Name: 神経膠芽腫の3次元スフェロイドモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 学ぶ、神経膠芽腫幹細胞を用いた3次元スフェロイドベースの浸潤アッセイ法。Fijiマクロによる定量化で、腫瘍の浸潤・移動・増殖を解析し、in vivo環境を再現した薬剤評価に活用できます。

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この作品は、トランスカン2017、ARC 2017、リーグ・コントル・ル・ガン(コミテ・ド・ラ・ジロンド・エ・ド・ラ・シャラント・マリタイム)によってサポートされました。ジョリス・ギヨンはトゥールーズ大学病院(CHUトゥールーズ)からフェローシップを受けています。

インフォームド・コンセントは、すべての患者(地元の倫理委員会の規則に従ってノルウェーのベルゲンのハウケランド病院から)から得られました。当社の議定書は、当社の機関の人間研究倫理委員会のガイドラインに従っています。
1. 均一なサイズの腫瘍スフェロイドの生成
注:ステム様細胞は、前の記事12に記載されているように、B27サプリメント、ヘパリン、FGF-2、ペニシリン、およびストレプトマイシンを補完する神経基底培地で培養される。これらの細胞は、培養中に自発的にスフェロイドを形成する。
<ol><li>5 mL リン酸緩衝塩基食 (PBS) で腫瘍細胞を洗浄し、37 °C で 5 分間 0.5-1 mL 解離酵素 (材料表を参照) で細胞をインキュベートします。</li>
	<li>4-4.5 mL PBSで洗浄し、完全な成長培地(完全な神経基底培地、cNBM)の10 mLを追加します。</li>
	<li>トリパンブルーとセルカウントチャンバースライドを使用して自動カウント技術を使用してセルをカウントします。</li>
	<li>104個のセルを含む100個のスフェロイドを生成するには(好ましいサイズに従って)、2%メチルセルロースの2mLでNBMの8 mLに106細胞を混合する。</li>
	<li>サスペンションを無菌システムコンテナに移し、マルチチャンネルピペットで100 μL/wellを96ウェルラウンドボトムプレートに分配します。</li>
	<li>プレートを37°C、5%CO2、湿度95%でインキュベートします。2等しいサイズの回転楕円体が形成され、3〜4日後に使用することができます。</li>
</ol>2. 三次元実験
<ol><li>増殖<ol>
<li>準備<ol>
<li>懸濁剤(例えば、図4AAのようにロテノン)および化学物質を100μLの培地に加え、各ウェル内の培地の100μL(すなわち、ウェルあたり1つのスフェロイド)に加える。</li>
			<li>プレートを37°C、5%CO2、湿度95%でインキュベートします。2</li>
		</ol>
</li>
		<li>画像の取得と解析<ol>
<li>明視野でビデオ顕微鏡で写真を撮って、T0で一連の条件を作成し、次の時間を予想します。</li>
			<li>手動または半自動で画像を分析するには、フィジーを使用します。手動で行うには、フリーハンド選択ツールで回転楕円コアの周りに円を描き、各回転楕円体の面積を測定します。半自動化された方法で画像を分析するには、補足文書 1に示されているマクロを //Core 領域のみで使用します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>侵略<ol>
<li>準備<ol>
<li>1 mg/mL最終濃度のI型コラーゲン、1x PBS、0.023xVコラーゲン、1M水酸化ナトリウム、滅菌H2O.30分間氷上で溶液をインキュベートして、氷の上のチューブにコラーゲンマトリックスを準備します。</li>
			<li>500 μL チューブの丸底ウェルプレートからスフェロイドを回収し、200 μL 1x PBS で 2x を洗浄します。</li>
			<li>スピペットは、通常の96ウェルプレートのウェルの中央に慎重に100 μLのコラーゲンマトリックスの100 μLにスプヘロイドを挿入します。</li>
			<li>コラーゲンゲルを37°Cで30分間インキュベートし、ゲルの上にcNBMを加えます。阻害剤または活性化剤(例えば、図4B、4Cに示すような塩化水素)は、この工程で培地に添加することができる。</li>
		</ol>
</li>
		<li>画像の取得と解析<ol>
<li>コラーゲンを含み込んだ後、明視野モード24時間でビデオ顕微鏡で連続して写真を撮る。</li>
			<li>手動または半自動で画像を分析するには、フィジーを使用します。手動で行うには、フリーハンド選択ツールで回転楕円体のコアと総面積を中心に描画し、コア領域を持つ総面積を減算して各スフェロイドの侵襲領域を測定します。半自動化された方法で画像を分析するには、補足文書 1に示されているマクロを使用して、侵襲的領域を判別します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>移行<ol>
<li>準備<ol>
<li>6ウェルプレートにマトリゲル(0.2 mg/mL)を37°Cで30分間NBMに塗り、マトリゲルを取り除き、2 mLのcNBMを加えます。</li>
			<li>スフェロイドを丸底ウェルプレートから6ウェルプレートに50 μLのcNBMに移します。</li>
			<li>プレートを37°Cでインキュベートし、スフェロイドが付着するまで30分待ちます。</li>
			<li>24時間のインキュベーションの後、10 ng/mLのHoechstで染色し、37°Cで30分インキュベートする。</li>
		</ol>
</li>
		<li>画像の取得と解析<ol>
<li>明視野のビデオ顕微鏡を使用して画像を取得します。405 nmレーザーは、Hoechst染色の可視化に使用されます。</li>
			<li>フィジーのソフトウェアを使用して画像を分析し、補足文書 1に示すようにマクロを実行します。 注:ウェルの底部に触れたり、上澄み物を完全に取り除いたりすると、回転楕円体に損傷を与えます。コラーゲンタイプIゲル処理の場合、コラーゲン重合を避けるためにゲルを氷上に保ち、pHの変化がゲルのコンパクトさに影響を与えるので酸性成分を添加せず、ピペット細胞をコラーゲンに急速に加えて細胞死やゲルの分解を防ぎます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. フィジーマクロ
注:フィジーは、画像解析を高速化するマクロの開発を可能にするパブリックドメインで開発された画像分析プログラムです。手動分析も可能ですが、これは遅いプロセスであり、バイアスを引き起こす可能性があります。イメージはソフトウェアのドラッグアンドドロップでインポートし、ROIマネージャーツールプラグインで定量化することができます。この研究で使用される手順は、以下のとおりです。
<ol><li>マクロウィンドウを開く:プラグイン |マクロ |インタラクティブインタプリタ.</li>
	<li>次の紫色のループをコピーして貼り付けます。紫色の文章を保持し、関心のある緑色の文を追加します (補足文書 1)。</li>
