクロ流体システムの2つの大きな利点と、区分化と軸索の単離は、細胞内プロセス11の研究に理想的である。神経細胞体と軸索の間の空間的分離は、異なる神経区画(例えば、軸索対ソーマ)の細胞外環境を操作するために使用することができる。生化学的、神経細胞の成長/変性、免疫蛍光アッセイはすべてこのプラットフォームから恩恵を受けます。MFCはまた、骨格筋12、13、14,13,14などの他の細胞タイプとニューロンを協調させることによって、細胞間コミュニケーションの研究を支援することができる。
ここでは、運動ニューロンにおけるミトコンドリアおよび酸性コンパートメント輸送を監視するための、シンプルでありながら正確なプロトコルについて述べています。さらに、逆行性および前向き移動小器官の相対的な割合と輸送速度の分布を比較することによって、この方法の使用を示す。

<table><tbody><tr><td>35mm フルオディッシュ &ndash; ガラス底皿</td><td>ワールド精密機器</td><td>WPI FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>50mm フルオディッシュ ガラス底ディッシュ</td><td>ワールド精密機器 WPI</td><td>FD5040-100</td><td></td></tr><tr><td>アンドール iXon DU-897 EMCCD カメラ</td><td>アンドール</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ARA-C (シトシン &beta;-D-アラビノフラノシド)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C1768</td><td>2mM のストック ろ過重水素減少率</td></tr><tr><td>B-27 サプリメント (50X)</td><td>Thermo Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Alomone Labs</td><td>B-250</td><td>Dilute to 10 & micro;0.01% BSA)</td></tr><tr><td>生検パンチ1.25mm</td><td>世界精密機器WPI</td><td>504530</td>大きな<td>MFC</td></tr><tr><td>生検パンチ6mm</td><td>世界精密機器WPI</td><td>の準備</td><td>のために小さなMFC</td></tr><tr><td>生検パンチ7mm</td><td>世界精密機器WPI</td>の準備ができ504533小さなMFC生検パンチ7mm世界精密機器WPI <td>504534</td><td>大きなMFC</td></tr><tr><td>ビットプレーンImarisソフトウェアの準備のために - バージョン8.4.1</td><td>Imaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>#A3311-100G</td><td>5% w/v in ddw</td></tr><tr><td>Chlorotrimetylsilane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#386529-100ML</td><td></td></tr><tr><td>CNTF</td><td>Alomone Labs</td><td>C-240</td><td>10 &micro;0.01% BSA)</td></tr><tr><td>Density Gradient Medium - Optiprep</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I (DNAse) from usvine pancreas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN-25</td><td>stock 10mg/mL in neurobasal</td></tr><tr><td>Dow Corning 高真空シリコーングリース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z273554-1EA</td><td>エポキシ金型調製用</td></tr><tr><td>DPBS 10X</td><td>Thermo Fisher</td><td>#14200-067</td><td>1:10 in DDW で希釈</td></tr><tr><td>デュモンファイン鉗子#55 0.05 &times; 0.02 mm</td><td>F.S.T</td><td></td><td></td></tr> 1125520 <tr><td>エポキシ硬化剤</td><td>Trias Chem S.R.L</td><td>IPE 743</td><td>エポキシ金型準備用</td></tr><tr><td>エポキシ樹脂</td><td>Trias Chem S.R.L</td><td>RP 026UV</td><td>エポキシ金型準備用</td></tr><tr><td>FIJIソフトウェア</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Alomone Labs</td><td>G-240</td><td>10 & micro;g/mL in filtered ddw with 0.01% BSA)</td></tr><tr><td>Glutamax 100X</td><td>Thermo Fisher</td><td>#35050-038</td><td></td></tr><tr><td>HB9:GFP mice strain</td><td>Jackson Laboratories</td><td>005029</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10X</td><td>Thermo Fisher</td><td>#14185-045</td><td>1:10 in ddw with addition of 1% P/S and filter</td></tr><tr><td>iQ software</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Iris scissors, curved, 10 cm</td><td>AS Medizintechnik</td><td>11-441-10</td><td></td></tr><tr><td>アイリスはさみ、ストレート、9 cm</td><td>AS Medizintechnik</td><td>11-440-09</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>#L-2020</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Red</td><td>Thermo Fisher</td><td>L7528</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Deep-Red FM</td><td>Thermo Fisher</td><td>M22426</td><td></td></tr><tr><td>神経基礎培地</td><td>サーモフィッシャー</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>ニコン エクリプス Ti ミコルスコープ</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (P/S) ソリューション</td><td>バイオロジカル インダストリー</td>ズ <td>03-031-1</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-L-オルニチン (PLO)</td><td>シグマ-アルドリッチ</td> <td>#P8638</td><td>1:1000 を希釈 1X PBS</td></tr><tr><td>シルガード 184 シリコーン エラストマー キット</td><td>DOW コーニング</td> <td>コーポレーション#3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>牛膵臓からのトリプシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td>ストック 25 mg/mL 1XPBS</td></tr><tr><td>Vannas スプリング マイクロダイセクションはさみ、3 mm ブレード</td><td>F.S.T</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>横河 CSU X-1</td><td>横河</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マイクロ流体室システムを用いた運動ニューロン培養におけるオルガネラの軸索輸送

