Name: レポーターアッセイによる細胞ベースのエストロゲン受容体β使用したフィトエストロゲンのスクリーニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 7 s
Description: 学ぼう、エストロゲン受容体βレポーターアッセイを用いたフィトエストロゲンの細胞ベーススクリーニング法。植物食品のエストロゲン活性を評価し、霊長類の生態と進化への理解を深める信頼性の高い手法です。

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著者らは、霊長類植物食品のエストロゲン活性を決定するために一過性トランスフェクションアッセイを使用した最初のトレーニングのためにデール・リートマンに感謝しています。ブラッドフォード・ウェストリッチとC.エリック・ジョンソンが実験室機器の設置を手伝い、抽出方法で学生を訓練してくれたので、ありがとう。最後に、この研究に資金を提供してくれたインディアナ大学に感謝します。

1. 植物材料の製造
<ol><li>凍結乾燥した植物を凍結乾燥剤を使用して新鮮に採取した。<ol>
<li>光からサンプルを保護するために、乾燥プロセスの間にアルミニウムホイルで部屋をカバーしなさい。</li>
		<li>サンプルが完全に乾燥していることを確認するには、チャンバーが触れる寒さを感じなくなるまで凍結乾燥し、重量を量ると材料を植え付け、もはや質量を失いません。</li>
		<li>乾燥した植物を、粉砕するまで光が無い状態で無菌の低残留袋に保管してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>0.85 mmメッシュスクリーンを備えた研削ミルを使用してサンプルを細かく粉砕。<ol>
<li>抽出するまで光がない場合は、地面のサンプルを袋に保管してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>植物二次代謝物の抽出
<ol><li>二次植物代謝物を抽出するために、乾燥したサンプルの1gの割合をHPLCグレードのメタノールの10mLに使用する。<ol>
<li>分析バランスにサンプルを計量し、適切なサイズのエルレンマイヤーフラスコ(125 〜250 mL)に加えます。次に、適切な量のメタノールを加えます。抽出したサンプルの質量を記録します。</li>
		<li>植物メタノール溶液をアルミホイルで覆い、軌道シェーカーで3日間室温(RT)で100rpm速度で回転するように設定し、エストロゲン様化合物をメタノールに溶解させます。</li>
		<li>濾紙(125mm)を用いて上清をドリップ濾過システムにデカントします。</li>
		<li>ロータリーエバポレーターを使用して、サンプルが厚くなるまで植物抽出物を乾燥させますが、300 mLラウンドボトムフラスコで注ぎます。サンプルを50 mL丸底フラスコに注ぎ、少量のメタノールで大きなフラスコをすすいだ。メタノールが完全に蒸発するまで、小さなフラスコでサンプルを乾燥させます。</li>
		<li>分析バランスを使用してサンプル残渣の重量を量る。残渣質量を記録する。</li>
		<li>2 mLのDMSOに0.1gの抽出物の濃度でジメチルスルホキシド(DMSO)で植物抽出物を溶解します。均質化するまで渦。</li>
		<li>植物抽出液-DMSO溶液を4°Cで、アッセイまで琥珀色のガラスバイアルに保管してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>注意:植物は未知の生物学的に活性な化学物質を産生することができ、DMSOは細胞膜を横切ってそれらを輸送できる車両です。これらのサンプルを取り扱う際には、適切な個人用保護具を使用し、注意してください。
3. ヒトエストロゲン受容体βトランスフェクションアッセイ12
注: アッセイプロトコルの 1 日目には、無菌技術とラミナル フロー フードが必要です。
<ol><li>標準曲線に対して17β-エストラジオールの希釈を準備します。<ol>
