Name: がん細胞の移動と浸潤のインピーダンスベースリアルタイム測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学ぶインピーダンスベースのリアルタイム測定法により、U-118MG神経膠芽腫細胞の移動と浸潤を無染色で評価する。遺伝子機能や薬剤処理の影響を動的に解析し、がん転移メカニズムの理解に貢献する。

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リアルタイムの細胞解析システムデータに関する彼女の技術支援に対して、オリビア・ファンクに感謝します。また、この原稿を編集してくれたチルドレンズ・マーシー・カンザスシティのメディカル・ライティング・センターにも感謝します。この研究は、トム・キーヴェニー小児がん研究基金(TP)と小児慈悲病院中西部がんアライアンスパートナー諮問委員会(TPへの資金提供)によって支援されました。

注:すべての細胞培養材料は滅菌する必要があり、実験全体は滅菌条件下でバイオセーフティキャビネットで行う必要があります。
1. U-118MG神経膠芽腫細胞株の培養とエレクトロポレーション
<ol><li>U-118MG細胞株をダルベッコの変性イーグル培地(DMEM)を含む5%ウシ胎児血清(FBS)で培養し、5%CO2インキュベーターを含む湿潤雰囲気下で37°Cで維持(培養条件)2</li>
	<li>エレクトロポレーションのために70–80%コンフルエント健康細胞を使用してください。</li>
	<li>細胞を収穫するために、1x PBSで培養皿で成長している細胞を洗浄し、0.05%トリプシン-EDTAの2 mLを加えます。インキュベーターに30s入れ、トリプシン-EDTAを取り除きます。培養液中の細胞を15mLチューブに回収する。</li>
	<li>ハンドヘルド自動セルカウンターを使用してセルを数え、遠心分離細胞を100 x gで5分間カウントし、上清を捨てます。</li>
	<li>培養液中の細胞ペレットを懸濁し、各条件に対して60万個の細胞をマイクロ遠心チューブに取り込みます。実験計画と成長率に応じてセル数を調整します。</li>
	<li>細胞懸濁液をマイクロ遠心チューブに移し、Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)を800 μL加えます。30 sのミニセントリフュージを使用してスピンダウンし、上清を捨てます。</li>
	<li>60 μLのリサスペンションバッファーRを細胞ペレットに加え、siRNA(すなわち、非標的siRNA、Crk siRNA、CrkL siRNA、またはCrkおよびCrkL siRNAの両方)を各マイクロ遠心分離チューブに6μMの濃度で加えます。タップして軽く混ぜます。</li>
	<li>エレクトロポレーションシステムを持つ10 μLのセルを1,350 Vで10ミリ秒で3パルスで10ミリ秒で電気ポレートし、電気ポポレートされた細胞を5 mLの培養液に移します。各条件に対して調製した残りの細胞についてエレクトロポレーションを繰り返します。</li>
	<li>すべてのそれぞれのエレクトロポレーションを完了します。電気ポレートされた細胞を条件ごとに2つの35 mm皿に移し、培養条件下で3日間培養します。</li>
	<li>3日目に、DMEM(低血清培地)を含む全ての電気泳動細胞を、実際の細胞インピーダンス測定の前に6時間、6時間処理します。</li>
</ol>2. リアルタイム細胞解析システム、細胞浸潤・移動(CIM)プレート、およびめっき用の電解されたU-118MGセルの調製
<ol><li>実験開始の5~6時間前に培養条件下で、リアルタイムの細胞分析システムを培養条件下でCO2インキュベーターに入れ、培養条件に合うようにシステムを安定化させます。</li>
	<li>浸潤アッセイの場合、CIMプレートの上部チャンバの各ウェルに0.1 μg/μLの細胞外マトリックス(ECM)ゲルを含むDMEM(平野培地)のプレート50μL。気泡を持つことを避けるために、逆ピペット法を使用してください。すぐに30 μLのECMゲルを取り除き、20 μL をウェルに残します。</li>
	<li>ECMゲルコーティング後、蓋をした状態で4時間培養条件下でインキュベーターにプレートを保管します。ECMゲルコーティングおよび乾燥の間、プレートの上部チャンバの電極と手、バイオセーフティキャビネットの表面、またはCO2インキュベーターとの直接接触を避けるため、予防措置を講じてください。</li>
	<li>インピーダンス測定プログラムをセットアップするには、関連するソフトウェアアイコン(「材料表」を参照)をダブルクリックして、システムソフトウェアアプリケーション(制御ユニット)を開きます。各クレードルには、実験条件、インピーダンス測定時間間隔と持続時間、データ分析を設定するためのタブが異なる個別のウィンドウがあります。</li>
