Name: 骨格筋生検からミオフィブリルを分離し、ナノニュートン分解力トランスデューサーによる収縮機能を決定する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: 学ぶ 骨格筋生検から分離したミオフィブリルの収縮機能評価法。ナノニュートン分解力トランスデューサーを用いてサルコメア機能障害と筋力低下の関係を解析し、筋生理学と疾患研究に有用なデータを取得できます。

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このプロジェクトは、AFMテレソンとネマリンミオパシーのための財団の建物の強さによって資金提供されました。著者は、この記事で言及されている製品の作成者を認めてほしいと考えています, IONOptix Inc. .

<ol><li>Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sarcomere+Dysfunction+in+Nemaline+Myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuromuscular.+Disease%22%5BJournal%5D)">Sarcomere Dysfunction in Nemaline Myopathy.</a> J. Neuromuscular. Disease. 4, 99-113 (2017).</li>
<li>Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+and+passive+forces+of+isolated+myofibrils+from+cardiac+and+fast+skeletal+muscle+of+the+frog%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog.</a> Journal of Physiology. 500, Pt 2 535-548 (1997).</li>
<li>Kulke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+major+source+of+myofibrillar+stiffness+in+Drosophila+indirect+flight+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle.</a> Journal of Cell Biology. 154, 1045-1057 (2001).</li>
<li>Stehle, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isometric+force+kinetics+upon+rapid+activation+and+relaxation+of+mouse%2C+guinea+pig+and+human+heart+muscle+studied+on+the+subcellular+myofibrillar+level%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level.</a> Basic Research in Cardiology. 97, Suppl 1 127-135 (2002).</li>
<li>Iorga, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micromechanical+function+of+myofibrils+isolated+from+skeletal+and+cardiac+muscles+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish.</a> Journal of General Physiology. 137, 255-270 (2011).</li>
<li>Ribeiro, P. A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractility+of+myofibrils+from+the+heart+and+diaphragm+muscles+measured+with+atomic+force+cantilevers%3A+Effects+of+heart-specific+deletion+of+arginyl-tRNA-protein+transferase%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: Effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase.</a> International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).</li>
<li>Joureau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunctional+sarcomere+contractility+contributes+to+muscle+weakness+in+ACTA1-related+nemaline+myopathy+%28NEM3%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Dysfunctional sarcomere contractility contributes to muscle weakness in ACTA1-related nemaline myopathy (NEM3).</a> Annals of Neurology. 83, 269-282 (2018).</li>
<li>de Souza Leite, F., Minozzo, F. C., Altman, D., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+perfusion+shows+intersarcomere+dynamics+within+single+skeletal+muscle+myofibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Microfluidic perfusion shows intersarcomere dynamics within single skeletal muscle myofibrils.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8794-8799 (2017).</li>
<li>Shalabi, N., Cornachione, A., de Souza Leite, F., Vengallatore, S., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+force+enhancement+is+regulated+by+titin+in+skeletal+and+cardiac+myofibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Residual force enhancement is regulated by titin in skeletal and cardiac myofibrils.</a> Journal of Physiology. 595, 2085-2098 (2017).</li>
<li>Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increase+in+non-cross-bridge+forces+after+stretch+of+activated+striated+muscle+is+related+to+titin+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).</li>
<li>Labuda, A., Brastaviceanu, T., Pavlov, I., Paul, W., Rassier, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+detection+system+for+probing+cantilever+deflections+parallel+to+a+sample+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Optical detection system for probing cantilever deflections parallel to a sample surface.</a> Review of Scientific Instruments. 82, 013701(2011).</li>
<li>Chavan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferrule-top+nanoindenter%3A+an+optomechanical+fiber+sensor+for+nanoindentation%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Ferrule-top nanoindenter: an optomechanical fiber sensor for nanoindentation.</a> Review of Scientific Instruments. 83, 115110(2012).</li>
<li>Beekmans, S. V., Iannuzzi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+metrological+approach+for+the+calibration+of+force+transducers+with+interferometric+readout%5BTitle%5D)+AND+%22Surface+Topography%3A+Metrology+and+Properties%22%5BJournal%5D)">A metrological approach for the calibration of force transducers with interferometric readout.</a> Surface Topography: Metrology and Properties. 3, (2015).</li>
<li>van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink, G. H., Iannuzzi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+dynamic+mechanical+analysis+for+heterogeneous+soft+matter+using+ferrule-top+indentation%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation.</a> Soft Matter. 12, 3066-3073 (2016).</li>
<li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KBTBD13+is+an+actin-binding+protein+that+modulates+muscle+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2019).</li>
<li>Winter, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation-specific+effects+on+thin+filament+length+in+thin+filament+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Mutation-specific effects on thin filament length in thin filament myopathy.</a> Annals of Neurology. 79, 959-969 (2016).</li>
<li>Ottenheijm, C. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deleting+exon+55+from+the+nebulin+gene+induces+severe+muscle+weakness+in+a+mouse+model+for+nemaline+myopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Deleting exon 55 from the nebulin gene induces severe muscle weakness in a mouse model for nemaline myopathy.</a> Brain. 136, 1718-1731 (2013).</li>
<li>Ribeiro, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractility+of+myofibrils+from+the+heart+and+diaphragm+muscles+measured+with+atomic+force+cantilevers%3A+effects+of+heart-specific+deletion+of+arginyl-tRNA-protein+transferase%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase.</a> International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).</li>
<li>Pinniger, G. J., Bruton, J. D., Westerblad, H., Ranatunga, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+Myosin-II+Inhibitor+%28N-benzyl-p-toluene+Sulphonamide%2C+BTS%29+on+Contractile+Characteristics+of+Intact+Fast-twitch+Mammalian+Muscle+Fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Muscle+Research+and+Cell+Motililty%22%5BJournal%5D)">Effects of a Myosin-II Inhibitor (N-benzyl-p-toluene Sulphonamide, BTS) on Contractile Characteristics of Intact Fast-twitch Mammalian Muscle Fibres.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motililty. 26, 135-141 (2005).</li>
<li>Stehle, R., Krüger, M., Pfitzer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+kinetics+and+individual+sarcomere+dynamics+in+cardiac+myofibrils+after+rapid+Ca%282%2B%29+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes.</a> Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).</li>
<li>Najafi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-diastolic+force+pre-activates+cardiomyocytes+and+determines+contractile+force%3A+role+of+titin+and+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">End-diastolic force pre-activates cardiomyocytes and determines contractile force: role of titin and calcium.</a> Journal of Physiology. 597, 4521-4531 (2019).</li>
</ol>