<li>細胞回収媒体と化合物スクリーニング媒体(CSM)を冷凍庫貯蔵から移し、37°Cの水浴で解凍します。</li>
		<li>マイクロ遠心チューブ中間1および2(INT1、INT2)および1-8をラベル付けします。</li>
		<li>INT1を995 μLのCSM、INT2に615 μLのCSM、チューブ1を900 μLのCSMで、チューブ2-8を600 μLのCSMで充填します。チューブ8を脇に置きます。</li>
		<li>INT1に100 μM 17β-エストラジオールストックの5 μLを移します。チップを破棄します。渦。</li>
		<li>各転送の前に、ピペットを3回リンスし、INT1からINT2に10 μLを移します。チップを破棄します。</li>
		<li>ピペットを3回リンスし、INT2からチューブ1に100 μLを移します。チップを破棄します。チューブ1からチューブ2に300μLを移します。チューブ 3 ~ 7 についても繰り返します。チューブ7から300μLを廃棄して、廃液に入れます。チューブ8はゼロであり、エストラジオールを受け取りません。めっき標準の最終的な濃度は:400、133.3、44.44、14.815、4.938、1.646、0.5487、および0 pMエストラジオールである。</li>
	</ol>
</li>
	<li>サンプル化合物を準備します。<ol>
<li>渦のサンプル。</li>
		<li>DMSOで各植物サンプルの4μLを取り、CSMの496 μLに加えて0.8%のDMSO溶液を得ます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>急速にレポーター細胞を解凍します。<ol>
<li>37°Cの水浴から細胞回収媒体のチューブを取り出します。70%エタノールを用いて外表面を消毒する。</li>
		<li>レポーター細胞を-80°Cの貯蔵から取り出し、凍結細胞のチューブに予め温めたCRMの10 mLを移すことによって解凍します。</li>
		<li>レポーターセルのチューブを閉じ、37°Cの水浴に5〜10分間移動します。</li>
		<li>水浴からレポーター細胞懸濁液のチューブを取り出します。細胞の塊を分解し、均質な懸濁液を生成するために、穏やかに細胞のチューブを数回反転させます。70%エタノールでチューブの表面を洗浄してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>アッセイめっき<ol>
<li>マルチチャンネルピペットを使用して、レポーターセルサスペンションの100 μLを各ウェルに分配します。</li>
		<li>適切なアッセイウェルに三重にサンプルの100 μLを分配します。</li>
		<li>プレートを37°Cに移し、5%CO2インキュベーターを22〜24時間加湿した。</li>
	</ol>
</li>
	<li>暗い冷蔵庫で一晩解凍検出基板と検出バッファーは、2日目の準備をします。</li>
	<li>プレートインキュベーションの終了直前に、冷蔵庫から検出基板と検出バッファーを取り外し、RTに平衡するまで低照度領域に置きます。RTで一度、徹底的にソリューションを混合するために、各チューブを数回穏やかに反転させます。<ol>
<li>インキュベーションが完了する直前に、検出バッファーの内容物全体を検出基板のチューブに注ぎ込み、ルシファーゼ検出試薬を作成します。泡を出さないようにやさしく混ぜます。</li>
		<li>インキュベーションが完了したら、プレートを反転して適切な廃棄物容器に内容を廃棄します。きれいな吸収性のペーパータオルのプレートをそっとタップして、井戸から最後の液滴を取り除きます。</li>
		<li>ルシファーゼ検出試薬を100μLずつ添加します。アッセイプレートをRTで15分間休ませてください。プレートを振らないで下さいます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>96ウェルプレート読み取りルミノ計を使用して、発光を定量化します。</li>
</ol>