	<li>[レイアウト]タブで、各生物学的条件に対して 4 倍のウェルを設定し、[スケジュール]タブで 2 段階のセルインピーダンス測定値を設定します。最初のステップは、1回のベースライン測定(1分間隔で1回のスイープ)を行い、2番目のステップは実際の実験のために個々のクレードルの細胞インピーダンスを測定することです。移行には、10分間隔で145スイープを使用し、侵入のために、10分間隔で577スイープ、個別に設定)それぞれの個々のクレードルで。</li>
	<li>細胞インピーダンス測定開始の1時間前に、プレートの下部チャンバのウェルに10%FBSを持つDMEMの160 μLを加えます。ECMゲルコーティングされたウェルを含む上部チャンバーまたは下の部屋でコーティングされていない井戸を組み立てて、それぞれ浸潤と移動を測定します。</li>
	<li>上部チャンバーのウェルに低血清培地50 μLを充填し、システムのクレードルに入れます。[メッセージ]タブをクリックして、すべてのウェルがコントロールユニットによって認識されているかどうかを確認します。メッセージがOKと表示された場合は、クレードル内のプレートが実験の準備が整います。</li>
	<li>培養条件下で培養条件下で完全にパックされたプレートを培養器に1時間入れ、リアルタイムの細胞分析システムクレードルでの測定に先立ち、パックされたプレートを細胞培養条件に順応させるために不可欠である。</li>
	<li>低血清培地で処理した細胞を収穫するために、ステップ1.3のように細胞をトリプシン化し、低血清培地に集め、ステップ1.4のように細胞を数える。</li>
	<li>計数後、遠心分離細胞を100xgで5分間、上清を捨てる。 </li>
	<li>800,000個の細胞を低血清培地800 μLで再懸濁し、移行および浸潤アッセイを行います。さらに、2 mLの培養培地で30万個の細胞を再懸濁し、35mm皿に種を入れ、ウェスタンブロット分析を行い、CrkおよびCrkLの調節されたノックダウンを確認します。</li>
</ol>3. ベースライン読み取り、細胞の播種、細胞インピーダンスの測定と可視化
<ol><li>クレードルのスタートボタンをクリックして、ベースラインの読み取り値を測定します。ベースラインは、培養条件下でリアルタイム細胞分析システムのクレードルでプレートを1時間予入培養した後、上のチャンバーのそれぞれのウェルに細胞を播種する前に読み取る必要があります。 注:クレードルのスタートボタンをクリックすると、制御ユニットは実験ファイルを保存するかどうかを尋ねます。ファイルが保存されると、クレードル アナライザーは、プログラムで設定されたベースライン セルインピーダンスを測定し、クレードルの開始ボタンが再度クリックされて 2 番目のステップでセルインピーダンスを測定するまで、一時停止モードに入ります。</li>
	<li>ベースライン測定後に揺りかごから移動と侵入のために両方のプレートを取り出し、バイオセーフティキャビネットに保管してください。</li>
	<li>CIMプレートの上部チャンバ内の各生物学的状態に対して4倍の4倍の4倍の種子100μLの細胞(100,000細胞)を、気泡を避けるために逆ピペットによりクレードルの制御ユニットにプログラムした。</li>
	<li>播種後、プレートをバイオセーフティキャビネットの下に30分間室温で保管し、細胞が均一に底に落ち着くようにします。プレートをそれぞれのクレードルに戻し、クレードルスタートボタンをクリックして、2.5の2番目のステップでプログラムされたセルインピーダンスの測定を開始します。</li>
	<li>最後のスイープが終了すると、実験が終了し、結果が自動的に保存されます。</li>
	<li>[データ分析]タブで、実験の完了中または完了後に時間依存的にセルインデックスとしてのセルインピーダンスの変化を視覚化します。4倍のそれぞれの条件は、個別に、または平均値または標準偏差のオプションボックスをクリックして、平均または標準偏差として視覚化することができます。</li>
	<li>セルインデックスデータをスプレッドシートファイルにエクスポートするには、空のスプレッドシートファイルを開き、データ分析ウィンドウの中央にカーソルを置いて右クリックします。表示されるダイアログ ボックスで、[データをリスト形式にコピーする] オプションを選択し、開いているスプレッドシートにデータを貼り付けます。</li>
	<li>セルインピーダンス測定の実際の開始時間を表す生データの時間を調整します。2 番目のステップの開始時刻はゼロに設定されます。 注:制御部は、正規化の有無にかかわらずセルインデックスを取得するオプション(すなわち、正規化されたセルインデックス)を、時間依存的な方法でグラフィカルな表示として結果を視覚化するオプションを有する。この例では、セルインデックスデータは、処理およびグラフィック表示のために正規化されずにエクスポートされます。</li>
	<li>各クレードルのリリースボタンをクリックして実験をリリースします。</li>
</ol>

