Name: 血管化、拡張開発、および顕微鏡イメージングの改善のための腎オルガノイドおよびオルガノイド培養の最適化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: 学ぶ腎オルガノイドの血管化と生存率向上のための鶏胚尿嚢膜（CAM）培養法。高解像度タイムラプス共焦点イメージングにより、腎臓発生と疾患メカニズムの研究を支援します。

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この研究は、スオメン・アカテミア(フィンランドアカデミー)(206038、121647、250900、260056)によって財政的に支援されました。センター・オブ・エクセレンス助成金2012-2017 251314、ムヌアイサテオ - フィンランド腎臓肝臓協会、シグリッド・ジュセリュクセン・セーティオ、ビクトリアスティフテルセン、フィンランドのスウェーデン文化財団、 ノボノルディスク、シェーパヤイェシュト(フィンランド癌学会)、欧州共同体第7枠組みプログラム(FP7/2007-2013;FP7-HEALTH-F5-2012-INNOVATION-1 EURenOmics 305608)、H2020マリー・スクロスカ・キュリー・アクション・トレーニング・イノヴェーティナル・ネットワーク「RETRACT3著者らはポーラ・ハイプス、ヨハンナ・ケコラハティ=リヤス、ハンネレ・ヘルクマンの技術支援に感謝している。
図3、4、映画2は開発の許可を得て復刻される。

