Name: エレガンスにおける生理的ストレス応答の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: 学ぶC. elegansを用いた生理的ストレス応答の測定法。蛍光転写レポーターと高通量アッセイで、遺伝的・薬理的撹乱が保護的細胞経路に与える影響を評価します。

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R.BZ。EMBO長期フェローシップとラリー・L・ヒルブロム財団の支援を受けています。R.H.Sは、国立老化研究所(NIA)とグレン医学研究博士研究員財団を通じて5F32AG032023-02を助成金で支えています。A.F.は、NIAを通じてF32AG051355を付与することによってサポートされています。H.K.G.は、国立科学財団大学院研究フェローシッププログラムを通じて、DGE1752814の助成金によって支援されています。M.G.M.は1F31AG060660-01からNIAまでサポートされています。A.D.はトーマスとステイシー・シーベル財団、ハワード・ヒューズ医学研究所、NIAから4R01AG042679-04および5R01AG05891-02、およびNIEHSから5R01ES021667-09によってサポートされています。ラリー・ジョー、メリッサ・サンチェス、ナーメ・ケレット、アネル・エスキベルに対し、重要な技術支援をよろしくお願いします。私たちは、モリモト研究所とCGC(研究インフラプログラムP40 OD010440のNIH事務局が出資)に対して、株に感謝します。

著者らは開示するものは何もない。

ここでは、C.エレガンスにおける細胞ストレス応答を問い込む方法、蛍光転写レポーターおよび生理学的ストレス生存アッセイを用いて説明する。レポーターは、細胞ストレス応答の取り付けに関与する転写因子の下流転写標的のプロモーターの下で駆動されるGFP発現を利用する。Hsp-4p::GFPは、XBP-1s媒介UPRERによって変調され、hsp-6p::GFPはATFS-1媒介UPRMTによって制御され、gst-4p::GFPはSKN-1媒介性OxSRの下で、hsp16.2p::GFPとhsp-70p:GFP:HSF反応の下で説明される。他の標準化された転写レポーターは、表3に記載されています。ここで発表されたすべての転写記者は広いダイナミックレンジを有し、遺伝的摂動またはストレス誘発化学物質への暴露のいずれかを通じてストレスを適用することによって堅牢に活性化することができる。さらに、これらのレポーターは、採用したプロモーターの上流の転写因子のノックダウンによってす...