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

運動ニューロン(MNs)は非常に長い軸索を持つ極偏光細胞です。軸索輸送はMNの健康にとって重要なメカニズムであり、神経の成長、発達、生存に寄与する。MN軸索における蛍光標識されたオルガネラの軸索輸送を追跡するためのマイクロ流体室(MFC)の使用法について詳細に説明する。この方法は、迅速で、比較的安価であり、空間および時間における細胞内の手がかりの監視を可能にする。我々は、ステッププロトコルをステップごとに記述する:1)ポリジメチルシロキサン(PDMS)の製造;2) MFCにおける腹側脊髄外植体およびMN解心培養のめっき;3)ミトコンドリアと酸性コンパートメントの標識後に生きた共焦点想像;4)手動および半自動軸索輸送分析。最後に、HB9:::GFP腹側脊髄外型軸索の輸送におけるHB9::GFP腹側脊髄の輸送の違いをシステムの有効性の証拠として示す。全体として、このプロトコルは、様々な軸索成分の軸索輸送を研究するための効率的なツールと、空間的実験的可能性を発見するのに役立つMFCの使用のための簡略化されたマニュアルを提供します。

記載されたプロトコルに従って、マウス胚性HB9::GFP脊髄外植体をMFCで培養した(図4A)。エクスプラントは、軸索が完全に遠位コンパートメントに交差したときに、7日間成長しました。ミトトラッカーディープレッドとライソトラッカーレッド染料は、ミトコンドリアと酸性コンパートメントにラベルを付けるために遠位および近位コンパートメントに追加されました(図4C)。遠位溝の軸索を画像化し、動画を次のように分析した:まず、キモグラフ解析を用いて一般的な動き分布を比較した(図4B,D)。この分析は、酸性コンパートメントでのみ逆行方向のバイアスを明らかにしました(非移動 = 77.1 ± 9.5%;逆行= 16.9 ±8.3%、前向性= 6 ± 5%;図4E)...

軸索輸送は運動ニューロンの健康にとって重要なメカニズムです。このプロトコルでは、マイクロ流体室を用いた運動ニューロン軸索における酸性コンパートメントおよびミトコンドリアの軸索輸送を追跡するための詳細な方法を提供する。