<ol><li>Park, T., Koptyra, M., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+Growth+Requires+CT10+Regulator+of+Kinase+%28Crk%29+and+Crk-like+%28CrkL%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL).</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hallmarks+of+cancer%3A+the+next+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Mudduluru, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Axl+receptor+tyrosine+kinase+expression+by+miR-34a+and+miR-199a%2Fb+in+solid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by miR-34a and miR-199a/b in solid cancer.</a> Oncogene. 30 (25), 2888-2899 (2011).</li>
<li>Mudduluru, G., Vajkoczy, P., Allgayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+zinc+finger+1+induces+migration%2C+invasion%2C+and+in+vivo+metastasis+through+Axl+gene+expression+in+solid+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Myeloid zinc finger 1 induces migration, invasion, and in vivo metastasis through Axl gene expression in solid cancer.</a> Molecular Cancer Research. 8 (2), 159-169 (2010).</li>
<li>Khalili, A. A., Ahmad, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Review+of+Cell+Adhesion+Studies+for+Biomedical+and+Biological+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).</li>
<li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Tumor+Models%3A+Advantages%2C+Disadvantages%2C+Variables%2C+and+Selecting+the+Right+Platform%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12(2016).</li>
<li>Hamidi, H., Lilja, J., Ivaska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+xCELLigence+RTCA+Instrument+to+Measure+Cell+Adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using xCELLigence RTCA Instrument to Measure Cell Adhesion.</a> Bio Protocols. 7 (24), 2646(2017).</li>
<li>Scrace, S., O'Neill, E., Hammond, E. M., Pires, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+xCELLigence+system+for+real-time+analysis+of+changes+in+cellular+motility+and+adhesion+in+physiological+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Use of the xCELLigence system for real-time analysis of changes in cellular motility and adhesion in physiological conditions.</a> Methods in Molecular Biology. 1046, 295-306 (2013).</li>
<li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crk+Tyrosine+Phosphorylation+Regulates+PDGF-BB-inducible+Src+Activation+and+Breast+Tumorigenicity+and+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Crk Tyrosine Phosphorylation Regulates PDGF-BB-inducible Src Activation and Breast Tumorigenicity and Metastasis.</a> Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).</li>
<li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 81 (12), 3761-3764 (1984).</li>
<li>Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+method+for+detection+of+endothelial+cell+shape+change+in+real+time%3A+assessment+of+endothelial+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function.</a> Proceedings of the National Academy of Sci U.S.A. 89 (17), 7919-7923 (1992).</li>
<li>Collins, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crk+proteins+transduce+FGF+signaling+to+promote+lens+fiber+cell+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Crk proteins transduce FGF signaling to promote lens fiber cell elongation.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Fathers, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crk+adaptor+proteins+act+as+key+signaling+integrators+for+breast+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Crk adaptor proteins act as key signaling integrators for breast tumorigenesis.</a> Breast Cancer Research. 14 (3), 74(2012).</li>
<li>Koptyra, M., Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crk+and+CrkL+are+required+for+cell+transformation+by+v-fos+and+v-ras%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Crk and CrkL are required for cell transformation by v-fos and v-ras.</a> Molecular Carcinogenesis. 55 (1), 97-104 (2016).</li>
<li>Lamorte, L., Royal, I., Naujokas, M., Park, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crk+adapter+proteins+promote+an+epithelial-mesenchymal-like+transition+and+are+required+for+HGF-mediated+cell+spreading+and+breakdown+of+epithelial+adherens+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Crk adapter proteins promote an epithelial-mesenchymal-like transition and are required for HGF-mediated cell spreading and breakdown of epithelial adherens junctions.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (5), 1449-1461 (2002).</li>
<li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+roles+of+Crk+and+CrkL+in+fibroblast+structure+and+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility.</a> Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).</li>
<li>Rodrigues, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CrkI+and+CrkII+function+as+key+signaling+integrators+for+migration+and+invasion+of+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">CrkI and CrkII function as key signaling integrators for migration and invasion of cancer cells.</a> Molecular Cancer Research. 3 (4), 183-194 (2005).</li>
<li>Feller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crk+family+adaptors-signalling+complex+formation+and+biological+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles.</a> Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).</li>
<li>Park, T. J., Boyd, K., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiovascular+and+craniofacial+defects+in+Crk-null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cardiovascular and craniofacial defects in Crk-null mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 26 (16), 6272-6282 (2006).</li>
<li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crk+and+Crk-like+play+essential+overlapping+roles+downstream+of+disabled-1+in+the+Reelin+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway.</a> Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).</li>
<li>Hallock, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dok-7+regulates+neuromuscular+synapse+formation+by+recruiting+Crk+and+Crk-L%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Dok-7 regulates neuromuscular synapse formation by recruiting Crk and Crk-L.</a> Genes & Development. 24 (21), 2451-2461 (2010).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