<ol><li>Wasserman, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+plant+consumption+predicts+red+colobus+monkey+%28Procolobus+rufomitratus%29+hormonal+state+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Hormones+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">Estrogenic plant consumption predicts red colobus monkey (Procolobus rufomitratus) hormonal state and behavior.</a> Hormones and Behavior. 62 (5), 553-562 (2012).</li>
<li>Wasserman, M. D., Milton, K., Chapman, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+phytoestrogens+in+primate+ecology+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Primatology%22%5BJournal%5D)">The roles of phytoestrogens in primate ecology and evolution.</a> International Journal of Primatology. 34 (5), 861-878 (2013).</li>
<li>DeGabriel, J. L., Moore, B. D., Foley, W. J., Johnson, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+plant+defensive+chemistry+on+nutrient+availability+predict+reproductive+success+in+a+mammal%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology%22%5BJournal%5D)">The effects of plant defensive chemistry on nutrient availability predict reproductive success in a mammal.</a> Ecology. 90 (3), 711-719 (2009).</li>
<li>Wasserman, M. D., Steiniche, T., Després-Einspenner, M. -L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWasserman%2C+MD+%22Primate+Diet+%26+Nutrition%22">Primate Diet & Nutrition</a>. Lambert, J. E., Rothman, J. M. , University of Chicago Press. (2020).</li>
<li>Benavidez, K. M., Chapman, C. A., Leitman, D. C., Harris, T. R., Wasserman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intergroup+variation+in+oestrogenic+plant+consumption+by+black-and-white+colobus+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22African+Journal+of+Ecology%22%5BJournal%5D)">Intergroup variation in oestrogenic plant consumption by black-and-white colobus monkeys.</a> African Journal of Ecology. , (2019).</li>
<li>Bennetts, H. W., Underwood, E. J., Shier, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+breeding+problem+of+sheep+on+subterranean+clover+pastures+in+Western+Australia%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">A specific breeding problem of sheep on subterranean clover pastures in Western Australia.</a> Australian Veterinary Journal. 22 (1), 2-12 (1946).</li>
<li>Tubbs, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenicity+of+captive+southern+white+rhinoceros+diets+and+their+association+with+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Estrogenicity of captive southern white rhinoceros diets and their association with fertility.</a> General and Comparative Endocrinology. 238, 32-38 (2016).</li>
<li>Shen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+the+influences+of+diosgenin+on+aging+ovarian+reserve+and+function+in+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medical+Research%22%5BJournal%5D)">Observation of the influences of diosgenin on aging ovarian reserve and function in a mouse model.</a> European Journal of Medical Research. 22 (1), 42(2017).</li>
<li>Boué, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+estrogenic+effects+of+legume+extracts+containing+phytoestrogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the estrogenic effects of legume extracts containing phytoestrogens.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (8), 2193-2199 (2003).</li>
<li>Klinge, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+interaction+with+estrogen+response+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor interaction with estrogen response elements.</a> Nucleic Acids Research. 29 (14), 2905-2919 (2001).</li>
<li>Nishikawa, J. -i, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+screening+methods+for+chemicals+with+hormonal+activities+using+interaction+of+nuclear+hormone+receptor+with+coactivator%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">New screening methods for chemicals with hormonal activities using interaction of nuclear hormone receptor with coactivator.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 154 (1), 76-83 (1999).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Human+Estrogen+Receptor+Beta+%28ERb%3B+ESR2%3B+NR3A2%29+Reporter+Assay+System%22">Human Estrogen Receptor Beta (ERb; ESR2; NR3A2) Reporter Assay System</a>. , Indigo Biosciences. State College, PA. (2020).</li>
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<li>Whitten, P. L., Patisaul, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-species+and+interassay+comparisons+of+phytoestrogen+action%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Cross-species and interassay comparisons of phytoestrogen action.</a> Environmental Health Perspectives. 109, suppl 1 5-20 (2001).</li>
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<li>Lutz, I., Kloas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphibians+as+a+model+to+study+endocrine+disruptors%3A+I.+Environmental+pollution+and+estrogen+receptor+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+The+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Amphibians as a model to study endocrine disruptors: I. Environmental pollution and estrogen receptor binding.</a> Science of The Total Environment. 225 (1), 49-57 (1999).</li>
<li>Felcyn, J. R., Davis, J. C. C., Tran, L. H., Berude, J. C., Latch, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquatic+Photochemistry+of+Isoflavone+Phytoestrogens%3A+Degradation+Kinetics+and+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Aquatic Photochemistry of Isoflavone Phytoestrogens: Degradation Kinetics and Pathways.</a> Environmental Science & Technology. 46 (12), 6698-6704 (2012).</li>
<li>Jeng, Y. -J., Kochukov, M. Y., Watson, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+estrogen+receptor-alpha-mediated+nongenomic+actions+of+phytoestrogens+in+GH3%2FB6%2FF10+pituitary+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Signaling%22%5BJournal%5D)">Membrane estrogen receptor-alpha-mediated nongenomic actions of phytoestrogens in GH3/B6/F10 pituitary tumor cells.</a> Journal of Molecular Signaling. 4, 2-2 (2009).</li>
<li>Dixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytoestrogens%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Phytoestrogens.</a> Annual Review of Plant Biology. 55, (2004).</li>
<li>Kuiper, G. G. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+Estrogenic+Chemicals+and+Phytoestrogens+with+Estrogen+Receptor+%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Interaction of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen Receptor β.</a> Endocrinology. 139 (10), 4252-4263 (1998).</li>
<li>Wasserman, M. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWasserman%2C+MD+%22Feeding+on+Phytoestrogens%3A+Implications+of+Estrogenic+Plants+for+Primate+Ecology%22">Feeding on Phytoestrogens: Implications of Estrogenic Plants for Primate Ecology</a>. , UC Berkeley. (2011).</li>
<li>Jefferson, W. N., Patisaul, H. B., Williams, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+consequences+of+developmental+phytoestrogen+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Reproductive consequences of developmental phytoestrogen exposure.</a> Reproduction. 143 (3), Cambridge, England. 247-260 (2012).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