生物が細胞内および細胞外環境の変化に対応する能力は、その生存と適応にとって極めて重要である。これは、細胞の完全性を確保する多数の保護経路を介して細胞レベルで達成される。多くの細胞成分がストレス関連の損傷を受ける一方で、細胞ストレス応答の主な関与の1つは、細胞プロテオームの恒常性を修復し、保護することです。しかし、タンパク質をオルガネラと呼ばれる特別な構造に分体化することは、細胞内のすべてのタンパク質が適切に折り畳まれ、機能することを保証するために、1つの一元化された形態のタンパク質品質管理に頼ることができないため、細胞にとって課題となっています。したがって、タンパク質の摂動に対処するために、オルガネラは、誤って折り畳まれたタンパク質を感知し、そのコンパートメント内のストレスを軽減しようとしてストレス応答を活性化することができる専用の品質管理メカニズムを進化させました。例えば、細胞質は熱ショック応答(HSR)に依存し、小胞体(ER)およびミトコンドリアはコンパートメント特異的に展開されたタンパク質応答(UPR)に依存する。OxSRは活性酸素種(ROS)の毒性作用を緩和する役割を果たす。各ストレス応答は、細胞の課題と環境侮辱の存在下で引き起こされ、調整された転写応答を誘発する。これらの応答の特徴は、適切なオルガネラに標的となる誤って折りたたまれたタンパク質(シャペロンなど)を再折り畳む分子を合成すること、またはタンパク質分解によって損傷したタンパク質を除去することを含む。これらのストレス応答を活性化しないと、損傷したタンパク質の蓄積、細胞機能障害が組織の全身障害に伝播し、最終的には生物の死が生じる。さまざまなストレス応答の機能と調節は、他の場所でレビューされています1.
細胞ストレス応答の調節と活動に関する多くの洞察は、遺伝子研究における多細胞モデル生物である線虫、カエノハブディティス・エレガンスに起因している。線虫は、細胞レベルでのストレス応答の活性化を研究するだけでなく、生物レベルでも研究することができます。線虫は、遺伝的摂動や薬物や汚染物質への暴露が成長と生存に及ぼす影響を研究するために使用されてきました。迅速な生成時間、イソジニー、透明性、遺伝的な難易度、および実験中の使いやすさは、そのような研究に最適です。さらに、ストレスに対する比較的迅速な生理学的反応(数時間から数日の間)と細胞経路の進化的な保全は、線虫をストレス耐性を研究する上で顕著なツールにします。
C.エレガンスを成長させる食料源として使用される2つの一般的に使用される大腸菌株があります:標準OP50、ほとんどの実験が歴史的に行われてきたB株2とHT115、ほぼすべてのRNAi実験3、44に使用されるK-12株。3OP50 と HT115 細菌の食事の間に有意な違いがあることに注意することが重要です。.これらの異なる細菌源の増殖は、代謝プロファイル、ミトコンドリアDNAコピー数、および寿命5を含むいくつかの主要なフェノタイプに大きな違いを引き起こすことが示されている。これらの違いのいくつかは、OP50細菌の増殖に関連するビタミンB12欠乏症に起因し、ミトコンドリア恒常性の欠陥および病原体およびストレスに対する感受性の増加をもたらす可能性がある。これらの現象型のすべては、高レベルのビタミンB126を有するHT115細菌の増殖によって緩和することが示されている。したがって、生理的ストレス応答に関するすべての実験は、RNAi条件の必要性に関係なく、HT115細菌に対して行われることをお勧めします。しかし、OP50上で動物を維持し易いため、ここで説明する実験パラダイムの有意な違いは、OP50上で維持されたワームでは検出されなかったため(すなわち、逮捕または逮捕せずに孵化後の孵化)、全ての標準的な増殖(すなわち、動物の維持および増幅)を行うことができる。
ここで、2つの機能的方法を用いた細胞ストレス応答の活性の特性評価について説明する。提示されるプロトコルは、主に細胞ストレス応答とタンパク質恒常性への影響に焦点を当てていることに留意すべきである。まず、蛍光転写レポーターが利用され、異なる細胞ストレスに応答して特異的に活性化される内因性遺伝子プロモーターによって調節される。これらの蛍光転写レポーターは、ストレス応答のネイティブの一部である特定の遺伝子の転写誘導に基づいています。例えば、HSP-4は、ヒトシャペロンHSPA5/BiPに対する熱ショックタンパク質オルソパチスであり、ER-ストレス時に活性化され、そのストレスを軽減するためにERに局在する。ERストレスの条件(例えば、ツニカマイシンへの曝露)は、緑色蛍光タンパク質(GFP)を、hsp-4プロモーターの調節下に置き、線虫7の大粒子流細胞量を用いて蛍光顕微鏡法または定量的に測定して評価できるように高レベルで合成される。同様に、ミトコンドリアシャペロンのプロモーターは、hsp-6(哺乳動物HSPA9に対するオーソリン)、UPRMT8の活性化を監視するために利用され、そして、細胞質シャペロンhsp-16.2のプロモーター(ヒト結晶性α遺伝子に対する直交性)はHSR9の活性を評価するために使用される。これらのレポーターは、様々な摂動に応答して活性化された経路の迅速な特徴付けを可能にする。