ミシエル・ヘルメスは、IONOptix Inc.の株主兼共同オーナーです。

記載は、ヒトまたは動物骨格筋組織から分離された筋原線維の収縮機能を評価するプロトコルである。このセットアップの力の分解能は、以前にChavanらら12によって説明されています。要するに、検出繊維とカンチレバーの間に形成されたファブリ・ペロ空洞の長さのランダムな変動によって決定され、読み出しの出力(Vで表される)の出力でノイズの支配的な部分を生成し、偏向感度(m/Vで表される)とカンチレバーのばね定数(N/mで表される)によって、ノイズを与えます。セットアップでは、1,000 データポイント/s (サンプル/s) でサンプリングされた読み出しの出力での空気中の二乗平均平方根(rms)ノイズは約 2 mV です。典型的なミオフィブリル測定では、フェルールトッププローブを使用し、スプリング定数は〜0.7 N/m(偏向感度〜300 nm/V)です。この rms 値は、0.6 nm のカンチレバー偏向解像度に対応し、これは約 0.37 nN の力の感度に変換されます。力プローブは、読み出しレーザ13の波長の倍数に等しいカンチレバーの曲げを維持しながら、...

線条筋細胞は日常生活に欠かせないものです。四肢の動き、呼吸機能、心臓のポンピング運動は、筋肉細胞によって生成される力に依存する。骨格筋は、単筋線維の束を含む筋の筋線維からなる(図1A)。これらの筋線維は、連続的に連結されたサルコメアによって形成される筋線維で構成される(図1B,D)。サルコメアには薄くて厚いフィラメントが含まれています。これらは主にアクチン分子とミオシン分子の鎖から成り、それぞれ(図1B)。アクチンとミオシンの相互作用は、筋肉の力を発生させる能力を担っています.肉リン、アクチン、トロポニンTなどの肉体タンパク質をコードする遺伝子の変異を有する患者は、収縮性機能不全1による筋力低下に苦しんでいる。
筋肉の収縮の質は、生体内の筋肉全体からインビトロ運動アッセイにおけるアクチンミオシン相互作用に至るまで、組織の様々なレベルで研究することができます。過去数十年の間に、いくつかの研究グループは、個々のmyofibrils,,,,,22、3、4、5、6、7、8、9、103,4の契約性を決定するためのセットアップ9を10開発しました。5678これらの設定は、ミオフィブリルの収縮によって引き起こされるカンチレバーからのレーザー偏向(すなわち、光ビーム偏向)の変化の検出に基づいている(詳細については、Labudaら11参照)。myofibrilsの収縮機能を決定することはいくつかの制限を有するが(例えば、筋原線維の上流にある励起収縮結合過程のダイナミクスが欠けている)、このアプローチには複数の利点がある。これらには、1)サルコメアの幾何学的制約の存在下でアクチンとミオシンの相互作用を評価する能力が含まれる。2)損傷の潜在的な交交効果なしにアクチンミオシン相互作用を評価する能力、隣接する筋線維(単一の筋線維の収縮性を測定する場合、筋線維の超構造的損傷およびミスアライメントが収縮障害に寄与する可能性がある)(図1D);3)筋線維の小径(〜1μm、図2A)および膜の欠如は、サルコメアへのほぼ瞬時のカルシウム拡散を可能にする。さらに、筋細柱に構造的な損傷が存在する場合、それらは孤立中または実験中に壊れる可能性が高い。したがって、筋線維性収縮性を評価することは、筋肉収縮の基本的なメカニズムを研究し、障害のあるアクチンとミオシンの相互作用が肉体タンパク質の突然変異によって引き起こされる筋肉疾患の主な原因であるかどうかを理解するためのエレガントな方法です。