	<li>シリーズ全体を分析するには、特定の定量化に合わせてパラメータを赤色で調整し、マクロ|マクロを実行するか、Ctrl キーを押しながら Rキーを押します。</li>
	<li>必要に応じて、対象領域 (ROI) を手動で調整します。</li>
</ol>4. スフェロイドの電子顕微鏡
注:次の手順のほとんどは、化学フードで行う必要があります。
<ol><li>固定ステップ<ol>
<li>切り取ったピペットチップでスフェロイドを回収し、1.5mLチューブに入れ、0.1Mリン酸緩衝液(PB)で1倍洗います。</li>
		<li>スフェロイドを2%グルタルアルデヒド/2%パラホルムアルデヒド(PFA)で4°Cで一晩0.1M PBで固定します。</li>
		<li>0.1 M PBの1%PFAの溶液に置換し、次にサンプル調製物を置き換えます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>サンプル準備<ol>
<li>ストレーナーにスフェロイドを移し、スフェロイドの損傷を避けるためにガラスビーカーに入れます。</li>
		<li>0.1 M PBで3倍丁寧に洗います。</li>
		<li>暗闇の中でオスミウムを2時間インキュベートする。1%0.1 M PBの緩衝液の4%にオスミウムを希釈する。</li>
		<li>0.1 M PBで3倍丁寧に洗います。<ol>
<li>脱水乾燥:50%エタノールを10分間、70%エタノールで10分間、2x90%エタノールで15分間、2x100%エタノール20分間、2xアセトンを30分間に浸します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>アセトン/樹脂の混合物を50/50で2時間インキュベートします。このステップの間に、EPON樹脂を準備する(埋め込み-812:11.25グラム;DDSA: 9 g;NMA: 4.5 g)。</li>
		<li>アセトン/樹脂混合物を捨て、作りたての樹脂に交換し、一晩インキュベートします。</li>
		<li>樹脂を新しいものに交換し、2~6時間の間にインキュベートします。</li>
		<li>樹脂中のスフェロイドを60°Cの金型に48-72時間加えます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Pelissier, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+dysfunction+in+mechanotransduction+impairs+differentiation+of+human+mammary+epithelial+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Age-related dysfunction in mechanotransduction impairs differentiation of human mammary epithelial progenitors.</a> Cell Reports. 7, 1926-1939 (2014).</li>
<li>Ishiguro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-derived+spheroids%3A+Relevance+to+cancer+stem+cells+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Tumor-derived spheroids: Relevance to cancer stem cells and clinical applications.</a> Cancer Science. 108, 283-289 (2017).</li>
<li>Sutherland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+environment+interactions+in+tumor+microregions%3A+the+multicell+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicell spheroid model.</a> Science. 240, 177-184 (1988).</li>
<li>Desoize, B., Jardillier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+resistance%3A+a+paradigm+for+clinical+resistance%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oncology%2FHematology%22%5BJournal%5D)">Multicellular resistance: a paradigm for clinical resistance?</a> Critical Reviews in Oncology/Hematology. 36, 193-207 (2000).</li>
<li>Corbet, C., Feron, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+acidosis%3A+from+the+passenger+to+the+driver%27s+seat%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour acidosis: from the passenger to the driver's seat.</a> Nature Reviews Cancer. 17, 577-593 (2017).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+an+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148, 3-15 (2010).</li>
<li>Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cancer+Cell+Spheroid+Assay+to+Assess+Invasion+in+a+3D+Setting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Cancer Cell Spheroid Assay to Assess Invasion in a 3D Setting.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53409(2015).</li>
<li>Cavaco, A. C. M., Eble, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+Spheroid+Model+as+a+More+Physiological+System+for+Cancer-Associated+Fibroblasts+Differentiation+and+Invasion+In+Vitro+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (150), e60122(2019).</li>