多くの場合、ここで紹介するレポーターは、ストレス応答の活性化の質的な出力を提供する顕微鏡を使用して画像化されます。しかし、イメージング技術は、上記の記者の強度と組織位置の両方に関する情報を提供するが、その定量は必ずしも正確または堅牢ではない。イメージング解析ツールを用いて蛍光活性化を定量することは可能であるが、これらの方法は、比較的低いスループットであり、サンプルサイズが小さいため、画像化された動物の数が比較的少ないことからである。大量の動物を得る容易さと能力は、C.エレガンスを、大きな粒子フローサイトメーターを使用して蛍光ストレスレポーターの活性化をアッセイする理想的なモデルシステムにします。大粒子フローサイトメーターは、多くの生きた動物のサイズと蛍光に基づいて記録、分析、並べ替えが可能です。この方法を使用すると、数千のワームに対する蛍光強度、サイズ、および空間(2D)情報を取得することができます。システムはFlowPilotを使用して制御され、測定されたパラメータのリアルタイムデータ取得および分析が可能になる。ここでは、大粒子流サイトメーターを用いた顕微鏡イメージングと定量分析の両方の方法が、応力応答の活性化を測定する方法として提供されている。
レポーター分析以外にも、動物のストレスに対する感受性や抵抗性は、生理学的ストレスアッセイを用いて測定することができる。これは、特定の細胞ストレス経路を活性化するストレスの多い環境に動物をさらすことによって達成されます。ここでは、特定のタイプのストレッサーに対する全動物の感受性を測定するためのいくつかの方法が提供される。
ERストレスは、化学物質、ツニカマイシンを用いてC.エレガンスに適用され、これはN結合型グリコシル化をブロックし、ER10中に誤って折り畳まれたタンパク質の蓄積を引き起こす。C.エレガンスでは、チュニカマイシンへの曝露時の成長は、ER機能の大きな摂動をもたらし、寿命11を有意に低下させた。チュニカマイシン含有プレート上の動物の生存率を測定することにより、動物のERストレス感受性を定量化することができる。例えば、異所性UPRER誘導を有する動物は、ERにおけるタンパク質ミスフォールディングストレスに対する耐性が増加し、野生型動物12と比較してチュニカマイシン曝露時の生存率が増加する。
酸化およびミトコンドリアストレスは、化学薬品であるパラコートに動物を曝露することによってC.エレガンスに適用される。パラコートは、一般的に使用される除草剤であり、これはミトコンドリア13で特にスーパーオキシド形成を引き起こす。ミトコンドリア由来の活性酸素種(ROS)の特異的な局在化により、パラコートアッセイは「ミトコンドリア」ストレスアッセイとしてよく使用されます。しかしながら、スーパーオキシドは、ミトコンドリア・スーパーオキシド・ディスムターゼ(SODs)14によって14速やかに過酸化水素に変換される。過酸化水素は、その後、ミトコンドリアから拡散し、細胞の他の区画で酸化ストレスを引き起こす可能性があります。したがって、パラコート生存アッセイは、ミトコンドリアと酸化ストレスの両方に対する感受性を測定すると説明する(他の酸化ストレスアッセイは15を見つけることができる)。
耐熱アッセイは、高温で動物を配置することによってC.エレガンスで行われます。線虫の周囲温度は~15~20°Cで、熱応力は25°C16,17,17以上の温度で誘発される。耐熱アッセイは、一般に、30〜37°Cの範囲の温度で行われ、動物はこの温度で大きな細胞欠陥を示し、生存アッセイは24時間16、18,18時間以内に完了する。ここでは、耐熱性アッセイを行うための2つの代替方法が提供されています:34°Cでの成長と37°Cでの成長。RNA干渉または化学薬物ライブラリーを用いて、標準遺伝子のノックダウンと組み合わせると、ここで提示されるプロトコルを利用して、大規模スクリーンを実行することができます。
このプロトコルは、C.エレガンスの成長とイメージングの準備(セクション1および2)、蛍光顕微鏡(セクション3〜5)を用いた転写記者のイメージング、大粒子流サイトメーター(セクション6)を用いた記者の定量測定、およびC.エレガンスのストレス感受性を測定する生理学的アッセイ(セクション7)の4つの広範な手順に分けることができる。

