Name: ヒトドナー後部セグメントにおける眼内圧および頭蓋内圧変調に対するトランスラミナー自律システムモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 学ぶトランスラミナー自律システムを用いた眼内圧および頭蓋内圧の独立制御法。ヒト後部セグメントを用いて緑内障や外傷性脳損傷などの圧力関連疾患の病態メカニズムを解明する革新的なモデルです。

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このプロジェクトの資金は、コリーン・M・マクダウェル博士の裁量的資金を通じて行われました。この研究は、失明を防ぐための研究からUWマディソン眼科視覚科学科への無制限の助成金によって部分的に支えられた。アボット・F・クラーク博士とワイミング・マオ博士が灌流器官培養モデルに関する技術支援をしてくれたことに感謝します。ライオンズ・アイ移植・研究研究所(フロリダ州タンパ)が、人間のドナーの目を提供してくれたことに感謝します。

ヒト組織を含む研究のためにヘルシンキ宣言の規定に従って目を得た。
注:評判の良い眼球バンク(例えば、ライオンズ眼移植研究所、研究センター、タンパFL)からの目は死亡の6〜12時間以内に収穫され、ドナー血清はB型肝炎、C型肝炎、およびヒト免疫不全ウイルス1および2について試験された。彼らが受け取られたら、目は解剖され、24時間以内にTASモデルに設定されました。除外基準には、眼病理学が含まれていた。年齢、人種、性別に基づいて目が除外されませんでした。レティナの生存率を確認するために、組織ドナーからレチンの外植物を採取し、7日および14日間培養した(補足図1)。これらのレチナはまた解光し、RGCマーカー、多発スプライシングを有するRNA結合タンパク質(RBPMS)、ならびにそれらの神経フィラメントにおける正のニューロフィラメント軽鎖(NEFL)染色を有する培養中の健康なGLCを7日間成長させた(補足図2)。.
1. 設備・消耗品の製造・殺菌
<ol><li>必要な供給の完全なリスト、サプライヤー番号、カタログ番号については、 資料表 をご覧ください。</li>
	<li>使用する前に、オートクレーブまたはエチレンオキシドアンプルを使用して、すべての機器や器具を殺菌してください。</li>
</ol>2. 灌流媒体の調製
<ol><li>1%ペニシリンストレプトマイシン(10,000 U/mLペニシリン、0.85%NaClで10,000 μg/mLレンサプトマイシン)、1%L-グルタミン(200mM)を1,000 mLの高グルコースダルベックコのイーグル改変のミディアム(DM)に加えます。</li>
	<li>0.22 μmフィルターを通過して、灌流媒体を殺菌します。</li>
</ol>3. トランスラミナー自律システム(TAS)の設定
<ol><li>流入シリンジ(IOP および ICP リザーバ)を設定します。<ol>
<li>30 mL のシリンジに、30 mL の灌流媒体(セクション 2)を加えます。30 mLのシリンジに3ウェイストップコックを取り付けます。3ウェイストップコックに0.22 μmの親水性フィルターを取り付けます。15 G Luer スタブ アダプターを 0.22 μm 親水性フィルターに取り付けます。</li>
		<li>シリンジの設定から気泡を取り除く。15 G Luer スタブ アダプタにチューブを取り付けます。未発明のユニバーサルロックキャップでストップコックのサイドポートを閉じます。合計 2 つの設定について、この手順を繰り返します。</li>
		<li>1つのシリンジをチャネル1頭蓋内圧(CH1 ICP)、もう一方のシリンジをチャネル2眼圧(CH2 IOP)としてラベル付けする。</li>
	</ol>
</li>
	<li>流出シリンジ(IOP および ICP リザーバ)を設定します。<ol>
<li>30 mL のシリンジに3ウェイストップコックを取り付けます。3ウェイストップコックに15 G Luerスタブアダプタを取り付けます。15 G Luer スタブ アダプタにチューブを取り付けます。</li>
		<li>未発明のユニバーサルロックキャップでストップコックのサイドポートを閉じます。合計 2 つの設定について、この手順を繰り返します。1 つのシリンジを CH1 ICP、もう 1 つのシリンジを CH2 IOP とラベル付けします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 人間の目全体の地球儀の準備
注:目全体が受け取られた場合は、以下の手順に従って、前部セグメントと眼の後部セグメントを分離します。目が二分された場合は、ステップ4.4から始めます。
<ol><li>ポビドネ-ヨウ素溶液に目全体を2分間入れる。</li>
	<li>ステリン酸緩衝液(PBS)で目をすすいで、ポビドネヨウ素をすすい取ります。2回繰り返します。</li>
	<li>鉗子とはさみを使用して、目の地球全体からアドナキサを取り除きます。赤道で目を二分して、眼の前部と後部のセグメントを分離する。</li>
	<li>視神経鞘を取り外します。後部セグメントからビトレウス・ユーモアを除去します。</li>