個別にスクリーニングする医薬品をスクリーニングするために開発されたERβレポーターアッセイは、ERβを介して生物学的に活性な植物エストロゲンの植物性食品のスクリーニングにも適しています。プロトコルにおける重要な考慮事項は、植物試料を注意して処理することを含む:新鮮な植物材料は、成形または他の生物学的劣化を防ぐために迅速に乾燥する必要があり、化合物18の光分解を防ぐために光から遠ざける必要がある。製造業者が提供するアッセイプロトコル12 は明確であり、スクリーニング目的のために非常に少ない修正を必要とする。このプロトコルでは、製造元が提案する標準曲線が、上部および底面の底面を維持しながら、曲線の指数範囲 (図 1)に入るポイントの数を増やすために変更されています。定量分析にはこのアッセイを用いることが可能ですが、我々の目的は植物を、生物の効果、食物の選択、およびそれらを消費する動物の他の行動に高活性に関連付けることを目的としている。
<p class="jove_content...

植物は、生存、再生、成長、発達、行動に不可欠なカロリーと栄養素を提供する多くの動物にとって必要な食料源です。植物は、独自の成長、ストマチックメンテナンス、および生殖のための適応として、多くの化学物質を生成します。植物二次代謝産物(PSM)とみなされる他の化合物は、毒性が低く、草藻および寄生虫に対する防御として使用される可能性が高いが、あまり明確ではない機能を有する(例えば、アルカロイド、タンニン)2、3。これらの化学物質の中には、内分泌機能などの動物の長期的な生理学的プロセスに影響を与える能力を有するものもありますが、なぜこれらの内分泌活性植物化学物質が脊椎動物内分泌系と相互作用するのかは不明である2,4。
フィトエストロゲンは、最もよく研究された内分泌活性植物化学物質であり、構造的および機能的にエストロゲンを模倣するポリフェノールPSMであり、脊椎動物内分泌系5の低冠下垂体性腺軸と直接相互作用する。ヒトの食事における植物エストロゲンの摂取は、いくつかの癌、心臓病、更年期症状に対する保護に関連しているが、他の効果には不妊の問題が含まれる。実際、これらの化合物の生理学的効果は、羊の不妊が植物エストロゲンが豊富なクローバー(トリフォリウム地下)6に放牧に起因した1940年代に発見された。摂取すると、植物エストロゲンは細胞に渡され、エストロゲンの効果を模倣することができます。植物エストロゲンは羊の生殖能力に悪影響を及ぼしましたが、植物エストロゲンと生理学の関係は単純ではありません。羊のように、南部の白いサイは、大豆とアルファルファの大量に由来する飼料中のエストロゲン化合物に対する感受性を示す。妊娠中にこの食事を与えられた女性の娘は7を再現する可能性が低いです.しかし、他の研究では、古いマウス8における卵巣卵胞の成熟、特定の癌の予防、抗酸化活性、および抗増殖作用9を含む、植物エストロゲンが同様に肯定的な効果を有する可能性があることを示している。
植物エストロゲンの効果の幅は、エストロゲンが成長、発達、および生殖および中枢神経系の調節を含む幅広い生物学的機能に影響を与えることを考えると驚くべきことではない10。多くの作用機序がありますが、植物エストロゲンは、多くの場合、核内エストロゲン受容体αおよびベータ(ERαおよびERβ)のリガンドとして作用する能力を通じてエストロゲンシグナル伝達を修飾、増強、または破壊する能力を有する。多くの植物エストロゲンは、エストロゲン受容体に結合することを可能にするエストロゲンに類似したフェノールリング構造を有する。エストロゲン様に作用するアゴニスト性エストロゲン活性を有するものは、エストロゲン応答要素(ERE)を二量体化して結合し、遺伝子転写をトリガすることができる活性化ERリガンド複合体を形成する。したがって、エストロゲンおよび植物エストロゲンは、転写因子としての作用を通じて細胞活性およびシステム機能を調節する。
ここでは、エストロゲンの生物学的活性を有する化合物の存在に対する植物抽出物をスクリーニングするための細胞ベースのアッセイの新しい使用を提示する。このアッセイは、EREプロモーター12に結合したホタル(ホチヌス・ピラリス)にトランスフェクションされたERβを高発現するように設計された中国のハムスター卵巣CHO細胞を使用する。エストロゲン性化合物が存在すると、それらはERに結合し、二量体化し、EREに結合し、ルシファーゼ遺伝子の転写をもたらす。基質溶液を添加すると、ルシファーゼは光子放出をもたらす反応を触媒する。したがって、正のサンプルは光を生成し、負のサンプルは生成しません。
この市販のアッセイは、レポーター遺伝子とエストロゲン受容体13,14を用いて哺乳動物細胞をトランスフェクトする実験室の必要性を排除する。このアッセイは、植物が受容体結合を介してエストロゲン活性を有するかどうかを迅速かつ単に決定することを可能にする安定したトランスフェクションプラットフォームを提供する。
我々は、大豆が地元の食料品店からのヒト食品を使用してエストロゲンイソフラボン15 の既知の濃度を与えられた他のすべての食品よりも高いエストロゲン活性を有するという仮説をテストする。