<li>Boye, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+CXCR3%2FLRP1+cross-talk+in+the+invasion+of+primary+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors.</a> Nature Communications. 8, 1571(2017).</li>
<li>Dejeans, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autocrine+control+of+glioma+cells+adhesion+and+migration+through+IRE1alpha-mediated+cleavage+of+SPARC+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Autocrine control of glioma cells adhesion and migration through IRE1alpha-mediated cleavage of SPARC mRNA.</a> Journal of Cell Science. 125, 4278-4287 (2012).</li>
<li>Golembieski, W. A., Ge, S., Nelson, K., Mikkelsen, T., Rempel, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+SPARC+expression+promotes+U87+glioblastoma+invasion+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Increased SPARC expression promotes U87 glioblastoma invasion in vitro.</a> International Journal of Developmental Neuroscience. 17, 463-472 (1999).</li>
<li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+complex+role+of+thrombospondin-1+in+glioblastoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development.</a> Nature Communications. 10, 1146(2019).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tube+travel%3A+the+role+of+proteases+in+individual+and+collective+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Tube travel: the role of proteases in individual and collective cancer cell invasion.</a> Cancer Research. 68, 7247-7249 (2008).</li>
<li>Das, A., Monteiro, M., Barai, A., Kumar, S., Sen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMP+proteolytic+activity+regulates+cancer+invasiveness+by+modulating+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">MMP proteolytic activity regulates cancer invasiveness by modulating integrins.</a> Scientific Reports. 7, 14219(2017).</li>
<li>Schaeffer, D., Somarelli, J. A., Hanna, G., Palmer, G. M., Garcia-Blanco, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+migration+and+invasion+uncoupled%3A+increased+migration+is+not+an+inexorable+consequence+of+epithelial-to-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular migration and invasion uncoupled: increased migration is not an inexorable consequence of epithelial-to-mesenchymal transition.</a> Molecular and Cellular Biology. 34, 3486-3499 (2014).</li>
<li>de Gooijer, M. C., Guillen Navarro, M., Bernards, R., Wurdinger, T., van Tellingen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Experimenter%27s+Guide+to+Glioblastoma+Invasion+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">An Experimenter's Guide to Glioblastoma Invasion Pathways.</a> Trends in Molecular Medicine. 24, 763-780 (2018).</li>
<li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+invasive+proteome+of+glioblastoma+revealed+by+laser-capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology+Advances%22%5BJournal%5D)">The invasive proteome of glioblastoma revealed by laser-capture microdissection.</a> Neuro-Oncology Advances. 1 (1), vdz029(2019).</li>
</ol>