	<li>必要に応じて後部セグメントから追加のスクレラをトリムし、IOP(下部)チャンバーの円形ドームに適しています。鉗子を使用して、レチナがセグメントの後部に均等に広がっていることを確認します。</li>
	<li>IOP (下部) チャンバーのセットアップ<ol>
<li>視神経が上に向いている円形ドームの上に、TASのIOP(下)室に人間の後部セグメントを置きます。</li>
		<li>エポキシ樹脂Oリングを4本のネジで使用して後部セグメントをシールし、密閉を確保します。</li>
		<li>チューブを IOP (下部) チャンバの IN ポートと OUT ポートに挿入します。チューブを含む媒体を持つIOP流入シリンジがINポートに挿入され、チューブ付きの空のIOP流出シリンジがOUTポートに挿入されます。</li>
		<li>プッシュ/プル方式を使用して、灌流媒体を流入口にゆっくりと注入して後部アイカップを満たす一方で、流出注射器を通して灌流媒体をゆっくりと引き出してラインから気泡を取り除きます。INチューブとOUTチューブの両方が気泡を空隙したら、培地を注入しないでください。</li>
		<li>オフの位置にストップコックをロックします。IOP INポートフィルタアセンブリから30 mLのシリンジを取り出し、合計30 mLの培地で補充します。30 mLのシリンジをフィルターアセンブリに交換します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ICP(上)チャンバーのセットアップ
	<ol>
<li>ICP(上)のチャンバー/蓋を後部セグメントの背面に置きます。視神経が最上部の部屋の中にあることを確認します。4本のネジで上部チャンバーをシールします。</li>
		<li>チューブを ICP(上部)チャンバーの IN ポートと OUT ポートに挿入します。チューブを含む ICP インフロー シリンジは、イン ポートに挿入され、チューブ付きの空の ICP 流出シリンジが OUT ポートに挿入されます。</li>
		<li>ICPチャンバーを充填するために、INポートにゆっくりとゆっくりと注入し、プッシュ/プル法を使用してラインから気泡を除去します。ICPチャンバーとINとOUTの両方のチューブが気泡の空隙になったら、媒体を注入しないでください。</li>
		<li>オフの位置にストップコックをロックします。ポートフィルターアセンブリのICPから30 mLのシリンジを取り出し、合計30 mLの媒体で補充します。30 mLのシリンジをフィルターアセンブリに交換します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. データ記録システムのセットアップ
注:データ記録システムは、8チャンネル電源、マルチチャンネルブリッジアンプ、静水圧トランスデューサ、およびデータ取得ソフトウェアを搭載したコンピュータで構成されています( 材料表を参照)。以下は、システムの設定および調整の方法を説明します。
<ol><li>電源コードを8チャンネル電源の背面に接続し、バッテリバックアップデバイスに接続します。</li>
	<li>8 チャンネルの電源からコンピュータの背面に USB ケーブルを接続します。</li>
	<li>付属のI2Cコードを使用して、8チャンネルの電源をマルチチャンネルブリッジアンプに接続します。</li>
	<li>8 チャンネル電源の前のチャネル入力に、ケーブルの端部にバイオレット ニール・コンセルマン(BNC)ケーブルをマルチチャンネルアンプの背面にある対応するチャネルに接続します。</li>
	<li>トランスデューサケーブルをマルチチャンネルアンプの前面に接続します。</li>
	<li>コンピュータにデータ収集ソフトウェアをインストールします。<ol>
<li>提供されたソフトウェア CD からデータ収集ソフトウェアセットアップインストーラを実行します。</li>
		<li>コンピュータの画面の指示に従います。</li>
		<li>インストールが完了したら、[ 完了] を選択します。</li>
	</ol></li>
	<li>8チャンネルの電源をオンにします。</li>
	<li>コンピュータの電源を入れ、データ収集ソフトウェアを起動します。<ol>
<li>ファイル |の選択新機能。
</li>
		<li>セットアップ |の選択チャンネル設定。3 つのチャンネルを選択します (画面の左下)。チャネルタイトル列で、チャネルの名前を次のように変更します。CH2 IOP;CH3 TLPG (IOP-ICP)。</li>
		<li>すべてのチャンネルの 範囲 として 2 mV を選択します。[ 計算 ]列で、チャンネル1と2の 計算なし を選択します。</li>
		<li>[ 計算 ] 列で、チャネル 3 の [算術] を選択します。[ 式 ] セクションで、 チャネル/CH2 を選択します。 算術 "-" を選択します。 チャンネル/CH1を選択します。 出力 セクションで mmHg を選択します。[ OK] を選択します。もう一度 [OK] を選択します 。</li>
	</ol></li>
	<li>静水圧トランスデューサを設定し、較正します。 注:静水圧トランスデューサは、次の方法を使用して実験する前に較正する必要があります。<ol>