<table><tbody><tr><td>アンチマイシン A</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>A8674</td><td>ミトコンドリアストレス</td></tr><tr><td>用 バクト・ペプトン</td><td>・フィッシャー 科学</td><td>DF0118072</td><td>NGMプレート用</td></tr><tr><td>BD Difco 粒状寒天</td><td>VWR</td><td>90000-782</td><td>NGMプレート</td></tr><tr>用<td>塩化カルシウム二水和物</td><td>VWR</td><td>97061-904</td><td>NGMプレート用</td></tr><tr><td>カルベニシリン</td><td>バイオパイオニア</td><td>C0051-25</td><td>RNAi用</td></tr><tr><td>コレステロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57-88-5</td><td>NGMプレート用</td></tr><tr><td>COPASバイオソーター</td><td>ユニオンバイオメトリック</td><td>350-5000-000</td><td>488nmの光源を装備。</td></tr><tr><td>COPAS洗浄液</td><td>ユニオンバイオメトリック</td><td>300-5072-000</td><td>COPAS</td></tr><tr><td>シース溶液</td><td>ユニオンバイオメトリック</td><td>300-5070-100</td><td>COPASと一緒に使用する</td></tr><tr><td>シ</td><td>グマ-アルドリッチ</td><td>472301薬</td><td>用溶剤</td></tr><tr><td>IPTGジオキサンフリー</td><td>デンビルサイエンティフィック</td><td>CI8280-4</td><td>RNAi</td></tr><tr><td>LBブロスミラー</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td>LB</td></tr><tr><td>M205FAステレオスコープ</td>用<td>BP1426500</td><td>ライカ</td><td>10450040、ライカDFC3000G単色CCDカメラ、標準ライカGFPフィルター(ex 395-455、EM 480 LP)、LAS Xソフトウェアを装備</td></tr><tr><td>NGMプレート用</td><td>硫酸マグネシウム七水和物</td><td>VWR</td><td>EM-MX0070-3</td>、</tr><tr><td>酸化/ミトコンドリアストレス用</td>M9<td>Paraquat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>36541</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>漂白剤用</td><td>フィ</td><td>ッシャーP217-500</td></tr><tr><td>リン酸カリウム二塩基性</td><td>VWR</td><td>EM-PX1570-2</td><td>NGMプレート用</td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性</td><td>VWR</td><td>EM-PX1565-5</td><td>M9</td></tr><tr><td>用 回転</td><td>ECHO</td><td>75990-514</td> オ<td>リンパス4x Plan Fluorite NA 0.13対物レンズ、標準オリンパスFITCフィルター(ex 470/40; em 525/50;DM 560)、およびカメラおよびECHOソフトウェアを駆動するためのiPad Pro</td></tr>塩化ナトリウム<tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71289-50G</td><td></td></tr>、<tr><td>NGMプレート用の塩化ナトリウム</td><td>EMDミリポア</td><td>SX0420-5</td><td>、M9</td></tr>リン酸<tr><td>ナトリウム二塩基性</td><td>VWR</td><td>71003-472</td>、<td></td></tr><tr><td>酸化ストレス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>用のM9 Tert-ブチルヒドロペルオキシドSigma-Aldrich 458139</td><td>RNAiツ</td>ニカマイシン用テトラサイクリン塩酸塩<td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660-5G</td></tr><tr><td></td><td>ERストレス用</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7765-50MG</td></tr></tbody></table>