リアルタイムセル解析システムを使用した細胞移動と浸潤のリアルタイム測定は、単一のタイムポイントでデータを提供する従来の方法よりも、複数の重要な利点を持つ、シンプルで迅速かつ継続的なモニタリングプロセスです。従来の方法と同様に、実験条件は、リアルタイム細胞分析システムの各細胞株に対して最適化する必要があります。侵略的な能力。これらの違いにより、各細胞株は異なる細胞動態および細胞インピーダンスを示し得る。インピーダンスは、ウェルに播種された細胞の数、細胞接着の時間、細胞が移行または侵入し始める前のラグタイム、およびCIMプレート上のECMゲルの濃度によって大きく影響されます。第一に、リアルタイムセル分析は、特定の期間にわたってリアルタイムで結果を提供し、コントロールセルがアクティブな細胞の移動と侵入を示す時間ポイントを特定し、コントロールがいつ制御するかを研究者が特定することを可能にするので、最適化を容易にします細胞は、移動と侵略の最大レベルに達します。第二に、異所性遺伝子過剰発現または遺伝子ノックダウン研究は、細胞が改変された遺伝子接合性変化から表現型を採用する必要があるため、追加の最適化が必要な場合がある。また、有効な薬物濃度および薬剤...

癌は、異なる器官に転移する能力のために致死的な病気である。がん遺伝子型と遺伝子型の決定は、効果的な治療戦略を理解し、設計する上で重要です。数十年にわたるがん研究は、がん遺伝子型と型を決定するさまざまな方法の開発と適応につながっています。最新の技術開発の1つは、細胞インピーダンスに基づく細胞移動と浸潤のリアルタイム測定です。細胞接着は、細胞間通信および組織の調節、開発、維持において重要な役割を果たす。細胞接着の異常は、細胞間接触の喪失、細胞外マトリックス(ECM)の分解、および細胞による遊走および侵入能力の利益を招き、そのすべてが異なる器官11、22に癌細胞の転移に寄与する。細胞の移動(創傷治癒およびボイデンチャンバーアッセイ)および侵略(マトリゲルボイデンチャンバーアッセイ)3、4、54,5を決定するために様々な方法が利用可能である。3これらの従来の方法は、細胞の細胞のタイプを測定する実験の前後に蛍光色素または他の色素で標識する必要があるため、半定量的である。さらに、創傷部位への細胞の移動を測定するための創傷を作成するために機械的破壊が必要な場合がある。さらに、これらの既存の方法は時間がかかり、労力を要し、結果を一度に測定するだけです。さらに、これらの方法は、実験手順6の間に一貫性のない処理のために不正確な測定を行う傾向がある。
従来の方法とは異なり、リアルタイムの細胞分析システムは、細胞のプレステインやポストステイン、機械的損傷を必要とせずに、リアルタイムで細胞インピーダンスを測定します。さらに重要なことは、実験の持続時間を延長して、時間依存的な方法で生物学的効果を決定できることである。実験の実行は時間効率が良く、労働集約的ではありません。データの分析は比較的簡単で正確です。他の方法と比較して、この方法は、細胞の移動と浸潤66、7、8、97,8,9を測定するための最良のリアルタイム測定の1つです。
GiaeverとKeeseは電極10の表面上の細胞集団のインピーダンスベースの測定を最初に記述した。リアルタイムセル解析システムは同じ原理で動作します。各マイクロプレートウェルの面積は、金のマイクロ電極の配列で覆われて約80%です。電極表面積が細胞の付着または広がりによる細胞によって占拠されると、電気インピーダンスが変化する。このインピーダンスは、細胞指数として表示され、これは、微多孔膜に浸透した後の電極表面積を覆う細胞に直接比例する(この膜の中央の細孔サイズは8μmである)11。
CrkおよびCrkLはSH2およびSH3ドメインを含むアダプタタンパク質であり、細胞骨格調節、細胞変容、増殖、接着、上皮間葉移行、移行、侵入、転移などの様々な細胞機能において重要な役割を果たす。1,12,13,14,15,16,17, 18.したがって、がん細胞のCrk/CrkL依存性の移動能力と侵襲性能力を決定することが重要です。リアルタイム細胞解析を行い、CrkおよびCrkLの遺伝子ノックダウン時の神経膠芽腫細胞の回遊性および侵襲能力を決定した。
本論文では、ヒト神経膠芽腫細胞のCrk-およびCrkL媒介性移動および浸潤の詳細な測定について述べている。