<li>静水圧トランスデューサをマルチチャンネルブリッジアンプに接続されたトランスデューサラインに接続します。</li>
		<li>空気で満たされた30 mLのシリンジをCH1(ICP)圧力トランスデューサの側面ポートに取り付けます。CH1(ICP)圧力トランスデューサの底部にスフィモマノメーターを取り付けます。</li>
		<li>グラフで、データ取得ソフトウェアのページを表示し、サンプリング時間の横にある矢印を左クリックしてサンプリング速度を設定し、 100 を選択します。次に、ページの CH1 (ICP) 領域を右クリックします。</li>
		<li>ブリッジアンプを選択します。[メイン フィルタ] を選択します。ゼロを選択し、圧力トランスデューサを動かさないためにシステムがゼロになるまで待ちます。</li>
		<li>圧力トランスデューサの白いタブをつまみ、40 mmHgが血圧計で得られるまでトランスデューサを通して空気を押します。白いタブを放し、注射器と血圧計を取り外します。</li>
		<li>[ 単位変換] ページで、[マイナス (-)] 記号を選択します。40 mmHg を示す最も高い高原を強調表示します。点 1 の 矢印 をクリックし、40 と入力します。</li>
		<li>0 mmHg を示す最下層をハイライトします。点 2 の 矢印 をクリックし、0 と入力します。単位として mmHg を選択します。[ OK] を選択します。</li>
		<li>[OK](ブリッジアンプページ)を選択します。最高の高原では 100 mmHg、最下層部では 0 を使用して、CH2 (IOP) の場合は手順 9.1 ~ 9.7 を繰り返します。</li>
	</ol></li>
	<li>TAS/後部セグメントユニットをデータ収集システムに接続します。<ol>
<li>TAS/後部セグメントユニットをインキュベーター(37°C、5%CO2)に入れる。OUT ポートから CH1(ICP)圧力トランスデューサに ICP チューブを取り付けます。</li>
		<li>OUT ポートから CH2(IOP)圧力トランスデューサに IOP チューブを取り付けます。</li>
		<li>インポートからリングスタンドに、インディアを使用してシリンジのセットアップ(ICPおよびIOP)を取り付けます。</li>
		<li>[ チャート ビュー ] ページで、[ サンプリングの開始] を選択します。サンプリング時間の横にある矢印を左クリックしてサンプリング速度を設定し、[ 低速 ] および [ 1 分] を選択します。</li>
		<li>リングスタンドのシリンジを上下に調整して、プロトコル要件に合わせてICPおよびIOP圧力を調整します。</li>
		<li>プッシュとプル方式を使用して、システム内の培地の全身補充を48~72時間ごとに行います。</li>
	</ol></li>
</ol>6. データの取得と分析
<ol><li>データ取得ソフトウェアでデータファイルを開きます。</li>
	<li>[ データ パッド] セクションで、[ データ パッドに複数 追加] アイコンをクリックします。新しいウィンドウが表示されます。<ol>
<li>[ 検索方法 ] セクションで、ドロップダウン メニューから [時間 ] を選択します。</li>
		<li>[ 選択 ] セクションで、ドロップダウン メニューから 1 時間 ごとに 1 時間 を選択します。</li>
		<li>[ ステップスルー ] セクションで[ ファイル全体 ]を選択し、[ 追加]をクリックします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>[データ パッド] セクションで、[データ パッド表示] アイコンをクリックします。すべてのデータをハイライト表示し、スプレッドシートにコピー/ペーストします。</li>
	<li>24 時間ごとに IOP、ICP、および TLPG の平均と標準偏差を計算します。スプレッドシート プログラムおよびグラフでピボットテーブル オプションを使用してデータを照合します。</li>
</ol>7. 後部セグメントの免疫染色とヘマトキシリンとエオシン染色
<ol><li>TASモデルから様々なタイムポイントに続く後眼部を取り除き、パラフィンをする前にホルマリンで固定します。</li>
	<li>目を切って矢状組織面を作り出す。</li>
	<li>パラフィン埋め込みセグメントを100%キシレン、95%エタノール、50%エタノール溶液でデパラフィン化します。</li>
	<li>PBSでスライドを10分間洗浄し、1時間室温でブロッキングバッファでブロックします。</li>
	<li>一次抗体を有する標識切片:抗コラーゲンIV(細胞外マトリックス(ECM)マーカー、NB120-6586、1:100)および抗ラミニン(ECMマーカー、NB300-144、1:100、抗RBPMS(RGCマーカー)、GTX118619、1:50)。</li>
	<li>Alexa Fluor二次抗体を用いて一次抗体を検出する(アレクサフルオール488ヤギ抗ウサギ、A11008、1:500)。</li>
	<li>DAPI抗フェード溶液を用いて細胞核に対抗する。</li>
	<li>蛍光顕微鏡を使用して、4xおよび10x対物レンズで染色されたセクションと位相画像の画像をキャプチャします( 材料表を参照)。</li>