このプロトコルは、ナノニュートン分解能(すなわちOptiforce)を用いたカンチレバー力プローブを組み込んだmyofibrilsの収縮性を決定するために新しく開発されたセットアップを提示する。この力プローブは、干渉法の原理に基づいています。干渉測定は比較的堅い片持ち面の使用を可能にする。これにより、カンチレバーの偏向が少なく、ミソフィブリルの等方体収縮に近づく力を測定することが可能になる。このプローブは、人間の被験者を含む異なる筋肉生検から分離された単一の筋線維性によって生成される低受動および活動的な力を高いシグナル対雑音比で評価することを可能にする。このセットアップに組み込まれた光学カンチレバー力プローブは、ファブリ・ペロ干渉計12に基づいています。干渉計は、フェルールに取り付けられた光ファイバと金被覆のカンチレバーとの間の小さな変位を検出する(図3)。光ファイバーとカンチレバーの間のギャップは、ファブリ・ペロキャビティと呼ばれます。Myofibrilsは2つの接着剤コーティングされたガラス取り付け繊維を使用して、プローブとピエゾモーターの間に取り付けられます。ミオフィブリルによって生じる力は、干渉計データから数学的に導き出すことができる。干渉法は、2つ以上の波の重ね合わせまたは干渉に基づいています(このセットアップでは3つの光波)。波長が1,528.77~1,563.85nmのレーザー光は干渉計から放射され、光ファイバを通して送られます。プローブでは、光は光ファイバと媒体の間の界面で反射される(図3A)。2)媒体およびカンチレバーのインターフェイスで(図3B);3)カンチレバーの金属と金のコーティングの間の界面で(図3C)。インターフェイス A および B での反射は、プローブが沈み込む媒体の屈折率(n)に依存します。3つの重ね合わせ反射からなる光は、干渉計のフォトダイオードに戻ります。フォトダイオードは、光の強度を測定し、これは3つの重畳反射の干渉パターンの結果である。収縮力が筋炎を活性化または伸ばすことによって生成されると、ミオフィブリルはカンチレバーを引っ張る。この動きは、キャビティサイズ(d) を変更し、その結果、空洞に収まる波長の数を変更します。片持ち面で反射した光は相が異なり、異なる干渉パターンが生じます。フォトダイオードは、この干渉パターンの強度の変化をボルトの変化として記録します。続いて、ミオブリル力の生成は、片持ち剛性を考慮して、この変化から計算される。力プローブは、取り付け針の先端を押し、片持ちの自由手渡し端に取り付け、カンチレバーの曲げを読み出しレーザー13の波長の倍数に保ちながら計量スケールに対して製造業者によって較正される。したがって、干渉法は、ナノニュートン分解能で力の測定を可能にする、距離の小さな変化を検出する非常に敏感な方法です。この分解能により、高い信号対雑音比を持つ筋線維力の評価が可能になります。従来の干渉法では、測定範囲が干渉曲線の線形部分に制限されますが、ロックインアンプとレーザー波長の変調を使用すると、この制限を克服します14。これについては、ディスカッションのセクションで詳しく説明します。
ミオフィブリル活性緊張を測定するために、高速ステップ灌流システムを組み込んで、ミオフィブリルをカルシウム溶液に曝露した(図4A)。高速ステップ灌流システムは10 msの範囲内で起こる解決の変更を可能にする。その小さな直径のために、マイフィブリルへのカルシウム拡散はほぼ瞬時です。したがって、このシステムは、活性化および弛緩中の放出中のアクチン-ミオシン結合の速度を測定するのに特に適している。活性化率(kACT)および弛緩(kREL)は、活性化緩和曲線から決定することができる。また、濃度を高めるカルシウム溶液にミオブイブリルを曝露することにより、力とカルシウムの関係とカルシウム感受性を決定することができる。
さらに、ピエゾ長モーターは、筋形筋の速い伸縮および短縮を可能にする。これは、筋線維性の粘弾性特性(すなわち、受動的緊張)を研究する可能性を提供するとともに、筋線維の急速な短縮および再伸縮を行い、緊張再発達率(kTR)を決定する。活性および受動緊張実験の両方から得られるパラメーターは、肉体タンパク質の遺伝子変異によって変化させることができる。
このカスタム構築されたセットアップは、健康な人間、患者、およびマウス骨格筋から分離されたmyofibrilsのアクティブおよび受動的な収縮特性を測定するために使用されました。