<table><tbody><tr><td>バイオセーフティキャビネット</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1300 Series Class II, Type A2</td><td></td></tr><tr><td>CIM plates</td><td>Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc</td><td>5665825001</td><td>細胞浸潤および移動プレート</td></tr><tr><td>Crk siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>J-010503-10</td><td></td></tr><tr><td>CrkL siRNA</td><td>Ambion</td><td>ID: 3522 and ID: 3524</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ修正されたイーグル」細胞</td>培養に使用される<td>ATCC</td><td>302002</td><td>培養培地</td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>21-031-CV</td><td>細胞の洗浄に使用される</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>ハイクロン</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VIOS 160i CO2 インキュベーター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>51030285</td><td>CO2インキュベーター</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Bioscience</td><td>354234</td><td>細胞外マトリックスゲル</td></tr><tr><td>ネオンエレクトロポレーションシステム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>MPK5000</td><td>エレクトロポレーションシステム</td></tr><tr><td>ネオントランスフェクションシステム 10 & micro;L kit</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>MPK1025</td><td>エレクトロポレーションキット</td></tr><tr><td>ノンターゲティング siRNA</td><td>ダルマコン D-001810-01</td><td></td><td>ノンターゲートコントロール用siRNA</td></tr><tr><td>オデッセイ CLx (イメージングシステム)</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td>ウェスタンブロットイメージングシステム</td></tr><tr><td>RTCAソフトウェア</td><td>アジレントテクノロジーズ社</td><td></td> 細胞解析部門 <td>実験</td></tr><tr><td>用機器Scepter</td><td>Millipore</td><td>C85360</td><td>ハンドヘルド自動セルカウンター</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>U-118MG</td><td>ATCC</td><td>ATCC HTB15</td><td>実験に使用した細胞株</td></tr><tr><td>xCELLigence RTCA DP</td><td>380601050</td><td>実験</td>に<td>使用した機器</td></tr></tbody></table>

がん細胞の移動と浸潤のインピーダンスベースリアルタイム測定

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

癌は、遺伝的不安定性、突然変異、および環境および他のストレス要因によって開始された細胞の制御されていない増殖のために生じる。これらの獲得した、複雑な多層分子シグナル伝達ネットワークの異常は、異常な細胞増殖と生存、細胞外マトリックス分解、および遠くの器官への転移を誘発する。癌関連死の約90%は、転移性播種の直接的または間接的な影響によって引き起こされると推定される。そのため、遺伝的・環境的操作を行う際に、がん細胞の挙動を特徴づけるための、信頼性の高い総合的なシステムを確立することが重要です。このようなシステムは、癌転移の分子調節と階層化された、正確な治療戦略の開発を成功させる機会を明確に理解することができる。したがって、遺伝子の機能の利得または喪失を伴う移動や侵入などの癌細胞行動の正確な決定は、癌細胞の積極的な性質の評価を可能にする。細胞インピーダンスに基づくリアルタイム測定システムにより、実験全体で継続的にデータを取得し、様々な実験条件下で結果を即座に比較して定量化することができます。従来の方法とは異なり、この方法は、移動または侵入する細胞を分析するために固定、染色、およびサンプル処理を必要としません。本論文では、神経膠芽腫癌細胞の移動と浸潤をリアルタイムに決定するための詳細な手順を強調する。

