レポーターアッセイによる細胞ベースのエストロゲン受容体β使用したフィトエストロゲンのスクリーニング

このアッセイを使用して、植物性食品に植物性ステロイドが含まれているかどうかを評価し、植物の生理学的プロセス、行動、繁殖の成功に影響を与える可能性があります。このアッセイは、植物が生物学的活性を持つエストロゲン化合物を産生するかどうかを判断するためのシンプルで信頼性の高い方法を提供します。この方法は、当初、異種エストロゲン活性を持つ薬剤をスクリーニングし、医療に応用するために開発されました。

例えば、細胞増殖を阻害する。私たちは、霊長類の生態と進化についての洞察を提供するために、この技術を使用しています。このアッセイは汚染に非常に敏感であるため、このアッセイを試みる前に、クリーンな環境で無菌技術を使用する練習をすることが重要です。

まず、生鮮植物を凍結乾燥機で凍結乾燥させ、次に0.85mmメッシュスクリーンの粉砕機で微粉砕します。粉砕サンプルは、抽出まで暗闇で袋に入れて保管します。植物中の潜在的な植物ステロイドを抽出するには、乾燥サンプルを適切なサイズのフラスコに加え、次にHPLCグレードのメタノールで加えます。

植物のメタノール溶液をアルミホイルで覆い、オービタルシェーカーで100RPMで3日間回転するように設定します。3日後、濾紙を使用してスーパーネートをデカントし、ドリップろ過システムに入れます。植物抽出物をロータリーエバポレーターで濃くなるまで乾燥させますが、300ミリリットルの丸底フラスコに注ぎます。

サンプルを50ミリリットルのフラスコに注ぎ、大きなフラスコを少量のメタノールですすぎ、メタノールが完全に蒸発するまで小さなフラスコでサンプルを乾燥させます。終了したら、分析天びんを使用してサンプル残渣を秤量し、質量を記録します。植物抽出物をDMSOに0.1グラムの抽出物から2ミリリットルのDMSOの濃度で溶解し、均質化されるまでボルテックスします。

DMSOはそれ自体では毒性がありませんが、他の物質が膜を通過できるようにする手段です。私たちの植物に有毒な化学物質が含まれているかどうかはわからないため、すべてが危険であるかのように扱われます。溶液が皮膚に触れないようにし、汚染されている場合は手袋を交換し、厚くてつま先の閉じた靴や白衣を着用してください。

サンプルを摂氏4度で琥珀色のガラスバイアルに保管し、使用する準備ができるまで保管します。サンプルをボルテックスし、各サンプルの4マイクロリットルを496マイクロリットルの化合物スクリーニング培地に加えて、0.8%DMSO溶液を生成します。予め加温した細胞回収培地チューブの外面を70%エタノールで消毒し、培地10ミリリットルを凍結レポーター細胞のチューブに移して解凍します。

レポーター細胞のチューブを閉じ、摂氏37度の水浴に5〜10分間入れます。ウォーターバスから細胞を回収した後、チューブを数回静かに反転させて細胞の凝集体を分解し、均一な懸濁液を生成してから、チューブの表面を70%エタノールで洗浄します。マルチチャンネルピペットを使用して、100マイクロリットルのレポーター細胞懸濁液を96ウェルプレートの各ウェルに分注し、次に100マイクロリットルのサンプルを適切なウェルに3倍に分けて分注します。

プレートを摂氏37度と二酸化炭素5%で22〜24時間インキュベートします。プレートインキュベーションが終了する直前に、検出基質と検出バッファーを冷蔵庫から取り出し、室温まで平衡化するまで暗い場所に置いてから、各チューブを静かに反転させて溶液を混合します。プレートインキュベーションが完了する直前に、検出バッファーの内容物全体を検出基質のチューブに注ぎ、ルシフェラーゼ検出試薬を作製します。

泡を作らないようにチューブをやさしく混ぜます。サンプルプレートの内容物を不適切な廃棄物容器に捨て、清潔な吸収性ペーパータオルで軽くたたいて、ウェルから最後の液滴を取り除きます。100マイクロリットルのルシフェラーゼ検出試薬を各ウェルに加え、アッセイプレートを室温で15分間休ませてから、96ウェルプレート読み取りルミノメーターを使用して発光を定量します。

人間の食生活によく見られる果物や野菜の22種類の抽出物について、エストロゲン化合物の存在についてスクリーニングしました。エストロゲン活性は、高、中、低、または無活性の序定的な方法で表されます。有機大豆と非有機大豆は高い活性でスクリーニングされましたが、他のすべての果物と野菜の品目は活性がありませんでした。

大豆の結果を標準曲線と比較すると、この濃度でエストロゲン活性レベルが高いこともわかります。イソフラボン、ダイゼイン、ゲニステインの既知の強力な供給源である大豆抽出物をさらに使用して、希釈を決定し、最大で50%のシグナルを生成しました。この抽出物は、当社の標準的な希釈プロトコルの半分のシグナルを生成するために、422倍の希釈を必要とします。

活性が同定されたサンプルは、質量分析による分析のために送られ、活性化学物質を同定することができます。アンタゴニスト法を使用して、植物性食品に内因性エストロゲンの結合と活性を低下させる化学物質が含まれているかどうかも判断できます。この技術により、霊長類の食生活にエストロゲン性食品がどの程度多く含まれているか、また、アッセイを糞便ホルモン分析やフィールドデータと組み合わせると、植物性エストロゲンの摂取が生理機能や行動にどのように影響するかについての理解を深めることができます。