	<li>ヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)染色の場合、100%、キシレン95%エタノール、50%エタノール溶液およびH&Eとの染色を使用して、デパラフィン化のための自動染色システム( 材料表を参照)でセクションを処理します。</li>
	<li>明視野光源を持つ顕微鏡を使用して、4xと10x対物レンズで画像をキャプチャします。</li>
</ol>

原稿の著者は、開示する潜在的な利益相反を持っていません。

ヒト死後組織は、動物モデルで開発された潜在的な薬物の同定がヒト47に翻訳可能である必要があるため、ヒト神経変性疾患を研究するための特に貴重なリソースである。ヒトIOP上昇の効果は確立されているが、異常なONH経層圧変化に対して最小限の研究が行われている。複数の動物モデルとヒトONHの有限モデリングが存在するにもかかわらず、経層圧変化41,54,55,56,57を研究するex vivo人体モデルはありません。IOPとICPを使用して疾患病因を標的とし、緑内障病原論に関連する様々な病原性パラダイムを同定できる新しい前臨床ヒトモデルに対する現在のアンメットニーズが存在する。ONHにおける圧力関連の病理学的変化を理解することは、RGC死亡を防ぐために重要である。TASモデル内...

最近の調査の世界的な推計によると、2億8,500万人が視覚障害を持ち、そのうち3,900万人が視覚障害を持っています1。2010年、世界保健機関(WHO)は、目の後部セグメントに記載されている9つの主要な失明原因のうちの3つが発生することを文書化しました。後部眼疾患は、レチナ、脈絡膜、視神経2を含む。レティナと視神経は脳の中枢神経系(CNS)の拡張である。眼球神経節細胞(RGC)軸索は視神経を通って眼を出て視神経を形成するため損傷を受けやすい3。ONHは、ラミネラクリプロサ(LC)4と呼ばれる結合組織ビームの3Dメッシュワークのために、RGC軸索にとって最も脆弱な点であり続けます。ONHは緑内障5,6,7のRGC軸索に対する侮辱の初期部位であり、ONH内の遺伝子発現変化は眼圧および緑内障モデル8,9,10で研究されている。RGC軸索は、眼内圧(IOP)と呼ばれる眼内区画間の圧力差と、頭蓋内圧(ICP)11と呼ばれる眼内膜膜下腔内の圧力差のためにONHで感受性を有する。LC領域は両方の領域を分離し、通常の圧力差を維持し、IOPは10~21mmHg、ICPは5~15mmHg12の範囲です。2つのチャンバー間の層間の圧力差は、経層圧勾配(TLPG)13と呼ばれる。緑内障の主な危険因子は、IOP14の上昇である。
IOPが増加すると、層内および層領域全体の歪が増加する6,15,16。ヒトおよび動物モデルにおける実験的観測は、軸索損傷の初期部位であるONHを17,18個としている。ONHで緑内障損傷を引き起こすIOP関連ストレスおよびひずみの生体力学的パラダイムは、緑内障19,20,21の病態生理学にも影響を及ぼす。ヒトの圧力誘発変化が機械的にRGC軸索22に損傷を与えるにもかかわらず、薄層内にコラーゲン状のプレートを欠いているげっ歯類も緑内障7,23を発症する可能性がある。さらに、IOPの上昇は、一次開放的な角緑内障患者の最も顕著な危険因子であり、正常な緊張緑内障患者はIOPが上昇しなくても緑内障の視神経障害を発症する。さらに、視神経損傷を示さない眼圧症患者のサブセットもあります。また、脳脊髄液圧(CSFp)が緑内障の病態に役割を果たす可能性も示唆されている。この証拠は、緑内障患者では正常な個体に比べてICPが〜5mmHgに低下し、それによって経層圧の上昇を引き起こし、疾患24,25において重要な役割を果たすことを示している。以前は、イヌモデルで、IOPおよびCSFpの変化を制御することによって、視ディスク26の大きな変位が存在することが実証された。ブタの目にCSFpを上昇させることはまた、LC領域およびレトロ層神経組織内の増加した主な緊張を示している。RgcsとLC領域への負担の増加は、軸索輸送の閉塞およびRGCs27の損失に寄与します。RGCの進行性変性は、栄養性サポート28,29の喪失、炎症過程/免疫調節30,31の刺激、およびアポトーシスエフェクター29,32,33,34,35と関連している。さらに、軸索損傷(図3)は、RGCに有害な影響を及ぼし、回生障害36,37,38,39を引き起こします。IOPの効果はよく研究されているにもかかわらず、異常な経層圧変化に対して最小限の研究が行われてきた。緑内障のほとんどの治療法は、IOPの安定化に焦点を当てています。しかし、IOPの低下は病気の進行を遅らせるが、視野の喪失を逆転させ、RGCの完全な喪失を防ぐものではない。
現在の証拠は、外傷性または神経変性視覚障害に苦しむ患者の様々な機械的、生物学的、または生理学的変化による経層圧調節が重大な視力低下を引き起こす可能性があることを示している。現在、元生体内ヒトONH内の緑内生体損傷の研究を可能にする真の前臨床ヒト後部セグメントモデルは存在しない。眼科27では眼の後部の観察と治療は大きな課題です。後眼を標的とする物理的および生物学的障壁は、高い排除率、血液性バリア、および潜在的な免疫学的応答40を含む。新しい薬剤標的に対するほとんどの有効性および安全性試験は、生体外細胞および生体内動物モデル41を利用して達成される。眼の解剖学は複雑であり、インビトロ研究は組織モデルシステムによって提示される解剖学的および生理的障壁を正確に模倣しない。動物モデルは薬物動態学的研究の必需品ですが、ヒト後眼の眼生理は、眼の細胞構造、脈管系、ONH41,42など様々な動物種によって異なる可能性があります。