動物のケアと手順は、実験動物の使用に関するフィンランドの国内法、実験およびその他の科学的目的のために使用される脊椎動物の保護のための欧州条約(ETS 123)、およびEU指令86/609/EECに従っていました。
1. 鶏CAM上でマウス胚性腎臓及び腎オルガノイドを培養するためのミニリザーバーの製造と異種移植実験の実施
<ol><li>6ウェルまたは12ウェルプレート用に設計されたトランスウェル細胞培養インサートを使用してください。 注: 特定の実験に応じて、大小のミニ貯蔵所を使用できます。最大8つの胚性腎臓を異種移植したり、同じ鶏の胚に複数のミニ貯蔵所を置いたりする場合(例えば、同じ鶏CAM上の実験および制御サンプル)に小さなミニリザーバーを使用するのが最善です。</li>
	<li>円形の鋸刃または手鋸を備えた回転式マルチツールを使用して、挿入物の側面を切り取り、透過性膜が取り付けられた高さ2mmのプラスチックリングを作成します。</li>
	<li>メスや鋭利なナイフでこれらのミニ貯水池の端を磨きます。</li>
	<li>ミニ貯蔵器を70%エタノールで少なくとも1時間殺菌する。</li>
	<li>ミニリザーバーをオートクレーブされた二重蒸留水で洗い、薄層フードで乾燥させます。</li>
	<li>PBSおよび培養培地(高グルコースDMEM/10%FBS/1%ペニシリンストレプトマイシン)でミニリザーバをリンスします。</li>
	<li>ペトリ皿にリザーバーを置き、膜を上に向けて培地の滴(600 μL/400 μL)の上に置きます。</li>
	<li>解剖された外生体胚性腎臓または腎オルガノイドをピペットまたはガラス毛細管の助けを借りて膜上に均等に配置する。腎臓の周りに多くの液体を残さないようにしてください。</li>
	<li>サンプルを37°Cおよび5%CO2の細胞培養インキュベーターで2〜24時間膜に取り付け2ましょう。 注:最大8つのE11.5胚性マウス腎臓または腎臓オルガノイドは、小さなインサートに配置することができます。大きなインサートは、異種移植またはCAMのより広い領域上の細胞ヒドロゲル混合物に胚組織のより大きな部分が使用される場合に推奨される。</li>
	<li>細胞培養インキュベーター12,13,13から以前に発表された方法に従って調製された8日間の元ovo培養胚鶏を取る。</li>
	<li>ミニリザーバをCAMに移して、移植片がCAMに向き、膜がそれらをオーバーレイするようにします。ミニリザーバをCAMの周囲に置き、鶏の胚を覆わないようにします。 注:トランスウェルインサートから製造された小型ミニリザーバを12ウェルプレートに使用する場合、最大3つのミニ貯蔵所を1つのCAMに置くことができます。</li>
	<li>500 μL (6 ウェルインサート) または 300 μL (12 ウェルインサート) の培養液をミニリザーバに加えます。</li>
	<li>最大9日間のチキンCAMでサンプルを栽培します。ミニリザーバの培養培地を毎日交換してください。 注:サンプルの血管の血管は移植後24-48時間で観察できます。</li>
</ol>2. カスタムデザインプレートの製作とFiZD文化の設定
<ol><li>6ウェルプレートの底部に直径20mmの穴を開けます。 注:FiZD 実験では、16 mm の深さ(材料表で指定)を持つ 6 つのウェルプレートを使用してください。</li>
	<li>カウンターシンクドリルビット、メス、または鋭利なナイフで電気ドリルを使用して穴の縁(特に上側)を磨きます。</li>
	<li>プレートを70%エタノールで少なくとも1時間殺菌する。</li>
	<li>プレートをオートクレーブ二重蒸留水で洗い、無菌状態で乾燥させます。</li>
	<li>70%エタノールで22mm x 22mmガラスカバーリップを十分に洗浄するか、Saarelaらの公表されたプロトコルに従ってきれいにしてください。</li>
	<li>無毒なティッシュの接着剤を使用して6つの井戸の版の穴の上側にカバースリップを接着する。穴の周りに接着剤を塗布し、カバースリップをそっと置いてカバーを覆います。接着剤を乾燥させます。</li>
	<li>プレートを実体顕微鏡で検査し、必要に応じてカバーリップの表面から余分な乾燥接着剤を取り除きます。 メモ:カバースリップの上に接着剤がないことを確認して、サンプルの圧縮を確実にします。</li>
	<li>ポリスチレンビーズ(70 μm粒径)を等量のヒドロゲルと混合します。ウェルあたり50~100μLの体積で十分です。 注:ヒドロゲルとポリスチレンビーズの混合物を氷の上に保管してください。</li>
	<li>トランスウェルインサートを、膜を上にして解剖顕微鏡の下に置きます。</li>
	<li>サンプル(例えば、元の生体胚性腎臓または腎オルガノイド)を膜上に均等に配置する。</li>
	<li>壊れやすい組織への損傷を避けるために、サンプルの隣にヒドロゲル/ポリスチレンビーズ混合物を慎重に追加します。</li>
	<li>トランスウェル挿入物を反転して、サンプルを組み立てた膜が下向きになるようにします。</li>
	<li>修正された6ウェルプレートのウェルに挿入物をそっと置き、サンプルがビーズのレベルまで圧縮されるようにそっと押し下げます。 メモ:顕微鏡で圧縮の進行を追従してください。</li>
	<li>挿入物を片手でウェルに少し押し付け、挿入物の周囲の3点ではんだ付け鉄でプラスチックを溶かしてプレートに固定します。</li>
	<li>インサートがプレートに固定されたら、2 mLの培養培地(DMEM/10%FBS/1%ペニシリンストレプトマイシン)をウェルに加え、残りのウェルをプレートに同じように組み立て続けます。</li>
	<li>完成したプレートを逆回し顕微鏡のステージ上のインキュベーターに移して、タイムラプスイメージングを行います。</li>
	<li>適切な実験設定を使用してサンプルのタイムラプスイメージングを行います。 注:タイムラプス実験中にプレートのウェル内の培養培地を交換する必要はありませんが、挿入物の側面の穴を通して簡単に行うことができます。</li>
</ol>