CrkおよびCrkLは、異なる癌細胞株13,17,17における細胞の移動および浸潤にとって重要であると示唆されている。CrkとCrkLタンパク質は構造的にも機能的にも互いに類似しており、本質的な重なり合う機能16、19、20、21を果たしますが19,20,2116、CrkとCrkLの多くの遺伝子ノックダウン研究は、ノックダウンがCrk、CrkL、またはその両方に特異的であるかどうか明確に対処していません。したがって、2つのタンパク質のうち、細胞の移動および浸潤に寄与するタンパク質は不明である。原理実証研究として、CrkまたはCrkLに特異的なsiRNAを用いて、U-118MG GBM細胞株の移動および浸潤に及ぼす影響を研究した。Crkのノックダウンは、CrkLタンパク...

癌は、異なる器官に転移する能力のために致死的な病気である。様々な治療条件下で癌細胞が移行し、侵入する能力を決定することは、治療戦略を評価する上で極めて重要である。このプロトコルは、神経膠芽腫癌細胞株のリアルタイム転移能力を評価する方法を提示する。

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

このプロトコルを使用すると、リアルタイム条件下で細胞移動と侵入を明らかにすることができ、遺伝子機能および薬物の喪失または利益の下で細胞の運動学を決定することができます。他の方法とは異なり、染色、機械的細胞損傷、または蛍光マーカーは必要ありません。最も重要なことは、リアルタイム細胞動態は有効な方法で決定することができる。U-118MG細胞株培養が70〜80%合流に達したら、細胞を0.5%トリプシン-EDTAの2ミリリットルで処理する前にPBSで細胞を洗浄してください。30秒後摂氏37度、10ミリリットルの新鮮な培養培地で反応を停止し、剥離した細胞を15ミリリットルの円錐管に移します。カウント後、遠心分離により細胞を回収し、ペレットを10回から5番目の細胞濃度で適切な量の新鮮な培地で再懸濁する。条件ごとに5番目の細胞に6回10回を1マイクロ遠心分離チューブに移し、各チューブにDulbeccoのPBSの800マイクロリットルを追加します。遠心分離後、各ペレットを60マイクロリットルの再懸濁バッファーRおよび6マイクロモルの目的のsiRNAで再懸濁する。各細胞懸濁液の10マイクロリットルのアリコートを3つの10ミリ秒1、350ボルトパルスで電解する前に、各チューブを穏やかなタッピングと混ぜます。各処理後、各条件から電気泳動細胞を新鮮な培養培地の個々の5ミリリットルのアリコートにプールする。その後、条件ごとに2つの35ミリメートル培養皿に細胞を播種し、細胞培養器に3日間置きます。リアルタイム細胞分析の5~6時間前に、リアルタイムの細胞分析システムを細胞培養インキュベーターに入れる。侵入アッセイを設定するには、逆ピペット処理を使用して、細胞外マトリックスゲルの1ミリリットル当たり0.1マイクログラムを補ったDMEMの50マイクロリットルを、細胞浸潤板の上部チャンバーの各ウェルに入れます。めっきの直後に、各ウェルから細胞外マトリックス溶液の30マイクロリットルを取り除き、プレートを細胞培養インキュベーターに4時間置きます。インピーダンス測定プログラムをセットアップするには、測定の6時間前に、すべての電気泳動細胞培養液中の培地を低血清培地に交換する。関連するインピーダンス測定ソフトウェアの[レイアウト]タブで、各生物学的条件に対して4倍のウェルを選択します。[スケジュール]タブで、1 分間間隔で 1 回のベースライン測定スイープ ステップを設定し、2 番目のステップを設定して、実際の実験の個々のクレードルのセルインピーダンスを測定します。細胞インピーダンス測定開始の1時間前に、細胞浸潤および移動板の下の部屋のウェルに10%の牛血清を補充した培地の160マイクロリットルを化学誘引剤として加える。浸潤を測定するために、細胞外マトリックスゲル被覆ウェルを含む上部チャンバを組み立てる。移動を測定するには、上部チャンバーでコーティングされていない井戸を使用してください。いずれのタイプの実験でも、上部チャンバーの井戸を低血清培地50マイクロリットルで満たし、チャンバーをシステムのクレードルに入れます。ソフトウェアの「メッセージ」タブをクリックして、すべてのウェルが制御装置によって認識されているかどうかを確認します。メッセージが期待どおりに表示される場合は、クレードル内のプレートが実験の準備が整います。