生きている動物の使用は、集中的かつ詳細な倫理規則、高い財政的コミットメント、および効果的な再現性43を必要とします。最近、実験研究における動物の倫理的使用に関する他のガイドライン44,45,46が制定されました。動物実験の代わりに、病気の病因を調査し、ONHの損傷を保護するための薬物の潜在的な分析を調査するために、ex vivoヒトの目のモデルを使用しています。ヒト死後組織は、ヒト疾患パラダイム、特にヒト神経変性疾患の場合、動物モデルで開発された潜在的な薬物の同定にはヒト47に翻訳可能である必要があるため、ヒト疾患パラダイムを研究するための貴重なリソースである。このエクスビボヒトドナー組織は、ヒト障害47,48,49の研究に広く利用されており、ヒト前セグメント灌流器官培養系は以前、IOP50,51,52の上昇の病態生理学を研究するユニークなex vivoモデルを提供してきました。
ヒトの目のIOPとICPに関連する経層圧を研究するために、我々は、ヒトドナーの眼の後部セグメントを用いてIOPとICPを独立して調節できる2室のトランスラミナー自律システム(TAS)の設計と開発に成功した。これは、経層圧を研究し、ONHに対するTLPGの生体力学的効果を利用する最初のex vivoヒトモデルです。
このex vivoヒトTASモデルは、IOPまたはICPの慢性的な上昇のために起こる細胞および機能性の修飾を発見し、分類するために使用することができる。本レポートでは、TASヒト後部セグメントモデルの解剖、設定、モニタリングのステップバイステップのプロトコルについて詳述する。このプロトコルは、他の研究者が生体機械疾患の病因を研究するために、この新しいex vivo加圧ヒト後部セグメントモデルを効果的に再現することを可能にする。

<table><tbody><tr><td>#122、1-1 / 8 "内側x 1-5 / 16"外側直径、バイトンOリング、3/32 "厚さ、 755デュロメーター50パック</td><td>アマゾン</td><td>B07DRGPPZJ</td><td></td></tr><tr><td>114ブナ-N Oリング、70Aデュロメーター、ブラック、5/8 "ID、13/16 "OD、3/32"幅(100個入り)</td><td>アマゾン</td><td>B000FMYRHK</td><td></td></tr><tr>針バイ<td>タリティメディカル</td><td>302832</td><td></td><td></td></tr><tr><td>なしの30mLシリンジ3ウェイストップコック、2メスルアーロック、スイベルオスルアーロック、ベントキャップ</td><td>QOSINA</td><td>2C6201</td><td></td></tr><tr><td>4-40 X 1/2 PH PAN MS SS / CHROME&適切なサイズのプラス</td><td>ドライバーBrikksenステンレス鋼ファスナー</td><td>PPMSSSCH4C.5</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ANPROLENE 16 LARGE AMPULE</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9085343</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Purdue</td><td>PUR1815001EACH</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Corning 100 x 20mm 組織培養処理ディッシュ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167-100EA</td><td>&nbsp;</ストロング></td></tr><tr><td>コーニング&nbsp;L-グルタミン溶液</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>MT25005CI</td><td></td></tr><tr><td>Covidien 3033 キュリティ ガーゼ スポンジ、4インチ x 4インチ、12層、滅菌、1200/CS</td><td>Med Plus Medical Supply</td><td>COV-3033-CS</td><td></td></tr><tr><td>ドレッシング鉗子 繊細な湾曲 (鋸歯状)</td> <td>Katena</td><td>K5-4010</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 - ファイン フォーセプス</td><td>F.S.T.