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

軸索輸送は、神経の健康と生存率に不可欠です。当社のプロトコルは、軸索輸送を監視および分析するためのエレガントな方法を記述しています。そして、様々な神経疾患モデルに適応することができる。マイクロ流体室の使用は、軸索生物学を研究するために重要である正確な空間時間制御を可能にする。軸索輸送異常は、ALSなどのいくつかの神経変性疾患に関係している。マイクロ流体プラットフォームは、基本的なメカニズムの研究と、軸索輸送欠陥を修復するための試験療法を可能にします。マイクロ流体室プラットフォームは、軸索成長および様々な神経サブタイプの変性を含む軸索研究のさまざまな側面に合わせて容易に適合させることができる。この方法は複雑で、通常は実践的に教えられています。視覚的なデモンストレーションは、軸索輸送の研究に興味のある科学者にこの手順のアクセシビリティを高める。まず、PDMS を一次金型にキャストします。加圧空気を使用してウェハプラットフォームから汚れを取り除き、ウエハーが滑らかで明確に見えるようにしてから続行します。次に、液体窒素で容器を満たし、23ゲージ針で10ミリリットルの注射器を調製します。化学フュームフード内に、封止容器に封入可能な容器にウェハ含有プレートを入れ、プレートを含む各ウエハにつき2ミリリットルの液体窒素をシリンジに充填する。クロロトリメチルシランボトルを開けます。ゴムキャップに注射器を突き刺し、ボトルに窒素を注入します。針を引き出さずに、ボトルを逆さまにし、プレートを含むウエハーごとにクロロトリメチルシランを2ミリリットル引き下げる。クロロトリメチルシランを容器に広げるが、ウエハ含有プレート上に直接入っていない。コンテナーを閉じます。そして、ウエハースあたり5分間インキュベートします。次に、50ミリリットルチューブ内のPDMSベースの47.05グラムを秤量し、合計50グラムの硬化剤に対して16〜1塩基の割合でPDMS硬化剤を添加する。低速ローテーターでPDMSを10分間混ぜ、その後、プレートを含む各ウェハに所望の高さに注ぎます。真空デシケータの中にプレートを2時間置きます。これはPDMS内に閉じ込められた空気を除去し、明確な均一な型を形成する。その後、オーブンでプレートを3時間または70°Cで一晩インキュベートします。マイクロ流体室またはMFCを作成します。PDMS金型をメスでプレートから切り取り、取り外し、壊れやすいので金型を強制しないようにします。実験的なセットアップに応じて、部屋をパンチし、カットするテキスト原稿の指示に従ってください。脊髄外植培養の場合は、大きなMFCの遠位側に7ミリメートルの井戸を2つパンチし、チャネルの端と重なるようにします。近位側では、チャネルの中央に7ミリメートルを十分にパンチして、最小限の重なりを付け、外植に十分なスペースが残されるようにします。近位チャネルの 2 つのエッジに 2 つの追加の 1 ミリメートルの穴をパンチします。そして、単一のチャンバーにPDMSをカットします。その後、MFCを上向きに回し、20ゲージの針を使用して、パンチされた7ミリメートルの井戸に3つの小さな外植洞窟を彫ります。解約された運動ニューロン培養の場合、小さなMFCの2つのチャネルの端に4つの6ミリメートルの井戸をパンチし、PDMSを単一のチャンバーに切断します。MFCを殺菌するには、長さ50センチメートルの粘着テープバンドをベンチに広げます。その後、テープ上のチャンバーの両方の面を押し、それを引き戻します。クリーンチャンバーを新しいプレートに入れ、軌道シェーカーで10分間70%エタノールの分析グレードでインキュベートします。エタノールを処分し、チャンバーを組織培養フードまたはオーブンで摂氏70度で乾燥させます。次に、チャンバーを組織培養グレードのガラス底溝の中央に置き、エッジに軽微な力を加えてPDMSを皿底に結合させます。70°Cで10分間インキュベートします。その後、密着を強化するためにチャンバーを押します。皿をUVで10分間インキュベートし、MFCのコーディングに進みます。両方のコンパートメントに1ミリリットルのPLOあたり1.5ナノグラムを加えます。PLOがチャネルを通して実行されていることを確認します。チャネル入口に直接コーティング媒体をピペット化することによって。MFCを光顕微鏡で調べて、気泡がないか確認します。気泡がマイクロ溝をふさいでいる場合は、2分間真空デシケータにMFCを入れます。MFC チャンネルから余分な空気を取り除きます。その後、PLOと一晩インキュベートします。PLOをラミニンに置き換え、追加の夜のためにMFCをインキュベートします。めっきする前に、ラミニンを培養液で洗ってください。ICR E12.5妊娠マウスを解剖し、羊膜嚢から胚を分離する。胚をHBSSシリコン皿に入れます。頭と尾を取り除き、彼の腹の上にひっくり返します。胚の表面性皮膚を後ろから静かに剥がし、脊髄を露出させる。穏やかなピンセットを使用して、頭から尾に体から脊髄を分離します。髄膜を取り除き、後角を取り除き、脊髄を1ミリメートルの厚さの横切り部に切ります。MFC の近位コンパートメントからすべてのメディアを廃棄します。ピペットを用いた単一の脊髄外植を、合計4マイクロリットルで拾う。そして、洞窟にできるだけ近いそれを注入します。横出口を介して近位ウェルから余分な液体を引き出す。前の手順をさらに 2 回繰り返し、外植が近位チャネルに埋め込まれていることを確認します。近位ウェルにゆっくりと150マイクロリットルのSCEX培地を加えます。めっきの翌日。近位コンパートメントにSCEX培地を交換し、遠位コンパートメントに豊富なSCEX培地を追加します。遠位と近位の井戸の間のウェルあたり少なくとも15マイクロリットルの体積勾配を維持する。4〜6日後、軸索は遠位コンパートメントに渡り、軸索輸送イメージングの準備ができている必要があります。ミトコンドリアと酸性コンパートメントにラベルを付けるには、100ナノモルミトトラッカーディープレッドFM、および100ナノモルライソトラッカーレッドで新鮮なSCEX培地を準備します。そしてマイクロ流体室にそれを加える。37°Cで30〜60分間インキュベートします。その後、暖かいSCEX培地で3回洗います。軸索輸送のライブイメージングを進めます。3秒間隔で100時間経過画像シリーズを取得する。映画ごとに合計5分。マイクロ流体室で7日後。マウス胚性HB9 GFP脊髄外植。私たちは、ミトトラッカーディープレッドとライソトラッカーレッド染料で染色されています。ミトコンドリアと酸性コンパートメントにラベルを付ける。遠位溝の軸索を画像化し、一般的な動き分布を決定するためにキモグラフ解析を用いた。これは、酸性都市区画でのみ逆行方向のバイアスを明らかにしたが、ミトコンドリア輸送では明らかではなかった。粒子密度も定量化され、HB9 GFP脊髄外植軸索の酸性コンパートメントと比較してミトコンドリア粒子の数が多いことが明らかになった。次に、半自動ソフトウェアを用いて、社内コードを用いて単一粒子輸送解析を行った。この分析により、酸性成分とミトコンドリアは粒子速度が似ていることが明らかになった。しかし、酸性コンパートメントだけが逆行運動に偏りを示します。最初は胚性脊髄を単離することは難しい場合があります。正しい胚年齢と適切な解剖ツールを使用するように、この手順を数回練習してください。マイクロ流体室の使用は、軸索生物学の研究方法を変えます。これは、私たちがかつて細胞の体でのみ起こると仮定されている局所的な軸索プロセスを視覚化することができます。