<ol><li>Saxen, L., Wartiovaara, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+contact+and+cell+adhesion+during+tissue+organization%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cell contact and cell adhesion during tissue organization.</a> International Journal of Cancer. 1 (3), 271-290 (1966).</li>
<li>Saxen, L., Toivonen, S., Vainio, T., Korhonen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untersuchungen+%C3%BCber+die+tubulogenese+der+niere%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+F%C3%BCr+Naturforschung%22%5BJournal%5D)">Untersuchungen über die tubulogenese der niere.</a> Zeitschrift Für Naturforschung. 20 (4), (1965).</li>
<li>Saxen, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaxen%2C+L+%22Organogenesis+of+the+Kidney.+1st+ed%22">Organogenesis of the Kidney. 1st ed</a>. , Cambridge University Press. Cambridge. (1987).</li>
<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 536 (7615), 238(2016).</li>
<li>Halt, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD146%2B+cells+are+essential+for+kidney+vasculature+development%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">CD146+ cells are essential for kidney vasculature development.</a> Kidney International. 90, 311-324 (2016).</li>
<li>van den Berg, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+Subcapsular+Transplantation+of+PSC-Derived+Kidney+Organoids+Induces+Neo-vasculogenesis+and+Significant+Glomerular+and+Tubular+Maturation+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Renal Subcapsular Transplantation of PSC-Derived Kidney Organoids Induces Neo-vasculogenesis and Significant Glomerular and Tubular Maturation In Vivo.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).</li>
<li>Sariola, H., Ekblom, P., Lehtonen, E., Saxen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+vascularization+of+the+metanephric+kidney+grafted+on+the+chorioallantoic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation and vascularization of the metanephric kidney grafted on the chorioallantoic membrane.</a> Developmental Biology. 96 (2), 427-435 (1983).</li>
<li>Sariola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incomplete+fusion+of+the+epithelial+and+endothelial+basement+membranes+in+interspecies+hybrid+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Incomplete fusion of the epithelial and endothelial basement membranes in interspecies hybrid glomeruli.</a> Cell Differentiation. 14 (3), 189-195 (1984).</li>
<li>Ekblom, P., Sariola, H., Karkinen-Jääskeläinen, M., Saxén, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+the+glomerular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The origin of the glomerular endothelium.</a> Cell Differentiation. 11 (1), 35-39 (1982).</li>
<li>Short, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Quantification+of+Tissue+Dynamics+in+the+Developing+Mouse+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Global Quantification of Tissue Dynamics in the Developing Mouse Kidney.</a> Developmental Cell. 29, 188-202 (2014).</li>
<li>Saarela, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+fixed+z-direction+%28FiZD%29+kidney+primordia+and+an+organoid+culture+system+for+time-lapse+confocal+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Novel fixed z-direction (FiZD) kidney primordia and an organoid culture system for time-lapse confocal imaging.</a> Development. 144 (6), 1113-1117 (2017).</li>
<li>Yalcin, H. C., Shekhar, A., Rane, A. A., Butcher, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ex-ovo+Chicken+Embryo+Culture+System+Suitable+for+Imaging+and+Microsurgery+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An ex-ovo Chicken Embryo Culture System Suitable for Imaging and Microsurgery Applications.</a> Journal of Visualized Experiments. 44, e2154(2010).</li>
<li>Schomann, T., Qunneis, F., Widera, D., Kaltschmidt, C., Kaltschmidt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+ex+ovo-cultivation+of+developing+chicken+embryos+for+human+stem+cell+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Improved method for ex ovo-cultivation of developing chicken embryos for human stem cell xenografts.</a> Stem Cells International. 2013, 960958(2013).</li>
<li>Prunskaite-Hyyryläinen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt4+coordinates+directional+cell+migration+and+extension+of+the+M%C3%BCllerian+duct+essential+for+ontogenesis+of+the+female+reproductive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Wnt4 coordinates directional cell migration and extension of the Müllerian duct essential for ontogenesis of the female reproductive tract.</a> Human Molecular Genetics. 25 (6), 1059-1073 (2016).</li>
<li>Gustafsson, E., Brakebusch, C., Hietanen, K., Fässler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tie-1-directed+expression+of+Cre+recombinase+in+endothelial+cells+of+embryoid+bodies+and+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Tie-1-directed expression of Cre recombinase in endothelial cells of embryoid bodies and transgenic mice.</a> Journal of Cell Science. 114, 671-676 (2001).</li>
<li>Homan, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+vascularization+and+maturation+of+kidney+organoids+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro.</a> Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).</li>
<li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+technique+for+organ+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">A modified technique for organ culture in vitro.</a> Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

古典的な腎性素培養法を改良し、血管化、拡張開発、および最適4D(すなわち、3D画像および時間)ex vivo胚性腎臓およびオルガノイドのイメージングを可能にする2つの詳細なプロトコルが提示される。このセクションでは、この方法の重要な手順を説明し、トラブルシューティングについて説明します。
他のCAM培養法とこの改良された鶏CAM培養法との有意な違いは、CAMへの胚性腎臓および腎臓オルガノイドの異種移植におけるカスタムメイドのミニリザーバーの使用である。変更されたトランスウェルインサートの膜底部は、サンプルを鶏CAMに対して押し付け、所定の位置に保ちます。挿入物の側面は、乾燥から移植片を保護する培養培地のための貯蔵所として機能する。この方法は、ミニ貯蔵所を配置することができるCAMのより広い領域を露出させ、血管化プロセス12、13に視覚的に従うことを容易にするので、13元ovo培養胚鶏CAMへの異種移植が強く推奨される。
<p class="jove_cont...

