骨格筋生検からミオフィブリルを分離し、ナノニュートン分解力トランスデューサーによる収縮機能を決定する

ここで提示されるプロトコルは、ナノニュートン分解能を有する線条筋筋筋線維の収縮特性を評価する。このプロトコルは、干渉法ベースの光学力プローブを用いたセットアップを採用しています。この設定は、高い信号対雑音比を持つデータを生成し、myofibrilsの収縮運動の評価を可能にします。

線条筋から分離された筋膜の収縮特性を評価することは、サルコメア機能不全が肉体タンパク質の突然変異による筋力低下の主な原因であるかどうかを判断するために使用することができる。この技術は、ナノニュートン分解能を持つ非常に高い信号対雑音比を持つデータを取得するために使用することができます。このプロトコルは、パーメアナイズされた心筋細胞の収縮性を測定するのにも適している。

力トランスデューサは非常に壊れやすいので注意してください。だから、取り付け針から接着剤を取り除くとき、またはミオフィブリルを接着するとき、あなたは安定した手、多くの練習、そして多くの忍耐を持っている必要があります。組織を取り付ける前に、筋肉組織を含むチューブにホモジナイザーロッドを入れる。

チューブを氷の上に置いておき、ローターをスピード5で15秒間回転させます。均質化の終わりに、得られたミオブリル懸濁液の50マイクロリットルと250マイクロリットルのリラックス液を、組織浴中のポリヘマコーティングスライドに移す。ほこりから混合物を保護するために蓋でお風呂を覆い、myofibrilsがドロップの底に沈むのを許可するために5〜10分待ちます。

myofibrilsの沈没時に、シェラックにエタノール接着剤を摂氏65度で30〜60秒間加熱してから、コーティングされていないガラススライドに約6マイクロリットルの接着剤を追加します。接着剤の層が見えるまで、各取り付け針の先端を接着剤に繰り返し浸します。次に、マイクロマニピュレータを使用してプローブとピエゾを垂直に動かして、顕微鏡ステージ上のティッシュバス用のスペースを作り、接着剤を含むガラススライドを取り外します。

筋線維を取り付けた後、サルコメアの長さを測定するために、ピエゾおよび/または力プローブを動かして、ミオフィブリルの初期サルコメア長さを2.5マイクロメートルに設定する。システムコントローラソフトウェアの容器機能を使用して、ミオブリルの長さと幅を測定します。顕微鏡ステージを使用して、ビデオ画像の中央にミオフィブリルを配置し、ミオフィブリルの片側から他方の側に長方形を伸ばし、接着剤の液滴の暗い端を含むように注意してください。

データの記録を開始するには、[開始] をクリックします。5 秒後に、[一時停止] をクリックします。長さが記録されます。

幅を測定するには、カメラを 90 度回転させて、myofibril 自体のエッジのコントラストを表示します。四角形を調整し、[開始] をクリックしてデータの記録を開始します。5 秒後に、[一時停止] をクリックします。

幅が記録されます。テタグラスを配置するには、接眼機とマニピュレータを使用して、シタグラスをミオフィブリルに向かって慎重に移動させます。テタガラスの上部チャネルをmyofibrilと位置を確認し、高速ステップを実行します。

バックグラウンドのリラックスフローをオンにして、テタガラスの位置合わせを確認し、ルーアーバルブレバーを使用してフローチャンバーの流入をオンにします。次に流れチャンバの排水を開始し、フローチャンバーの流出を防止するために、流出ポンプバルブをバスバルブ2に、マイクロステップモードをマイクロに、プランジャーターゲットを48,000、プランジャー速度を38~40に設定します。張力再発生率を測定するには、ミオフィブリルを15%緩めるために必要なピエゾ運動を計算し、この値を信号発生器に入力します。

再開をクリックしてデータを記録し、弁1と6を開いて、それぞれシタガラスを通してリラックスした溶液と異なるカルシウム濃度の流れを開始します。干渉計のリセット範囲を選択して、干渉計の範囲をリセットして、基線力がゼロボルトになるようにします。力の跡が安定したら、100マイクロメートルのステップサイズで、ステタガラスの速いステップを行う。

力高原に達したら、ピエゾで短縮再伸縮を行う。活性化緩和トレースが記録されます。[一時停止] をクリックします。

ステップワイズストレッチを実行するには、[開始]をクリックし、干渉計の範囲をリセットして、基線力がゼロボルトになるようにします。信号発生器でステップワイズストレッチを実行します。ストレッチが終了したら、ピエゾを使用してミオフィブリルを緩み長さに短くします。

次に、一時停止を押して停止し、データを保存します。ここでは、健康なヒト四頭筋から分離した筋炎を用いた活性力実験の力痕が示されている。ミヒブリブリルは、カルシウム濃度が異なる溶液で5回活性化され、1平方ミリメートル当たり約123ミリニュートンのすべてのミヒブリルの平均最大力を有する。

5つのカルシウム曲線の各々の活性化の間に到達した高原力からの力カルシウム濃度曲線の構築は、最大力生産の50%でカルシウム濃度の計算を可能にする。この代表的な分析で示されるように、myofibrilsは、1つの実験で複数の化合物で処理して、筋線維化のタイプに関する追加の質問に答えることができる。活性力およびサルコメアの長さはまた再開発、活性化および弛緩の率の計算を可能にするために測定することができる。

点線の赤いボックスに示されている急激な上昇は、粘度と弾力性の両方によって引き起こされます。高原は弾性成分に似ています。粘度が直線的に歪みに抵抗するので、歪みの後に低下した力を除去した。

テタグラスを配置するときは、ミオブリルと適切に揃うようにしてください。それ以外の場合、アクティブ化ソリューションが光ファイバとフォースプローブの片持ちレバーの間に入り込んでしまい、データ内でアーティファクトが発生する可能性があります。また、ミオブリルは正常に活性化しない場合があります。

この灌流の方法は、筋線維の種類の筋線維を決定するのにも適している。たとえば、まず通常のカルシウム溶液でミオブリルを浸透させ、その後同じ溶液を灌流し、次に筋線維タイプの力増強化合物を加えることができます。