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Neuroscience

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単セルの精度で神経共培養の調製

小胞や細胞小器官などの貨物の細胞内輸送は、分極した微小管を追跡する分子モータータンパク質によって行われます。このプロトコルは、ニューロン内を移動する個々の貨物粒子の輸送の方向性と、関連するモータータンパク質の相対的な量とタイプとの相関関係を説明しています。...

「カーゴマッピング」解析を用いた軸索貨物を移動するに分子モーターの構成を特徴づける

このプロトコルは、組織培養チップ内のスフェロイドから伸びる強い軸索束の自発的な組み立てを通じて、ヒトiPS細胞由来運動神経オルガノイドを作製するための包括的な手順を提供する。...

三次元運動神経オルガノイド発生

ヒトが誘導した多能性幹細胞由来の運動ニューロンを、機能的に活性な神経筋接合の形成をもたらすヒトの一次メソアンジオ芽細胞由来筋膜と共培養することにより、市販の微小流体デバイスにおけるヒト運動ユニットを生成する方法を説明する。...

マイクロ流体デバイスにおける機能性神経筋接合を有するヒト運動ユニットの生成

本プロトコルは、マイクロ流体チャンバーにおけるニューロンミトコンドリアの播種および染色を記載する。これらのチャンバー内の流体圧力勾配により、軸索のミトコンドリアを選択的に処理して、細胞体コンパートメントに影響を与えることなく、薬理学的課題に応じてその特性を分析することができます。...

マイクロフルイディクス支援による軸索ミトコンドリアの選択的脱分極

学ぶマイクロ流体室システムを用いた運動ニューロン培養におけるミトコンドリアと酸性区画の軸索輸送の可視化手法。マウス胚由来培養を用いて神経変性疾患のメカニズム解明と治療法開発に貢献します。

マイクロ流体室システムを用いた運動ニューロン培養におけるオルガネラの軸索輸送

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