胚性腎臓のオルガノーチ培養は、数十年前2、2、3年前に腎生年月1日を研究する重要なモデルとなった。,3腎オルガノイドは、健康で病気の腎臓の発達を研究するための高度なモデルシステムを表す4.しかし、両方の方法の主な欠点は、どちらの方法も腎臓の主な機能である血液濾過を再現していないということです。腎血管系と腎血管系は、生体内開発の初期段階と同様に、腎オルガノイドおよび有機的培養で発達する。しかし、体外で形成された糸球体は血管5のままである。元生体胚性腎臓および腎組織性の血管化は、インビボ条件下でのみ移植実験において以前に実証された。例えば、マウス腎臓カプセルの下でヒト多能性幹細胞由来の腎オルガノイドを移植することにより、機能ステージ6へのオルガノイド中のネフロンの開発が可能になる。
純粋にインビトロ培養と生体内移植方法の中間的アプローチは、鳥類胚のCAMへの異種移植である。インタクトマウス腎臓原始の血管化は、このシステム77,88を用いて以前に実証されている。しかしながら、異種移植されたマウス腎臓における腎脈管系は、移植片9ではなく宿主内皮由来であったことも示された。この観察は、ドナー由来の内皮細胞の生存のために実験条件が非透過性であったため、胚性腎臓のキメラ(鳥類哺乳類)モデルの可能性を著しく低下させ、腎臓血管系の発達を研究した。
このプロトコルの最初の部分で提示された鳥卵のCAM上のマウス胚性腎臓の培養のための改善された方法である、organotypic培養と異種移植の微小環境条件を組み合わせた。以前の方法の主な改善は、マウスの胚性腎臓と腎オルガノイドをCAMに直接置く代わりに、移植領域が移植された組織を供給する培養培地で満たされた透過性ミニリザーバーで重ね合せることである栄養素を使用し、乾燥から保護します。実験の成功率は大幅に増加し、ドナー由来血管系の発達条件は改善する。この方法を異種移植培養物に適用すると、ドナー腎臓からの内因性内皮細胞から構成される糸球体血管系の発達が生じる。
細胞形態形成の詳細な分析は、腎臓培養モデルのもう一つの重要なアプリケーションです。腎臓培養のタイムラプス画像取得の以前に報告された方法は、胚性腎臓の全体的な形態およびパターニングの分析にのみ十分であるが、個々の細胞10を追跡するためのものではない。近年、腎オルガノイドとオルガノピック培養物の高解像度共焦点共焦点3Dタイムラプスイメージングを目的とした新規固定Z方向(FiZD)法が11に記載された。この方法では、オルガノイドと胚器官は、サンプルの厚さが70μmに達するまで、カスタム設計プレート内のガラスカバースリップと透過性のトランスウェルインサートの透過膜の間で穏やかに圧縮され、イメージングに最適な光学条件を提供します。方法の第2部では、カスタム設計プレートの製造と長期オルガノイドイメージングのためのFiZD実験の設定のための詳細なプロトコルが記載されている。