<table><tbody><tr><td>1000 &マイクロ;Lピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 &micro;Lピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &micro;Lピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &#176; ウォーターバス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>37 &#176; 加湿5% CO2インキュベーター</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70%エタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>分析バランス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞培養定格層流フード</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>使い捨て培地洗面器、滅菌</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>点滴ろ過システム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>三角フラスコ</td><td></td><td></td><td>125mLおよび250mL</td></tr><tr><td>HPLCグレードのメタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒトER&β;レポーターアッセイシステム、1 x 96ウェルフォーマットアッセイ</td><td>Indigo Biosciences</td><td>IB00411</td><td>Assay kit - 24サンプルと標準曲線</td></tr><tr><td>凍結乾燥機</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>を分析 マルチチャンネルピペット</td><td></td><td></td><td></td></tr>オー<tr><td>ビタルシェーカー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>プレート読み取りルミノメーター</td><td></td><td></td><td>例 Bioteck Synergy HTX</td></tr><tr><td>回転式蒸発器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>丸底フラスコ50</td><td></td><td></td><td>mLおよび300 mL</td></tr>滅菌<tr><td>マイクロ遠心チューブまたは滅菌マルチチャネル培地洗面器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>滅菌チップ</td><td></td><td></td><td>200 & マイクロ;Lおよび1000 & マイクロ;L</td></tr><tr><td>Whatmanグレード1紙</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>の渦巻きパック袋</td><td></td><td></td>滅菌<td>ポリエチレン袋</td></tr></tbody></table>