</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>アイハサミ 標準湾曲</td><td>カテナ</td><td>K4-7410</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン 150 x 15mm プレーン 滅菌 使い捨てペトリ皿</td><td>キャピトル サイエンティフィ</td>ック <td>351058</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド 4 オンス 標本容器</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>16-320-730</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド インスタント シーリング 滅菌ポーチ</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>01-812-54</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランドインスタントシーリング滅菌ポーチ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>01-812-55</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランドインスタントシーリング滅菌ポーチ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>01-812-58</td><td></td></tr><tr><td>ハイクローンダルベッコのモディファイドイーグルス ミディアム</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>SH3024302</td><td></td></tr><tr><td>ハイクローンペニシリンストレプトマイシン100Xソリューション</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>メス ルアー ロック インレット、オス ルアー スリップ アウトレット、ブルーおよびクリア</td><td>Qosina</td><td>28217</td><td></td></tr><tr><td>静水圧トランスデューサ、DELTRAN &reg;II、カタログ#DPT-200、3CC / HR流量AD</td><td>機器</td><td>DPT-200</td><td></td></tr><tr><td>JG15-0.5HPX 15ゲージ0.5 "NTプレミアムシリーズディスペンシングチップ50 /ボックス</td><td>ジェンソングローバル</td><td>JG15-0.5HPX 15</td><td></td></tr><tr><td>キーエンスB2?X710</td>顕微鏡 <td>キーエンス</td><td>B2-X710</td><td></td></tr><tr><td>LabChart 8</td><td>AD機器</td><td>LabChart 8</td><td></td></tr><tr><td>ライカST5020 マルチステナー</td><td>ライカ</td><td>ST5020</td><td></td></tr><tr><td>ノンベントユニバーサルルアーロックキャップ、ホワイト</td><td>QOSINA</td><td>65811</td><td></td></tr><tr><td>オクタルブリッジアンプ (モデル#FE228)</td><td>ADインスツルメンツ</td><td>FE228</td><td></td></tr><tr><td>Pharmco Products エチルアルコール、200プルーフ</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1675398</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Solution (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 8/35 (Model # PL3508)</td><td>AD instruments</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>Push-to-Connect Tube Fitting for Air and Water&nbsp;ストレートアダプター、1/8インチチューブ外径x 1/8 NPTオス</td><td>McMAster-Carr</td><td>7880T113</td><td></td></tr><tr><td>ユニバーサルスレッド付きプッシュツーコネクトチューブフィッティング&nbsp;空気と水、アダプター、1/8 インチ チューブ外径 x 1/8 パイプ</td><td>McMAster-Carr</td><td>51235K101</td><td></td></tr><tr><td>サンゴバン タイゴン S3 E-3603 フレキシブル チューブ 500 