<table><tbody><tr><td>調整可能なスペードドリルビット</td><td>ボッシュ</td><td>2609255277</td><td>直径20mmの穴あけ用</td></tr><tr><td>自動エッグターナー</td><td>OLBA B.V.、オランダ</td><td>AT-42</td><td>ex ovoセットアップ前の卵のインキュベーション用。</td></tr><tr><td>セルインキュベータ</td>ー<td>パナソニック</td><td>13090543</td><td>温度を37°Cに設定。C、湿度90%、CO2</td></tr><tr><td>細胞インキュベーター</td><td>SANYO</td><td>10070347</td><td>Chicken CAM培養インキュベーター。温度は37°Cに設定されています。C、湿度90%、CO2</td></tr><tr><td>Cellstar 6ウェルプレート</td><td>Greiner</td><td>M9062</td>インサート<td>と一致するウェルの深さ16 mm</td></tr><tr><td>Dremel回転工具用丸鋸刃</td><td>Dremel</td><td>SC690</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td>LSM780</td><td></td></tr><tr><td>Corning Transwell 透過性ポリカーボネートメンブレンインサート付きマルチウェルプレート</td><td>Corning</td><td>10301031</td><td>6ウェルプレート用。40 &マイクロ;mの細孔のサイズ</td></tr><tr><td>皿穴ドリルビット</td><td>Craftomat、Bauhaus</td><td>22377902</td><td>磨くこと(20.5 mm、1/4 "、HSS)</td></tr><tr><td>のための使い捨て可能なガラス毛細管</td><td>Blaubrand</td><td>7087 33</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てメス</td><td>Swann-Morton</td><td>0501</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>Olympus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>鋭い機械</td><td>Bosch</td><td>GSR 18 V-ECプロフェッショナル</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのモディファイドイーグルのミディア</td>ム<td>シグマ</td><td>D777</td>高<td>グルコース</td></tr><tr><td>卵インキュベーターコンパクトS84</td>グラン<td>バッハ、ドイツ</td><td>8012</td><td>exovoセットアップ前の卵のインキュベーション用。温度は38°Cに設定されています。相対湿度が60%以上に設定されたC</td></tr> <tr><td>エタノール(70%)</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>受精卵</td><td>Haaviston Siitoskanala, Panelia, Finland</td><td></td><td>Hy-Line White and Nick Chick</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>HyClone</td><td>SH3007003HI Thermo Scientific</td><td></td></tr><tr><td>Forceps DUMONT #5</td><td>Dumont</td> <td>#5SF</td><td></td></tr><tr><td>Glass Coverslips</td><td>Menzel-Gl&auml;ser</td>メン<td>ゼルBBAD02200220#A1TBCMNZ#0#</td><td>22x22 mm</td></tr><tr><td>ヒストアクリル接着剤</td><td>ブラウン</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>コーニング</td><td>356230</td><td></td></tr>ステージ<tr><td>上のインキュベータ</td><td>ーOkolab</td><td></td><td>大胆なライン、カスタムメイド</td></tr><tr><td>PBS -/-</td><td>コーニング</td><td>20-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>PBS +/+</td><td>Biowest</td><td>X0520-500</td><td>ミニリザーバーを洗浄します。</td></tr><tr><td>ペニシリンとストレプトマイシン</td><td>シグマ</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>ポリスチレンビーズ</td><td>小体</td><td>1000263-10</td><td>70 &micro;直径のm</td></tr><tr><td>ロータリーマルチツールシステム</td><td>ドレメル</td><td>4000</td><td></td></tr>は<tr><td>んだごて</td><td>ウェラーTCP</td><td>S</td><td>加熱ガラスキャピラリーも使用できます</td></tr><tr><td>Thincert 12ウェル細胞培養インサート 0.4 & マイクロ;m-pore ポリスチレンメンブレン</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665641</td><td></td></tr><tr><td>Thincert 6 ウェル細胞培養インサート 0.4 & micro;M孔ポリスチレンメンブレン</td><td>Greiner Bio-One</td><td>657610</td><td></td></tr></tbody></table>

血管化、拡張開発、および顕微鏡イメージングの改善のための腎オルガノイドおよびオルガノイド培養の最適化

Optimization of Renal Organoid and Organotypic Culture for Vascularization, Extended Development, and Improved Microscopy Imaging

胚性腎臓の有機的培養、特に多能性幹細胞由来の腎臓オルガノイドは、発達過程および腎臓病のモデリングに優れたツールである。しかし、モデルは血管化と機能性の欠如によって制限されています。これに対処するために、血液の血管化と回復を得るために鳥の胚の絨毛管内膜(CAM)に細胞および組織を異種移植する方法のための改良されたプロトコルが開発された。移植片はCAMにサンプルを固定し、乾燥から移植片を保護する培養媒体とそれらを供給するカスタムメイドのミニ貯蔵所と重ねられる。改善された培養法により、異種移植片は最大9日間増殖する。また、この原稿は、以前に発表された固定Z方向(FiZD)法を用いて、腎オルガノイドおよび有機的培養物の長期的な共焦点イメージングに最適な条件を提供する方法についても説明しています。この方法は、ガラスカバースリップと膜の間の胚器官またはオルガノイドを大量の媒体で穏やかに圧縮し、最大12日間のイメージングに優れた条件を提供します。これらの方法は、共焦点イメージングを改善した腎オルガノイドおよび有機的な腎臓培養物への血管化および血流を可能にする。ここに記載されている方法は、腎臓ex vivoの基本的および応用機能を研究するために非常に有益である。どちらの方法も、様々なタイプの組織やオルガノイドに適用可能です。