レポーターアッセイによる細胞ベースのエストロゲン受容体β使用したフィトエストロゲンのスクリーニング

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

植物は多くの動物にとって食料の源であり、何千もの化学物質を生産することができます。これらの化合物のいくつかは、それらを消費する脊椎動物の生理学的プロセスに影響を与えます, 例えば内分泌機能.植物エストロゲンは、最もよく研究された内分泌活性植物化学物質で、脊椎動物内分泌系の視床下部下垂体性腺軸と直接相互作用する。ここでは、エストロゲンの生物学的活性を有する化合物の存在に対する植物抽出物をスクリーニングするための細胞ベースのアッセイの新しい使用を提示する。このアッセイは、エストロゲン受容体ベータ(ERβ)を高発現するように設計された哺乳類細胞を使用し、ルシファーゼ遺伝子を導入したものである。エストロゲン活性を有する化合物への暴露は、光を産生する細胞に生じる。このアッセイは、生物学的エストロゲン活性をテストするための信頼性の高い、簡単な方法です。それは一過性トランスフェクションアッセイ、特に、使いやすさ、細胞の安定性、およびアッセイの感度に対していくつかの改善を有する。

ヒトの食事によく見られる果物や野菜の22の抽出物は、エストロゲン性化合物の存在のためにスクリーニングされました。豆科は植物エストロゲン16の既知の供給源であり、イチジク、日付、トウモロコシ、ニンジン、リンゴ、バナナ、イチゴ、トマト、ケール、キャベツなど、豆類、スノーエンドウ、スナップエンドウなどの豆類を含む様々な食品をアッセイしました。内分泌破壊化合物は、一般的な物質(例えば、プラスチックおよび農薬)に見られ、一部は、ERs17を介して生物学的に活性である。可能であれば、有機性および非有機的に栽培された品目の両方が、エストロゲン活性を有する農薬が結果に影響を与える可能性を考慮してアッセイした。
各植物食品は三重にメッキされ、ルミノメーターは相対光単位(RlUS)で各井戸の活動を報告しました。SRLの背景レベルは標準曲線で決定され、ゼロ濃度で、基準に使用されます。 曲げ活性化値は、曲線上のゼロ点の RLU の上の乗数で、次の式で計算されます。
<p class="jove_cont...

市販のエストロゲン受容体βレポーターアッセイを最適化し、エストロゲン活性に対するヒトおよび非ヒト霊長類食品をスクリーニングしています。我々は、既知のエストロゲンヒト食品大豆が高く登録されているのに対し、他の食品は活性を示さないことを示すことによって、このアッセイを検証した。