エレガンスにおける生理的ストレス応答の測定

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

生物は環境の変動や細胞内恒常性の変化に晒されることが多く、タンパク質や生理学に有害な影響を及ぼす可能性があります。したがって、生物は損傷を修復し、恒常性を維持するために捧げられた標的と特定のストレス応答を進化させてきた。これらのメカニズムには、小胞体の展開されたタンパク質応答(UPRER)、ミトコンドリア(UPRMT)の展開されたタンパク質応答、熱ショック応答(HSR)、酸化ストレス応答(OxSR)が含まれる。ここで示すプロトコルは、線虫、C.エレガンスにおけるこれらの経路の活性化とその生理学的影響を検出し、特徴付ける方法を記述する。まず、経路特異的蛍光転写レポーターの使用について、迅速な細胞特性評価、薬物スクリーニング、または大規模な遺伝子スクリーニング(例えば、RNAiまたは変異型ライブラリー)について説明する。また、相補的で堅牢な生理学的アッセイが記載されており、これは特定のストレッサーに対する動物の感受性を直接評価するために使用することができ、転写記者の機能的検証として役立つ。これらの方法を組み合わせることで、細胞の迅速な特徴付けと、内部および外部のプロテオ毒性摂動の生理的効果を可能にします。

転写レポーターを使用したストレス応答の活性化測定 ここでは、蛍光転写レポーターが使用され、C.エレガンスのほとんどのストレス応答の活性化を測定するための堅牢なツールとして機能します。GFP発現は、コンパートメント固有のストレスへの対応に関与するマスター転写調節因子の正規標的のプロモーターの下で駆動される。一般的に使用される転写記者の包括的なリストは、表3に記載されています。
ER恒常性を乱すタンパク質や脂質二重層ストレスを介してER恒常性を乱すと、ER(UPRER)の展開されたタンパク質応答が活性化し、ERの品質と機能を回復させます。UPRERは、膜貫通センサーによって定義される3つの異なる分岐から構成されています:イノシトールを必要とするタンパク質1(IRE1)、活性化転写因子6(ATF6)、およびプロテインキナーゼ...

ここでは、線虫C.エレガンスにおける細胞タンパク質毒性ストレス応答を、蛍光転写レポーターの活性化を測定し、生理学的ストレスに対する感受性をアッテルすることによって特徴付ける。

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

これらの方法は、C.elegansのストレス応答を特徴付け、遺伝的または薬理的摂動が保護細胞経路の活性化に影響を与えるかどうかを判断するために使用することができる。これらの方法は、分子レベルと生理レベルの両方で遺伝子ノックダウンなどの何百もの摂動の迅速かつハイスループットテストを可能にします。アッセイが適切に行われるように、正および陰性の制御を含む。健康で十分に供給された動物を適切な段階に同期させ、実験のために新鮮なプレートを使用します。ピックを使用したワームのマイクロマニピュレーションの視覚化は、新しいユーザーがワームをどのように並べて実行可能性を評価できるかを理解するのに役立ちます。手順を実証するには、フィル・フランキーノ、ホリー・ギルデア、メリッサ・メトカーフ(当研究室の大学院生)が参加します。熱ショックタンパク質4のプロモーターの下でGFPを発現する動物を使用して、タンパク質応答を展開し、L4段階まで20°Cで同期したレポーター動物を成長させ、M9培地を使用してワームをプレートから洗い流し、チューブに移す。遠心分離によってワームを収集した後、M9をコントロール動物の管内のM9またはM9の目的の薬物の1ミリリットル当たり25ナノグラムに置き換えます。その後、20°Cで3〜4時間回転プラットフォーム上にワームを置きます。インキュベーションの終わりに、M9の15ミリリットルだけで処理溶液を置き換える前に、治療溶液を沈着させる前に、遠心分離する。2回の打ち上げの後、必要に応じて動物をNGMプレートまたはNGM RNA干渉プレートに移し、ワームが摂氏20度で一晩回復できるようにします。ワームが回復したら、細菌なしで標準的なNGMプレートに100ミリモルナトリウムアジドの5〜10マイクロリットルを加え、解剖顕微鏡の下にワームのプレートを置きます。プレートからアジ化ナトリウムのスポットに10〜20匹の動物を移す。動物は塩溶液に着陸した直後に動きをつかむべきです。アジドナトリウムが蒸発したら、すべての動物に対して同じ向きの前側と後部側を使用して所望の画像設定で動物を整列させ、すぐに動物のプレートをステレオ顕微鏡の下に置きます。ステレオ顕微鏡イメージングソフトウェアを起動し、取得タブで[プロジェクトとフォルダを開く]をクリックして新しいプロジェクトを開きます。右クリックして[名前の変更]を選択し、フォルダの名前を変更します。ワームサンプルを顕微鏡の目的の下に配置し、ブライトフィールド設定を使用してワームの正しい焦点を特定して蛍光漂白を最小限に抑えます。サンプルの中心は、卵の線がはっきりと見え、あいまいではない点になります。露出時間を設定して、ピクセルが飽和しないようにし、信号が検出限界を超えるようにします。露出時間、ズーム、フォーカス、およびブライトフィールド凝縮器を

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エレガンスにおける生理的ストレス応答の測定

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