<table><tbody><tr><td>バイオスペックプロダクツ株式会社</td><td>985370-XL</td><td>筋原線維</td><td></td>を分離するには</tr><tr><td>カスタムコード</td><td></td><td>化されたMatlab</td><td></td></tr><tr><td>カスタム製造</td><td></td><td>シリアル接続を制御するLabviewプログラムが含まれています。バルブ</td><td></td>を制御するには</tr><tr><td>カスタム加工</td><td></td><td>ペルチェモジュール</td><td></td>を冷却するには</tr><tr><td>カスタム加工 カスタム加工</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>アルミティッシュチャンバー</td><td></td></tr><tr><td>カスタム加工</td><td></td><td>バルブを制御するには;USB</td><td></td></tr><tr><td>IonOptix</td><td></td><td>システムコントローラソフトウェアを制御するPCソフトウェアが含まれています:ピエゾおよびファストステップ</td><td></td>IonOptix MCS100用の高度な信号発生器を備えたデータ記録ソフトウェア</tr><tr><td></td><td></td><td>サルコメアの長さ</td><td></td>を記録するには</tr><tr><td>IonOptix</td><td></td><td>が含まれています:Optiforce(干渉計)、マイクロマニピュレータ、信号インターフェース、ピエゾモータおよびコントローラ。MyoStretcher</td><td></td></tr><tr><td>、IonOptix</td><td></td><td>、フォースプローブ</td><td></td></tr><tr><td>、Koolance</td><td>ADT-EX004S、</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koolance</td><td>EX2-755</td>、ペル<td>チェモジュール</td><td></td></tr>、<tr><td>マイクロソフト</td><td></td><td>、データ登録</td><td></td></tr><tr><td>、オリンパス</td><td>IX71</td><td></td><td></td></tr><tr><td>、オリンパス</td><td>TH4-200</td><td></td><td></td></tr><tr><td>を冷却することに基づいています。Sigma-Aldrich</td><td>529265</td><td>ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート);組織の付着を防ぐ顕微鏡スライドのコーティング</td> Sigma-Aldrich 78471 結晶がエタノールに溶解して接着剤になる TE Technology, Inc.<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>TE-63-1.0-1.3</td><td>組織フローチャンバー</td><td></td>を冷却するには</tr><tr><td>TE Technology, Inc.</td><td>TC-720</td><td>USB</td> Tecan Trading AG 20736652 Tecan Trading AGを制御する<td></td>PCソフトウェア、</tr><tr><td></td><td></td>20739263シリンジポンプを使用してバックグラウンドフローを誘導し、高速ステップ灌流システムが含まれています。<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>組織フローチャンバー</td><td></td>からの流出</tr><tr><td>Thermo scientific</td><td>2441081</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Warner Instruments(Harvard Bioscience, Inc.)</td><td>生産終了</td><td>代替品:SF-77CST/VCS-77CSP</td><td></td></tr><tr><td>ワーナー・インスツルメンツ社(ハーバード・バイオサイエンス社)</td><td>TG150-4</td><td>ティッシュ</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td>ペーパーを灌流するには、<td>IonWizard用に1台、その他のソフトウェア</td><td></td>用に1台のPC</tr></tbody></table>