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

このアッセイを使用して、植物性食品に植物性ステロイドが含まれているかどうかを評価し、植物の生理学的プロセス、行動、繁殖の成功に影響を与える可能性があります。このアッセイは、植物が生物学的活性を持つエストロゲン化合物を産生するかどうかを判断するためのシンプルで信頼性の高い方法を提供します。この方法は、当初、異種エストロゲン活性を持つ薬剤をスクリーニングし、医療に応用するために開発されました。例えば、細胞増殖を阻害する。私たちは、霊長類の生態と進化についての洞察を提供するために、この技術を使用しています。このアッセイは汚染に非常に敏感であるため、このアッセイを試みる前に、クリーンな環境で無菌技術を使用する練習をすることが重要です。まず、生鮮植物を凍結乾燥機で凍結乾燥させ、次に0.85mmメッシュスクリーンの粉砕機で微粉砕します。粉砕サンプルは、抽出まで暗闇で袋に入れて保管します。植物中の潜在的な植物ステロイドを抽出するには、乾燥サンプルを適切なサイズのフラスコに加え、次にHPLCグレードのメタノールで加えます。植物のメタノール溶液をアルミホイルで覆い、オービタルシェーカーで100RPMで3日間回転するように設定します。3日後、濾紙を使用してスーパーネートをデカントし、ドリップろ過システムに入れます。植物抽出物をロータリーエバポレーターで濃くなるまで乾燥させますが、300ミリリットルの丸底フラスコに注ぎます。サンプルを50ミリリットルのフラスコに注ぎ、大きなフラスコを少量のメタノールですすぎ、メタノールが完全に蒸発するまで小さなフラスコでサンプルを乾燥させます。終了したら、分析天びんを使用してサンプル残渣を秤量し、質量を記録します。植物抽出物をDMSOに0.1グラムの抽出物から2ミリリットルのDMSOの濃度で溶解し、均質化されるまでボルテックスします。DMSOはそれ自体では毒性がありませんが、他の物質が膜を通過できるようにする手段です。私たちの植物に有毒な化学物質が含まれているかどうかはわからないため、すべてが危険であるかのように扱われます。溶液が皮膚に触れないようにし、汚染されている場合は手袋を交換し、厚くてつま先の閉じた靴や白衣を着用してください。サンプルを摂氏4度で琥珀色のガラスバイアルに保管し、使用する準備ができるまで保管します。サンプルをボルテックスし、各サンプルの4マイクロリットルを496マイクロリットルの化合物スクリーニング培地に加えて、0.8%DMSO溶液を生成します。予め加温した細胞回収培地チューブの外面を70%エタノールで消毒し、培地10ミリリットルを凍結レポーター細胞のチューブに移して解凍します。レポーター細胞のチューブを閉じ、摂氏37度の水浴に5〜10分間入れます。ウォーターバスから細胞を回収した後、チューブを数回静かに反転させて細胞の凝集体を分解し、均一な懸濁液を生成してから、チューブの表面を70%エタノールで洗浄します。マルチチャンネルピペットを使用して、100マイクロリットルのレポーター細胞懸濁液を96ウェルプレートの各ウェルに分注し、次に100マイクロリットルのサンプルを適切なウェルに3倍に分けて分注します。プレートを摂氏37度と二酸化炭素5%で22〜24時間インキュベートします。プレートインキュベーションが終了する直前に、検出基質と検出バッファーを冷蔵庫から取り出し、室温まで平衡化するまで暗い場所に置いてから、各チューブを静かに反転させて溶液を混合します。プレートインキュベーションが完了する直前に、検出バッファーの内容物全体を検出基質のチューブに注ぎ、ルシフェラーゼ検出試薬を作製します。泡を作らないようにチューブをやさしく混ぜます。サンプルプレートの内容物を不適切な廃棄物容器に捨て、清潔な吸収性ペーパータオルで軽くたたいて、ウェルから最後の液滴を取り除きます。100マイクロリットルのルシフェラーゼ検出試薬を各ウェルに加え、アッセイプレートを室温で15分間休ませてから、96ウェルプレート読み取りルミノメーターを使用して発光を定量します。人間の食生活によく見られる果物や野菜の22種類の抽出物について、エストロゲン化合物の存在についてスクリーニングしました。エストロゲン活性は、高、中、低、または無活性の序定的な方法で表されます。有機大豆と非有機大豆は高い活性でスクリーニングされましたが、他のすべての果物と野菜の品目は活性がありませんでした。大豆の結果を標準曲線と比較すると、この濃度でエストロゲン活性レベルが高いこともわかります。イソフラボン、ダイゼイン、ゲニステインの既知の強力な供給源である大豆抽出物をさらに使用して、希釈を決定し、最大で50%のシグナルを生成しました。この抽出物は、当社の標準的な希釈プロトコルの半分のシグナルを生成するために、422倍の希釈を必要とします。活性が同定されたサンプルは、質量分析による分析のために送られ、活性化学物質を同定することができます。アンタゴニスト法を使用して、植物性食品に内因性エストロゲンの結合と活性を低下させる化学物質が含まれているかどうかも判断できます。この技術により、霊長類の食生活にエストロゲン性食品がどの程度多く含まれているか、また、アッセイを糞便ホルモン分析やフィールドデータと組み合わせると、植物性エストロゲンの摂取が生理機能や行動にどのように影響するかについての理解を深めることができます。

screening-for-phytoestrogens-using-cell-based-estrogen-receptor

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

このビデオでは、植物由来化合物のエストロゲン活性を決定するための細胞ベースのレポーターアッセイについて説明しています。エストロゲン様活性を持つ化合物は、エストロゲン受容体への結合を模倣し、下流のレポーター酵素遺伝子転写を促進します。レポーター酵素は反応で生物発光を生成し、化合物のエストロゲン活性を示します。...