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

腫瘍スフェロイドアッセイは、増殖、浸潤、および移動、ならびに細胞死および薬物応答を含む腫瘍特性を研究するのに適している。癌細胞は、図4B,Cに見られるように、侵襲的な微小腫瘍を形成する3Dマトリックスに侵入する。侵襲的プロセス中、マトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)は、腫瘍細胞13を取り囲むマトリックスを消化し、MMP阻害剤(例えば、GM6001またはレビマスタット)は細胞浸潤を損なうが、移行しない14。移動と侵入は、重複するが、別々の分子事象15を伴い、これは我々のスフェロイドアッセイで研究することができる。これを行うには、特定のシグナル経路を遺伝的レベルまたは薬理学的阻害を介して標的とすることができる。
神経膠芽腫は、さまざまなプロセスによって周囲の組織を広範囲に侵襲することが知られている(例えば、共オプション、白質管の侵入、間質侵襲<s...

一次または市販の細胞株を用いたほとんどの研究では、単層培養物としてプラスチック表面上で増殖した細胞に対してアッセイが行われる。2Dで細胞培養を管理することは、生体内3D細胞環境を模倣しないため、欠点を表します。2D培養では、細胞表面全体が培地に直接接触し、細胞の成長を変化させ、薬物の入手可能性を改変する。さらに、非生理学的プラスチック表面は細胞分化をトリガする1。これらの困難を克服するために三次元の文化モデルが開発されました。彼らは腫瘍2の多細胞アーキテクチャと異質性を模倣するという利点を有し、したがって、固形腫瘍3のより関連性の高いモデルであると考えることができる。スフェロイドの複雑な形態は、薬物浸透および耐性をより良く評価するのに寄与する。スフェロイドにおける腫瘍不均一性は、酸素および栄養素の拡散に影響を及ぼし、薬理学的薬剤に対する応答を示す(図1A)。スフェロイドサイズが300μmに達すると酸素の拡散が変化し、スフェロイドの中心に低酸素環境を誘導する(図1A、C)。代謝産物はまた、細胞層を通して浸透が少なく、代謝反応を補償する5が起こる。スフェロイドの直径が大きくなると、壊死コアが観察され、積極的な脳癌神経膠芽腫(GBM)6を含む多くの固形癌に見られる更なる模倣6特性が観察される。
神経膠芽腫に関するいくつかの2Dまたは3Dの浸潤アッセイが文献77,88で報告されている。二次元アッセイは、主に薄いマトリックス層の水平面またはボイデンチャンバーアッセイ9での侵略を研究するためのものである。三次元アッセイは、古典的な神経膠芽腫細胞株10を用いた3Dスフェロイド培養液で記載されている。より複雑な変異体は、対立培養11における腫瘍スフェロイドによる脳オルガノイドの侵入によって表される。しかし、どんな研究室でも使いやすく再現可能なアッセイを開発することは、依然として重要です。我々は、患者のサンプルから神経膠芽腫幹細胞を生成するプロトコルを開発した。これらのアッセイの定量化は容易に管理可能であり、オープンアクセスオンラインソフトウェアだけを必要とする。簡単に言えば、腫瘍片を小さく切り、酵素的に消化する。消化から誘導される単一細胞は、神経基底培地で培養される。4〜7日後、スフェロイド構造は自発的に形成される。マウスモデルで頭蓋内移植を行う際に、擬似接触形成細胞12に囲まれた壊死コアを示す腫瘍を形成する。これは、GBM患者に見られる特性によく似ています。
この記事では、再現性を確保するために、特定の数のセルからスフェロイドを生成するプロトコルについて説明します。この目的には、マトリゲルとコラーゲンタイプI.Matrigelが増殖因子に富み、細胞の取り付けと移動に必要な哺乳類の基底膜を模倣する2つの相補行列を使用できます。一方、間質の構造要素であるコラーゲンタイプIは、最も一般的な線維体細胞外マトリックスであり、細胞浸潤アッセイに使用されています。本明細書において、我々は、移行および増殖アッセイを行うことにより、我々のGBMスフェロイドモデルを説明する。解析は、固定された時点だけでなく、ライブイメージングによるスフェロイド膨張と細胞の動きを監視することによっても行った。さらに、電子顕微鏡検査を行い、形態学的詳細を可視化した。