その後、完全にパックしたプレートをリアルタイムの細胞分析システムのクレードルの細胞培養インキュベーターに1時間置き、プレートを細胞培養条件に順応させます。プレートが平衡している間に、実証したように神経膠芽腫細胞を収穫し、低血清培地濃度の800マイクロリットル当たり8倍の10倍から5番目の細胞で各条件から細胞を再懸濁する。さらに、下流のウェスタンブロット分析のために35ミリメートル皿に播種するための培養培地の2ミリリットルの5番目の細胞に3回10〜5番目の細胞を取っておきます。ベースラインの移行前の読み取り値を測定するには、順応の最後に、クレードルの [Start] ボタンをクリックします。ベースライン測定が取得された後、それぞれの揺りかごからバイオセーフティキャビネットに移動および侵入プレートを移します。逆ピペット100マイクロリットルの細胞は、クレードルの制御ユニットにプログラムされた細胞の浸潤および移動プレートの適切な井戸内の各生物学的状態の上のチャンバーウェルを4倍にする。播種後、プレートをバイオセーフティキャビネットに室温で30分間保管し、プレートをそれぞれのクレードルに移す前に、細胞がプレート底に均等に落ち着くようにします。クレードルの[開始]ボタンをクリックして、セルインピーダンスの測定を開始します。実験の完了中または完了後に時間依存的にセルインデックスとしてのセルインピーダンスの変化を視覚化するには、[データ分析]タブを開きます。それぞれの条件のデータを個別に、または平均または標準偏差として視覚化するには、平均および標準偏差のオプションボックスをクリックします。セルインデックスデータをスプレッドシートファイルにエクスポートするには、データ分析ウィンドウの中央にカーソルを置き、右クリックします。表示されるダイアログボックスで、[データをリスト形式にコピー]オプションを選択し、開いているスプレッドシートにデータを貼り付けます。実験をリリースするには、各クレードルのリリースボタンをクリックします。Crkアダプタータンパク質のノックダウンは、Crk様タンパク質レベルを誘導することなく、Crk1およびCrk2タンパク質レベルをそれぞれ85%および86%減少させます。Crk様のノックダウンは、Crk1およびCrk2タンパク質レベルのわずかな低下でCrk様タンパク質発現を85%減少させます。両方のsiRNAを組み合わせることで、Crk1、Crk2、Crk様発現が80%以上減少し、ビンクリンとアルファ-チューブリンの発現はCrkまたはCrk様のノックダウンの組み合わせの影響を受けません。ヒト脳神経膠芽腫細胞は、高い血清濃度に応答して勾配に沿って移動し、13時間で最大の移動レベルに達する。Crkノックダウン細胞では、最初は移行が遅れているが、細胞は23時間まで移行を続けた。Crk様のノックダウンは、CrkとCrk様の両方のノックダウン時に神経膠芽腫細胞株が完全に移動能力を失い、CrkとCrk様が癌細胞の移動に不可欠な重複する役割を果たしていることを示唆する細胞移動を実質的に減少させる。しかし、細胞の浸潤が数日間にわたって監視されると、Crkノックダウン細胞は、Crk様細胞が侵襲的能力を部分的に回復し、40時間後に侵襲能力を低下させることを示す二重Crk-Crk細胞を用いて60時間で神経膠芽腫細胞を制御するのと比較して、同様の最大レベルの細胞浸潤に達する。この結果は、細胞の浸潤を実験の全期間にわたって分析すべきであるという提案を明確に裏付けている。細胞の適切な数を播種し、浸潤アッセイおよび播種細胞のための細胞外マトリックスを記録しながら気泡を避けることは、この実験の成功のための重要なポイントです。同様の手順に従ってeプレートを用いて、細胞接着および細胞増殖動態を決定することができる。

impedance-based-real-time-measurement-cancer-cell-migration

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

癌細胞による内皮細胞単層の侵入を測定するリアルタイム電気インピーダンス基づく手法

このビデオでは、電気インピーダンスに基づく3チャンバーアレイを使用した侵入アッセイについて説明しています。この技術は、腫瘍微小環境において常在する間質細胞によって分泌される可溶性因子の影響下で、がん細胞の浸潤性を測定する。...