ここで提示されるCAM培養プロトコルは、鶏CAMの異種移植の結果として腎オルガノイドおよび胚性腎臓の高効率な血管形成を可能にした(図1、動画1)。培養培地を含むミニリザーバは、ドナー組織に栄養素を供給し、適切な血管化前の期間中に乾燥から保護した。この方法は、ドナー由来の内皮細胞が増殖するための寛容な条件を提供した。したがって、移植された腎臓およびオルガノイドにおける腎血管系は、主に、排他的ではないが、ドナー特異的細胞によって表された(図2B、C、F)。CFより成熟した糸球体血管系は、腎性素性培養よりもCAMに移植された腎臓および腎オルガノイドで得られた(図2D、E)。E
FiZDプロトコルは、高解像度共焦点顕微鏡を用いた、エキビボ胚性腎臓および腎オルガノイドの長期のタイム...

この研究は、臓器の発達を研究するための2つの方法、培養胚器官およびオルガノイドの血管化を可能にする鳥類胚からの絨毛球膜(CAM)の改善された異種移植セットアップと、新しい固定z方向を説明する。高解像時間経過共焦点イメージングを可能にする改変実験条件を有する臓器培養法。

Embryonic kidney organotypic cultures, and especially pluripotent stem cell-derived kidney organoids, are excellent tools for following developmental ...

プログラムされた幹細胞に由来する腎臓臓器培養およびオルガネラは、腎臓の発達と病気の背後にあるメカニズムを研究する優れた方法を提供します。しかし、現在の臓器培養システムは腎臓への血流を提供しない。このため、現在のモデルが不完全であり、血液濾過である腎臓の主な機能を再現できない理由。本論文では、鶏の胚の絨毛膜上での胚腎臓およびオルガノイドの培養と可視化のための改善されたプロトコルを紹介する。私たちの新しい実験セットアップでは、CAMに移植された腎臓の初歩を、培養培地で満たされた透過性の意味の貯水池に重ね合わせています。このプロトコルは、腎臓の初歩および内皮細胞の生存を著しく増加させる。この方法は、発達中の糸球体への血流を可能にする。最近では、高分解能共焦点3Dタイムラプスイメージングを提供する新規固定定方向臓器培養法も発表しました。この方法は、オルガノイドおよび臓器の初歩の長期的な共焦点イメージングに最適な条件を提供した。このアプローチでは、ガラスカバースリップと透過膜の間の組織を穏やかに圧縮します。ここでは、カスタムデザインプレートの作り方と、培養実験の設定方法を示します。従って本書では改良された腎小器官チューブ培養技術を紹介する。この方法は、小器官の起源をモデル化し、胚性腎臓および腎オルガノイドex vivoを研究するための高解像度イメージングを行うより良い方法を提供する。あなたの実験に応じて、6ウェルまたは12ウェルプレート用に設計されたセルコントラインサートを転送してください。Dremelツールを使用してインサートの側面を切り取り、透過性膜が取り付けられた2ミリメートルの高いプラスチックリングを作成します。メスや鋭利なナイフでスワーフからリングの端を磨きます。ミニリザーバを70%エタノールで少なくとも1時間殺菌します。その後、蒸留水でオートクレーブでミニ貯水池を洗浄し、ラミナーフードでそれらを乾燥させます。PBSおよび培養培地でミニリザーバをすすいでください。膜を上向きにした培養培地の滴の上にシャーレの上に貯水池を置きます。解剖された外生体胚性腎臓または腎オルガノイドを膜に配置する。サンプルの周りに多くの液体を残すことを避け、細胞培養インキュベーターに2〜24時間取り付けたままにしておきます。exenal移植は、8日前の元オボ胚性鶏の絨毛膜に行われる。膜が移植片を覆っているようにミニ貯留層を移す。彼らは胚をカバーしないようにCAMの周辺にそれらを置きます。次に、ミニリザーバに培養培地を加えます。最大9日間チキンCAMのサンプルを栽培します。ミニリザーバの培養培地を毎日交換してください。サンプルの血管化は、移植後24〜48時間既に観察され得る。固定培養のためのカスタム設計された6ウェルプレートを作るために。適切なドリルビットを備えたドリルマシンを使用して、