<table><tbody><tr><td>96ウェル丸底プレート</td><td>ファルコン</td><td>08-772-212</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Gibco</td><td>A11105-01</td><td>4 &deg;C、球体解離酵素</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587</td><td>-20°Cで保存。C、使用前に解凍</td></tr><tr><td>基本的な線維芽細胞成長因子</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>-20 °Cで保存;C、使用前に解凍</td></tr><tr><td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 10X</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-53-500</td><td>4 °C;C</td></tr><tr><td>フィジーのソフトウェア</td><td>ImageJ</td><td></td><td>写真の分析に使用</td></tr><tr><td>Flask 75 cm2</td><td>Falcon</td><td>10497302</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>-20 &deg;C、冷冷NBM</td></tr><tr><td>メチルセルロース</td><td>Sigma</td><td>M0512</td>で最終濃度0.2mg / mLに希釈 <td>NBMで希釈して最終濃度2%に</td></tr><tr><td>NBM</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td> 4°C<td>で保存;C</td></tr><tr><td>神経基礎培地</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>4 °C で保存;C</td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>4°Cで保存;C</td></tr><tr><td>トリパンブルー 0.4%</td><td>サーモフィッシャー</td><td>T10282</td><td>細胞計数に使用</td></tr><tr><td>I型コラーゲン</td><td>コーニング</td><td>354236</td><td>4°C;ハ</td></tr></tbody></table>

神経膠芽腫の3次元スフェロイドモデル

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

二次元(2D)細胞培養は生体内腫瘍増殖を良好に模倣しない。そこで、3次元(3D)培養スフェロイドモデルが開発された。これらのモデルは、神経腫瘍学の分野で特に重要である可能性があります。確かに、脳腫瘍は健康な脳環境に侵入する傾向があります。我々は、腫瘍の浸潤を研究するために開発した理想的な3D神経膠芽腫スフェロイドベースのアッセイをここに記載する。このアッセイを成功させるために、技術的な詳細と分析ツールをすべて提供しています。

スフェロイドはプロトコルセクションに記載されているように調製し、移行、浸潤、増殖、顕微鏡観察に関する観察を行った。球状構造の異なる領域における低酸素症を測定するために、低酸素活性を決定するためにカルボキシ性無水酵素IX染色を用いた(図1A-C)。スフェロイド中心では、より多くのCAIX陽性細胞が観察された(図1A-C)。スフェロイドコアに位置する低酸素細胞は、周囲の細胞よりも解糖性が高い傾向がある。ミトコンドリアは、電子顕微鏡で示すように、さらなる分析のために画像化することができます(図1Ba-1Bb)。2.5 x 103、5x 10 3、104、または2 x 104細胞から構成されるスフェロイドは、それぞれ約350、400、500、または650μmの...

ここでは、神経膠芽腫に対する使いやすい侵入アッセイについて述べています。このアッセイは、神経膠芽腫幹細胞に適しています。侵略、移動、および拡散を容易に定量化するためのフィジーのマクロも説明されています。

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...