植物性エストロゲン活性をスクリーニングするためのエストロゲン受容体-レポーター活性アッセイ

エストロゲンとマイクロRNAの両方を介したシグナル伝達分子は、乳がんの発展と成長において重要である。エストロゲンは転写因子であるエストロゲン受容体を活性化する。多くの転写因子は、マイクロRNAの発現を調節することができ、エストロゲン調節マイクロRNAは、異なる大規模な技術を用いてプロファイリングすることができる。...

乳癌細胞におけるエストロゲン調節マイクロRNAのプロファイリング

ゲノムワイドシーケンシング実験とメタボロミクス実験からのデータの統合は課題です。 この論文では、エストラジオールで治療された乳がん細胞からのトランスクリプトーム、シストローム、メタボロームのデータの生成、分析、および統合を初めて報告します。...

乳癌におけるエストロゲン受容体シグナル伝達によって代謝制御のシステムバイオロジー

内分泌撹乱化合物（EDC）は、水生環境に対して実質的なリスクをもたらします。都市廃水処理プラントは地表水のエストロゲン効力に対する主要な貢献者です。このホワイトペーパーで提供方法論は、EDCの除去に関して、廃水処理プロセスの有効性と適合性の評価が可能になります。...

排水処理プロセスの有効性の評価のための化学的および生態毒性メソッドのバッテリーの使用は、エストロゲン効力を削除します

処理された廃水や地表水を含む水サンプルの有機抽出物中の内分泌活性をスクリーニングするためのプロトコルは、市販の分割停止(「凍結融解」)in...

水中の内分泌活性のスクリーニング市販の使い方<em&gt;インビトロ</em&gt;トランスバイオアッセイ

この記事では、パーソナルケア製品 (PCPs) エストロゲン受容体 α (ERα) および/またはベータ版 (ERβ) を結合するリガンドを定量化するための最適化された酵母エストロゲン画面を示します。メソッドには、2 つの比色基板オプション、学部コースで使用するため 6...

学部の教育研究所の酵母エストロゲンの画面に最適化されたを使用して個人的な心配プロダクトのエストロゲンのリガンドを検出

4-ヒドロキシ タモキシフェン-依存性エストロゲン受容体 α リガンド結合ドメイン二量体化アクティビティ哺乳類の 2...

哺乳類 2 ハイブリッド法によるエストロゲン受容体 α リガンド結合ドメインの二量体化活性の検出

臨床的には、閉経期の女性のエストロゲン欠乏は脂質破壊およびアテローム性動脈硬化症の発生率を悪化させる可能性がある。apoE-/-マウスの二重後体横切開を介した両側眼欠法による生体内エストロゲン欠乏モデルを確立した。マウスモデルは閉経後の心血管機能障害の外因性エストロゲン治療のスクリーニングに適用可能である。...

閉経後の心血管機能障害の外因性エストロゲン治療をスクリーニングするためのインビボエストロゲン欠乏マウスモデル

ここに、エストロゲンの効果を検出するためのゼブラフィッシュ胚Tg(vtg1:mCherry)を使用するための詳細なプロトコルが存在する。このプロトコルは、魚の伝播と胚の治療をカバーし、内分泌破壊化合物(EDC)によって誘導される蛍光シグナルの検出、ドキュメンテーション、および評価を強調しています。...

Tg(Vtg1:mcherry)ゼブラフィッシュ胚を用いて内分泌破壊化合物のエストロゲン効果を試験する

この場合の単一分子RNA蛍光蛍光(smFISH)は、単一細胞レベルで特異的なRNAのレベルおよび局在を正確に定量する方法です。ここでは、特定のRNAの単一細胞定量化のためのウェットベンチ処理、イメージングおよび画像解析のための検証済みのラボプロトコルを報告します。...

単一分子FISHによる転写活性アレスの単一細胞解析

学ぼう、エストロゲン受容体βレポーターアッセイを用いたフィトエストロゲンの細胞ベーススクリーニング法。植物食品のエストロゲン活性を評価し、霊長類の生態と進化への理解を深める信頼性の高い手法です。

レポーターアッセイによる細胞ベースのエストロゲン受容体β使用したフィトエストロゲンのスクリーニング

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