骨格筋生検からミオフィブリルを分離し、ナノニュートン分解力トランスデューサーによる収縮機能を決定する

Isolating Myofibrils from Skeletal Muscle Biopsies and Determining Contractile Function with a Nano-Newton Resolution Force Transducer

ヒトや動物の活動には、線条筋細胞が不可欠です。単一の筋線維は、筋の中で最も小さい収縮ユニットである連続的に連結されたサルコメアで構成される筋線維で構成される。肉体機能障害は、肉体タンパク質をコードする遺伝子の変異を有する患者の筋力低下に寄与する。筋線維力学の研究は、単一の筋線維の収縮性を測定する際に損傷を受けた隣接する筋線維の潜在的な交位効果なしにアクチンとミオシン相互作用の評価を可能にする。筋線維の超構造的損傷および不整列は収縮性の障害に寄与する可能性がある。筋細動体に構造的損傷が存在する場合、分離手順中または実験中に壊れる可能性が高い。さらに、myofibrilsの研究は、サルコメアの幾何学的制約の存在下でのアクチンとミオシン相互作用の評価を提供する。例えば、筋線維の測定は、筋膜機能不全が肉体タンパク質の突然変異の主な効果であるかどうかを解明することができる。さらに、カルシウム溶液または化合物の灌流は、ミオフィブリルの小径のためにほぼ瞬時に行われる。これは、筋線維は、力の生産中に活性化および弛緩の速度を測定するために非常に適しています。本論文に記載されたプロトコルは、ナノニュートンの範囲で力を測定することができるファブリー・ペロ干渉計の原理に基づく光学力プローブを採用し、ピエゾ長モータと高速ステップ灌流システムと組み合わせる。このセットアップは、高分解能測定で筋知見力学の研究を可能にする。

データ トレースは、システム コントローラ ソフトウェアで記録され、開かれました ( 資料一覧を参照)。完全なトレースまたは選択したセグメントは、目的のソフトウェアでさらなる分析のためにクリップボードまたはテキストファイルにエクスポートされました。異なるソリューションの流れを制御するためのバルブは、カスタムソフトウェアまたは手動で切り替えられました。カスタム MATLAB スクリプトを使用して、活性化、テンション再開発、および緩和の速度を分析しました。受動力実験の最大活性力とピーク及び高原力を、システムコントローラソフトウェア力トレースから直接採取した。myofibrilを取り付けた後(図2)、目的のプロトコルを選択しました。
最大の活性力とカルシウム-マウスおよびヒト骨格筋生検から分離されたマイオフィブリル中の力の感受性 図4Aでは、活性力実験に用いる実験...

ここで提示されるプロトコルは、ナノニュートン分解能を有する線条筋筋筋線維の収縮特性を評価する。このプロトコルは、干渉法ベースの光学力プローブを用いたセットアップを採用しています。この設定は、高い信号対雑音比を持つデータを生成し、myofibrilsの収縮運動の評価を可能にします。

Striated muscle cells are indispensable for the activity of humans and animals. Single muscle fibers are comprised of myofibrils, which consist of ...