二次元細胞培養は、生体内腫瘍の増殖を十分に模倣しない。改善のために、3D手順は、回転楕円体を用いて開発されています。当社の3D神経膠芽腫スフェロイドベースアッセイは、健康な脳腫瘍環境への脳腫瘍浸潤を調査するのに特に適しています。三次元培養モデルは、多細胞アーキテクチャ、異種性および腫瘍の代謝状態を再現するために使用することができ、薬物効果のより厳格な評価を可能にする。ウェルの底に触れたり、上澄み物を完全に取り除いたり、ゲルを氷の上に保ち、細胞をゲルに素早く加えたりしないでください。均一な大きさの腫瘍スフェロイドを生成するには、まず5ミリリットルのPBSで目的の腫瘍細胞培養物を洗浄し、解離酵素の0.5〜1ミリリットルで細胞を治療する。摂氏37度で5分後、PBSの4〜4.5ミリリットルで反応を停止し、完全な成長培地の10ミリリットルを含む15ミリリットルの円錐管に取り外した細胞を移す。カウント後、2%メチルセルロース濃度の2ミリリットルを添加した完全な増殖培地の8ミリリットル当たり6番目の細胞に1回10〜6番目の細胞で細胞を再懸濁し、無菌系容器に懸濁液を移す。その後、96ウェル丸底板の各ウェルに100マイクロリットルの細胞を加え、3〜4日間37°C5%の二酸化炭素インキュベーターにプレートを置きます。浸潤アッセイを行うために、腫瘍細胞が均一なサイズのスフェロイドを形成した場合、各細胞構造を500マイクロリットルチューブに移し、200マイクロリットルのPBSでスフェロイドを1回洗浄する。2回目の洗浄後、スフェロイドを作りたてのコラーゲンマトリックス100マイクロリットルに慎重に移し、各スフェロイド懸濁液を平底96ウェルプレートの各ウェルの中央に加えます。摂氏37度で30分のインキュベーションを行った後、各ウェルのゲルの上に100マイクロリットルの完全な成長培地を加えます。腫瘍細胞の浸潤の最良の画像化のために、各ウェルの中心にすべてのスフェロイドを配置してください。移行アッセイを行うために、腫瘍細胞が均一なサイズのスフェロイドを形成した場合、6ウェルプレートにマトリゲル1ミリリットル当たり0.2ミリグラムを37°Cで30分間コーティングする。インキュベーションの終わりに、 Matrigel を取り除き、完全な成長培地を 2 ミリリットルずつ各ウェルに加えます。丸底板から50マイクロリットルのボリュームのスフェロイドを6ウェルプレートの個々のウェルに移し、プレートを細胞培養インキュベーターに24時間入れます。翌日、ヘヒストのミリリットル当たり10ナノグラムで37°Cで30分間スフェロイドを染色します。侵入または移行アッセイ後の画像取得のために、ビデオカメラを搭載したブライトフィールド共焦点顕微鏡のステージにプレートを置き、適切な実験期間にわたって画像を取得します。半自動化された方法で画像を分析するには、フィジーに画像をインポートし、プラグイン、マクロ、インタラクティブインタプリタをクリックします。適合した紫色のループをコピーして貼り付けます。紫色の文を保持し、必要に応じて、関心のある緑色の文を追加します。次に、各回転楕円体の面積を測定するには、[解析と測定] をクリックします。球面構造の異なる領域における低酸素症を測定するために、炭酸脱水酵素IX染色は、低酸素活性を決定するために使用することができる。本代表分析では、より多くの炭酸脱水酵素IX陽性細胞がスフェロイド中心において観察された。スフェロイドコアに位置する低酸素細胞は、コアを取り巻く細胞よりも解糖性が高い傾向がある。ミトコンドリアは、さらなる分析のために電子顕微鏡で画像化することができます。スフェロイド径は、3D細胞構造を構成する細胞の密度に直接相関しており、フィジーマクロは、各スフェロイド内の細胞の増殖、浸潤または移動または各スフェロイド内の細胞の移動を定量化するために使用することができる。スフェロイドコアの増加は、細胞増殖の刺激を反映する。ミトコンドリア呼吸鎖の複合体Iの阻害に際して、ミトコンドリアにおけるATP産生の大半は、72時間後に増殖を20%減少させる妥協される。塩化水素処理は、24時間にわたってコラーゲンタイプIの浸潤を高めるが、未処理のスフェロイドを制御するのと比較して、回転楕円体の回遊面積を1.5倍に減少させる。ライブイメージングによって評価されるように、スフェロイドは高い内部ダイナミクスを示し、迅速に移動します。スフェロイドのサイズは比較的均一で、最良のイメージング結果を得るためには、ウェルの中心まで回転楕円体を操作するように注意する必要があります。この方法は、腫瘍細胞増殖、遊行および死の解析、細胞外マトリックス、細胞受容体または細胞内タンパク質の発現を調べる場合にも使用できます。スフェロイドはまたカプセル化され、また、細胞表面張力の増加の効果は、カプセルの除去時に調べることができる。

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

このビデオは、脳腫瘍に由来する神経膠腫球が単一細胞に分離され、ヒアルロン酸ベースのハイドロゲルにカプセル化される様子を示しています。このプロセスにより、細胞間相互作用が促進され、構造化された三次元神経膠芽腫モデルが形成されます。...