フィート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-171-268</td><td></td></tr><tr><td>スーパーブロックT20</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>PI37536</td><td></td></tr><tr><td>外科用ハサミ-シャープブラント</td><td>FST</td><td>14001-14</td><td></td></tr><tr><td>組織鉗子繊細な1x2歯湾曲</td><td>Katena</td><td>K5-4110</td><td></td></tr>トランス<tr><td>ラミナ自律システム(TAS)</td><td>ノーステキサス大学健康科学センターN</td><td>/ A</td><td></td></tr><tr><td>米国サイズ030OリングBuna-N、B1000、70デュロメータ、ブラック、Buna-N (NBR、ニトリル、ブナ)</td><td>マルコラバー&プラスチック</td><td>B1000-030</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒトドナー後部セグメントにおける眼内圧および頭蓋内圧変調に対するトランスラミナー自律システムモデル

Translaminar Autonomous System Model for the Modulation of Intraocular and Intracranial Pressure in Human Donor Posterior Segments

緑内障病原性に関連する様々な病原性パラダイムを同定できる頭蓋内圧(ICP)および眼内圧(IOP)を用いて、疾患の病因を標的とすることができる新しい前臨床ヒトモデルに対する現在のアンメットニーズがある。エキビボヒト前部灌流器官培養モデルは、緑内障の病態の発見および治療薬の試験に有効な技術として、これまで利用され、応用されてきた。前臨床薬物スクリーニングおよびヒト臓器系の前臨床研究は、臨床研究により翻訳可能である。本稿では、トランスラミナー自律システム(TAS)と呼ばれる新しいex vivoヒト経層圧モデルの生成と動作について詳細に説明する。TASモデルは、ヒトドナー後部セグメントを使用して、ICPとIOPを独立して規制することができます。このモデルは、前臨床的な方法で病因を研究することを可能にする。それは眼科の研究で生きている動物の使用を減らすことができます。.インビトロ実験モデルとは対照的に、視神経ヘッド(ONH)組織構造、複雑性、完全性もex vivo TASモデル内で維持することができます。

トランスラミナー自律システムの設計と作成 トランスラミナー圧差は、緑内障を含む様々な疾患の病因における潜在的な重要なメカニズムである。記載されたモデルの用途には、緑内障(IOPの上昇、ICPの低下)、外傷性脳損傷(高いICP)、微小重力関連視覚障害(ICPの上昇、IOPの上昇)への長期暴露の研究が挙げられるが、これらに限定されない。ヒトの眼の経層圧を標的とする分子病原体を発見するために、TASモデルを設計、作成、検証しました。我々の新しいex vivoヒトモデルは、ICPおよびIOP関連病原性変化を独立して研究するユニークな前臨床システムを提供する。ヒトの前臨床応用に取り組むために、我々のモデルは経層圧変化による病因を研究するex vivoパラダイムを提供する。シールされたモデル設計は、すべての流入ポートと流出ポートを示すモデルの詳細な図示図と、平面正面および透明ビュー(図1A、 1B)で描かれています(図1C)。実際の3Dプリントモデルにおける...

トランスラミナー自律システムの使用について説明し、詳細を説明する。このシステムは、ヒト後部セグメントを利用して、セグメント内の圧力(眼内)および周囲の視神経(頭蓋内)を独立して調節し、緑内障視神経障害の特徴を模倣する経層圧勾配を生成する。

There is a current unmet need for a new preclinical human model that can target disease etiology ex vivo using intracranial pressure (ICP) and intraocular ...

この新しい眼の経層自律システムは、人間の後部セグメントを使用して、眼内圧と頭蓋内圧を独立して調節し、経層圧勾配を生成します。TASモデルにより、これまで研究できなかったヒト頭蓋内圧をex vivoの前臨床的な方法で評価することができます。このモデルは、緑内障、外傷性脳損傷、特発性頭蓋内圧亢進症、宇宙飛行関連神経眼症候群などの疾患の研究に使用できる可能性があります。流入シリンジをセットアップするには、30ミリリットルのシリンジに目的の30ミリリットルの灌流液をロードし、シリンジに3方向ストップコックを取り付けます。ストップコックに0.22μmの親水性フィルターを、0.22μmの親水フィルターに15gのルアースタブアダプターを装着します。シリンジのセットアップから気泡を取り除いた後、チューブをルアースタブアダプターに取り付け、通気孔のないユニバーサルロックキャップでストップコックのサイドポートを閉じます。