線条筋から分離された筋膜の収縮特性を評価することは、サルコメア機能不全が肉体タンパク質の突然変異による筋力低下の主な原因であるかどうかを判断するために使用することができる。この技術は、ナノニュートン分解能を持つ非常に高い信号対雑音比を持つデータを取得するために使用することができます。このプロトコルは、パーメアナイズされた心筋細胞の収縮性を測定するのにも適している。力トランスデューサは非常に壊れやすいので注意してください。だから、取り付け針から接着剤を取り除くとき、またはミオフィブリルを接着するとき、あなたは安定した手、多くの練習、そして多くの忍耐を持っている必要があります。組織を取り付ける前に、筋肉組織を含むチューブにホモジナイザーロッドを入れる。チューブを氷の上に置いておき、ローターをスピード5で15秒間回転させます。均質化の終わりに、得られたミオブリル懸濁液の50マイクロリットルと250マイクロリットルのリラックス液を、組織浴中のポリヘマコーティングスライドに移す。ほこりから混合物を保護するために蓋でお風呂を覆い、myofibrilsがドロップの底に沈むのを許可するために5〜10分待ちます。myofibrilsの沈没時に、シェラックにエタノール接着剤を摂氏65度で30〜60秒間加熱してから、コーティングされていないガラススライドに約6マイクロリットルの接着剤を追加します。接着剤の層が見えるまで、各取り付け針の先端を接着剤に繰り返し浸します。次に、マイクロマニピュレータを使用してプローブとピエゾを垂直に動かして、顕微鏡ステージ上のティッシュバス用のスペースを作り、接着剤を含むガラススライドを取り外します。筋線維を取り付けた後、サルコメアの長さを測定するために、ピエゾおよび/または力プローブを動かして、ミオフィブリルの初期サルコメア長さを2.5マイクロメートルに設定する。システムコントローラソフトウェアの容器機能を使用して、ミオブリルの長さと幅を測定します。顕微鏡ステージを使用して、ビデオ画像の中央にミオフィブリルを配置し、ミオフィブリルの片側から他方の側に長方形を伸ばし、接着剤の液滴の暗い端を含むように注意してください。データの記録を開始するには、[開始] をクリックします。5 秒後に、[一時停止] をクリックします。長さが記録されます。幅を測定するには、カメラを 90 度回転させて、myofibril 自体のエッジのコントラストを表示します。四角形を調整し、[開始] をクリックしてデータの記録を開始します。5 秒後に、[一時停止] をクリックします。幅が記録されます。テタグラスを配置するには、接眼機とマニピュレータを使用して、シタグラスをミオフィブリルに向かって慎重に移動させます。テタガラスの上部チャネルをmyofibrilと位置を確認し、高速ステップを実行します。バックグラウンドのリラックスフローをオンにして、テタガラスの位置合わせを確認し、ルーアーバルブレバーを使用してフローチャンバーの流入をオンにします。次に流れチャンバの排水を開始し、フローチャンバーの流出を防止するために、流出ポンプバルブをバスバルブ2に、マイクロステップモードをマイクロに、プランジャーターゲットを48,000、プランジャー速度を38~40に設定します。張力再発生率を測定するには、ミオフィブリルを15%緩めるために必要なピエゾ運動を計算し、この値を信号発生器に入力します。再開をクリックしてデータを記録し、弁1と6を開いて、それぞれシタガラスを通してリラックスした溶液と異なるカルシウム濃度の流れを開始します。干渉計のリセット範囲を選択して、干渉計の範囲をリセットして、基線力がゼロボルトになるようにします。力の跡が安定したら、100マイクロメートルのステップサイズで、ステタガラスの速いステップを行う。力高原に達したら、ピエゾで短縮再伸縮を行う。活性化緩和トレースが記録されます。[一時停止] をクリックします。ステップワイズストレッチを実行するには、[開始]をクリックし、干渉計の範囲をリセットして、基線力がゼロボルトになるようにします。信号発生器でステップワイズストレッチを実行します。ストレッチが終了したら、ピエゾを使用してミオフィブリルを緩み長さに短くします。次に、一時停止を押して停止し、データを保存します。ここでは、健康なヒト四頭筋から分離した筋炎を用いた活性力実験の力痕が示されている。ミヒブリブリルは、カルシウム濃度が異なる溶液で5回活性化され、1平方ミリメートル当たり約123ミリニュートンのすべてのミヒブリルの平均最大力を有する。5つのカルシウム曲線の各々の活性化の間に到達した高原力からの力カルシウム濃度曲線の構築は、最大力生産の50%でカルシウム濃度の計算を可能にする。この代表的な分析で示されるように、myofibrilsは、1つの実験で複数の化合物で処理して、筋線維化のタイプに関する追加の質問に答えることができる。活性力およびサルコメアの長さはまた再開発、活性化および弛緩の率の計算を可能にするために測定することができる。点線の赤いボックスに示されている急激な上昇は、粘度と弾力性の両方によって引き起こされます。高原は弾性成分に似ています。粘度が直線的に歪みに抵抗するので、歪みの後に低下した力を除去した。テタグラスを配置するときは、ミオブリルと適切に揃うようにしてください。それ以外の場合、アクティブ化ソリューションが光ファイバとフォースプローブの片持ちレバーの間に入り込んでしまい、データ内でアーティファクトが発生する可能性があります。また、ミオブリルは正常に活性化しない場合があります。この灌流の方法は、筋線維の種類の筋線維を決定するのにも適している。たとえば、まず通常のカルシウム溶液でミオブリルを浸透させ、その後同じ溶液を灌流し、次に筋線維タイプの力増強化合物を加えることができます。

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