膠芽腫細胞の3次元培養のためのヒアルロン酸ベースのハイドロゲル

出典:Guyon, J., et al.膠芽腫の3Dスフェロイドモデル. J. Vis. Exp.

腫瘍細胞浸潤の3次元スフェロイドモデルの生成

無血清神経球培地における解離された高等度神経膠腫外科標本の伝播のためのプロトコルは、癌幹細胞表現型を有する細胞に対して選択する。神経球として成長できない標本については、代替プロトコルが提案される。免疫細胞化学のための3D神経球アーキテクチャを維持するためのパラフィン埋め込み技術について説明する。...

臨床関連動物モデルおよび3D免疫化学における使用のための外科検体からのハイグレード神経膠腫細胞培養の最適化

周囲の正常組織への浸潤は、悪性腫瘍の決定的な特徴です。ここでは、進行したヒトがんの多くのモデルで例示されている天然の3Dバイオマトリックスへの浸潤のシンプルな半自動マイクロプレートアッセイを提供します。...

三次元（3D）腫瘍スフェロイド浸潤アッセイ

ここでは、遺伝子操作されたモデルマウス腫瘍に由来する細胞の頭蓋内注射によって樹立されたGBMの前臨床同所性マウスモデルについて述べる。このモデルは、ヒトGBMの疾患の特徴を示しています。トランスレーショナル研究のために、マウス脳腫瘍は in vivoMRI および組織病理学によって追跡される。...

多形性膠芽腫の並進同所性モデル

ニワトリ胚は、 ovo および ex vivo 脳スライス共培養におけるヒト膠芽腫(GBM)脳腫瘍の研究に使用されます。GBM細胞の挙動は、 ex vivo 共培養におけるタイムラプス顕微鏡によって記録することができ、両方の調製物は、詳細な3D共焦点分析によって実験エンドポイントで分析することができる。...

ニワトリ胚脳をモデルとしてヒト膠芽腫細胞挙動の in vivoおよび ex vivo 解析(英語)

ここでは、腫瘍スフェロイドの迅速、堅牢、低コストな作製とそれに続くハイドロゲルカプセル化を可能にするプロトコルを紹介します。特殊な機器を必要としないため、広く適用できます。特に、スフェロイドとマトリックスの相互作用を探索したり、 in vitro 組織生理学や病理学モデルを構築したりするのに有用です。...

スフェロイド-マトリックス相互作用研究のためのポリエチレングリコールハイドロゲルにおける腫瘍スフェロイドの作製とカプセル化

私たちは、間質液の流れを組み込んだ浸潤前部の神経膠腫腫瘍微小環境を再現する方法を提示します。このモデルは、ヒアルロン酸-コラーゲンI型ハイドロゲルを組織培養インサートに含ませたもので、液圧ヘッドを適用することができる。浸潤を定量化し、細胞を単離または溶解することができます。...

間質流を有する浸潤性神経膠腫微小環境の光重合性ヒアルロン酸コラーゲンモデル

ここでは、3次元(3D)神経膠腫スフェロイドと細胞外フラックス分析によるイメージングベースの正規化を統合した代謝プロファイリングプラットフォームを確立します。このアプローチにより、薬物治療に対する腫瘍代謝反応をより正確に評価できるようになり、耐性の潜在的なメカニズムについての洞察が得られます。...

薬物スクリーニングのための三次元脳腫瘍スフェロイドの代謝プロファイリングの進歩

新たに診断され再発した腫瘍から生成された患者由来の磁気膠腫を用いて、3次元膠芽腫移動モデルを提示します。このプラットフォームは、患者特有の移動動態の可視化と治療効果の評価を可能にします。このアッセイは移動後に多重化され、タンパク質の局在化や発現パターンを評価することができます。...

磁気ナノ粒子媒介の球状定在を用いた低酸素条件下での再現可能な3D膠芽腫移動アッセイ

学ぶ、神経膠芽腫幹細胞を用いた3次元スフェロイドベースの浸潤アッセイ法。Fijiマクロによる定量化で、腫瘍の浸潤・移動・増殖を解析し、in vivo環境を再現した薬剤評価に活用できます。

神経膠芽腫の3次元スフェロイドモデル

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