Three-Chambered Array-Based Impedance Assay:電気インピーダンスを測定することにより、がん細胞の浸潤性を評価するリアルタイム解析技術

出典:Mudduluru, G., et.al. インピーダンスに基づくがん細胞の移動と浸潤のリアルタイム測定。J. Vis. Exp.

脳腫瘍細胞浸潤のインピーダンスに基づく測定

一般的に使用される、 インビトロで細胞遊走および浸潤を調べるための高度にアクセス可能な方法が記載されている。第一の方法は、細胞運動性を測定する細胞創傷閉鎖アッセイである。第二の方法は、走化性、細胞の浸潤能を評価するトランスウェル遊走および浸潤アッセイである。...

インビトロでの細胞遊走および浸潤アッセイにおける

このプロトコルは、電気細胞 - 基質インピーダンスセンシング、細胞の付着、増殖、運動性、および薬理学的および毒性刺激に対する細胞応答の定量化のための接着細胞のインピーダンススペクトルを記録し、分析する方法を検討します。内皮透過性および細胞 - 細胞および細胞 - 基質接点の評価の検出が強調される。...

内皮増殖、バリアー機能、運動性の定量のための電気細胞 - 基質インピーダンスセンシング

腹膜の中皮ライニングに卵巣癌細胞の浸潤は、時間とともに動的なプロセスである。実時間分析器を利用して、回転楕円体、中皮細胞の共培養モデルにおける卵巣癌細胞の浸潤能は、転移のプロセスを調節する因子への洞察を提供し、長期の期間にわたって定量化することができる。...

リアルタイムで中皮細胞の卵巣癌スフェロイドアタッチメントおよび浸潤の評価

HMCA ベースのイメージング プレートは、浸潤アッセイ パフォーマンスが提示されます。このプレートは、三次元 (3 D) 腫瘍スフェロイドの形成と細胞外マトリックス (ECM)...

がん細胞の浸潤と転移防止薬剤のスクリーニングのハイドロゲル マイクロチャンバー アレイを用いた (HMCA) の解析-ベース プレート

現在のプロトコルでは、がん細胞の遊走とリアルタイムで単一のプラットフォームに侵略を調査、細胞の移動と形態の勉強を簡単に再現できると時間効率の良いオプションを提供する統合的な手法について説明します。...

自動生細胞固体撮像素子を使用して単純な移行/侵略ワークフロー

侵襲的な細胞亜集団をリアルタイムで検出して捕捉するアプローチについて説明します。実験計画では、セルの電気インピーダンスの変化を監視することによってリアルタイムセルラー解析を使用しています。浸潤性癌、免疫、内皮または間質細胞を複雑な組織に捕捉することができ、共培養の影響を評価することができる。...

共培養からの侵襲的細胞亜集団のリアルタイム検出と捕捉

多くのアップレギュレーションされた遺伝子は、腫瘍細胞の遊走と浸潤を刺激し、予後不良につながります。どの遺伝子が腫瘍細胞の遊走と浸潤を制御しているかを決定することは非常に重要です。このプロトコルは腫瘍のセルの移動そして侵入に対する遺伝子の高められた表現の効果をリアルタイムで調査するための方法を示す。...

合成mRNAトランスフェクション後の腫瘍細胞の遊走および浸潤のリアルタイム定量測定(英語)

ここでは、インピーダンスベースのバイオセンサーであるECISとcellZscopeを使用して、脳内皮バリア強度を測定する手法を示します。脳内皮の in vitro...

がん細胞とサイトカインに応答した2つのインピーダンスベースバイオセンサーによる脳内皮バリア完全性の変化の測定

学ぶインピーダンスベースのリアルタイム測定法により、U-118MG神経膠芽腫細胞の移動と浸潤を無染色で評価する。遺伝子機能や薬剤処理の影響を動的に解析し、がん転移メカニズムの理解に貢献する。

がん細胞の移動と浸潤のインピーダンスベースリアルタイム測定

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