optimization-renal-organoid-organotypic-culture-for-vascularization

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このビデオでは、鳥類の胚から絨毛膜(CAM)に改良された異種移植セットアップを使用して臓器の発達を研究する方法を説明しています。この方法により、完全に血管新生された培養胚器官およびオルガノイドの発生が可能になります。...

ニワトリCAM上の腎臓器官型培養:腎血管構造の形成を誘導するためのニワトリCAM上のマウス腎臓外植片の移植技術

このプロトコルで説明した3次元培養法は、分枝状の臓器へのそれらの大幅な拡大、分化および形態形成などの分散したマウス胎児の膵臓前駆細胞から膵臓の発達を再現。この方法は、画像化、ニッチの機能的干渉や操作に適している。...

分散マウス胚性前駆細胞からin vitro膵臓器官形成

オルガノイドの全体の3D構造および細胞内容、ならびに元の組織に似たその表現型は、ここで説明する単一細胞分解能3D画像化プロトコルを使用して捕捉することができる。このプロトコルは、起源、大きさおよび形状が変化するオルガノイドの広い範囲に適用することができる。...

インタクトオルガノイドの単一細胞分解能3次元イメージング

本プロトコルは、患者由来異種移植片(PDX)の拡張in...

浸透マイクロ流体プラットフォームにおける患者由来異種移植片のEx vivo 3Dヒドロゲル培養の生存率の向上

ここでは、ヒト多能性幹細胞(hPSC)から腎臓オルガノイドを生成するためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、2週間以内に腎臓オルガノイドを生成する。得られた腎臓オルガノイドは、大規模なスピナーフラスコまたはマルチウェル磁気攪拌プレートで培養して、薬物試験アプローチを並行させることができます。...

ヒト多能性幹細胞から腎臓オルガノイドを生成するための簡略化された方法

この論文は、オルガノイドを培養し、高解像度顕微鏡を使用して観察できる、mm2あたり数百のマイクロコンテナを備えた新しいタイプの培養基質の製造プロトコルを提示します。細胞播種および免疫染色プロトコルも詳述されています。...

オルガノイドの培養および3Dイメージングのためのハイスループットプラットフォーム

ここでは、ニワトリ胚のセロミック腔への腎臓オルガノイドの移植のための詳細なプロトコルを提示します。この方法は、8日以内にオルガノイドの血管新生と成熟の促進を誘発し、これらのプロセスを効率的に研究するために使用できます。...

ニワトリ胚の脳内移植による腎オルガノイドの効率的な血管新生

このプロトコルは懸濁液培養条件を使用して誘導された多能性幹細胞(iPS細胞)から腎臓オルガノイドを生産するための包括的で効率的な方法を提示します。この研究の主な重点は、初期細胞密度とWNTアゴニスト濃度の決定にあり、それによって腎臓オルガノイド研究に関心のある研究者に利益をもたらします。...

人工多能性幹細胞からの懸濁液中の腎臓オルガノイドの生成

ここでは、複数の成熟段階にあるヒト脳オルガノイドをニワトリの絨毛膜膜(CAM)に生着させるプロトコルを紹介します。脳オルガノイドは、ガイドなしで標準化されたプロトコルに従って増殖しました。...

寛容なニワトリ胚絨毛膜への初期の非誘導ヒト脳オルガノイド神経血管ニッチモデリング

このプロトコールは、ヒト多能性幹細胞を使用して血管オルガノイドを生成する方法を示します。...

ヒト人工多能性幹細胞からの血管オルガノイド作製

学ぶ腎オルガノイドの血管化と生存率向上のための鶏胚尿嚢膜（CAM）培養法。高解像度タイムラプス共焦点イメージングにより、腎臓発生と疾患メカニズムの研究を支援します。

血管化、拡張開発、および顕微鏡イメージングの改善のための腎オルガノイドおよびオルガノイド培養の最適化

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