先ほど示したように 2 つ目のインフローシリンジを設定した後、1 つのシリンジチャネルに 1 つの ICP をラベルし、もう 1 つのシリンジチャネルに 2 つの IOP をラベルします。次に、示したようにアウトフローシリンジをセットアップしますが、シリンジに輸液を装填しません。ヒトの全眼球サンプルを調製するには、視神経鞘を取り外し、後部セグメントから硝子体液を取り除きます。IOPチャンバーの丸いドームにしっかりとフィットするように、必要に応じて後部セグメントから追加の強膜をトリミングし、鉗子を使用して網膜がセグメントの人間の後部に均等に広がるようにします。次に、視神経を上に向けて丸いドームの上のTASのIOPチャンバーにセグメントを配置し、エポキシ樹脂のOリングと4本のネジを使用して後セグメントをシールします。IOPチャンバーをセットアップするには、チューブをチャンバーのインポートとアウトポートに挿入し、IOPインフローシリンジをインポートに挿入します。空のIOPアウトフローシリンジセットアップをアウトポートに挿入し、プッシュ/プル方式を使用して灌流媒体を流入ポートにゆっくりと注入して後眼カップを満たし、同時に流出シリンジを介して灌流媒体をゆっくりと引き出して、ラインから気泡を取り除きます。インチューブとアウトチューブの両方に気泡がなくなったら、注入を停止し、ストップコックをオフの位置にロックします。ポートフィルターアセンブリのIOPからシリンジを取り外し、シリンジに追加で30ミリメートルの培地を補充してから、シリンジセットアップをフィルターアセンブリに再挿入します。ICPチャンバーをセットアップするには、視神経が上部チャンバー内にあるように注意しながら、チャンバーを後部セグメントの背面に置き、上部チャンバーを4本のネジで密閉してから、チューブをICPチャンバーの入出力ポートに挿入し、ICP入力シリンジをインポートに挿入します。 空のICPアウトフローシリンジを出力ポートに送り込み、示したようにシステムを培地で洗い流します。データ集録システムを設定するには、8チャンネル電源とコンピュータの電源を入れ、データ集録ソフトウェアを起動します。[ファイル] と [新規] を選択し、[設定] と [チャネル設定] を選択します。3 つのチャネルを選択し、示されているようにチャネルの名前を変更します。すべてのチャネルの場合は[範囲]に2ミリボルトを選択し、[計算]列でチャネル1と2の[計算なし]を選択します。「Formula」ウィンドウの「Channels」で「Ch 2」を選択します。[関数] で [数学] と [マイナス] を選択し、[チャネル] で [Ch 1] を選択します。静水圧トランスデューサをセットアップおよび校正するには、静水圧トランスデューサをマルチチャネルブリッジアンプに取り付けられたトランスデューサラインに接続し、空の30ミリリットルシリンジをチャネル1 ICP圧力トランスデューサのサイドポートに取り付けます。チャネル1 ICP圧力トランスデューサの下部に血圧計を取り付け、サンプリング時間の横にある矢印をクリックしてサンプリング速度を100に設定します。ブリッジを選択します Amp、メインフィルター、およびゼロ、および圧力トランスデューサーを動かさないように注意しながら、システムがゼロになるのを待ちます。次に、圧力トランスデューサの白いタブをつまんで、血圧計で40ミリメートルの水銀が得られるまでトランスデューサーに空気を押し込み、次に白いタブを放してシリンジと血圧計を取り外します。[単位変換] ページで、[マイナス] を選択し、40 ミリメートルの水銀柱を示す最も高いプラトーを強調表示します。0.1 の矢印をクリックして 100 と入力し、水銀柱 0 ミリメートルを示す最も低いプラトーをハイライト表示します。0.2 の矢印をクリックし、ゼロを入力して、単位にミリメートル水銀柱を選択し、[OK] をクリックします。[Bridge Amp] ウィンドウで [Okay] をクリックし、先ほど示したように、チャネル 2 の IOP の静水圧トランスデューサをキャリブレーションします。これは、最も高いプラトーには 100 ミリメートルの水銀、最も低いプラトーには 0 ミリメートルです。TAS後セグメントユニットをデータ収集システムに接続するには、TAS後セグメントユニットを摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターに置き、チャネル1のICP圧力トランスデューサの出力ポートからICPチューブを取り付けます。出力ポートからのIOPチューブをチャネル2IOP圧力トランスデューサーに取り付けます。[チャート ビュー] ページで [サンプリングの開始] を選択し、サンプリング速度を [低速] と 1 分に設定します。次に、リングスタンドのシリンジを上下に調整して、プロトコルの要件に従ってICPおよびIOP圧力を調整するか、圧力を調整するために灌流ポンプに置きます。この代表的な分析では、両方のチャンバーの平均常圧差の維持が、IOPおよびICP条件のさまざまなパラメーターを通じてテストされました。組織の生存率を確保するために、組織内の培地を48時間ごとに交換しました。培地交換時に最小限の圧力上昇が起こり、免疫組織化学分析および実験の14日目と30日目のコラーゲンIV発現によって観察された視神経乳頭の生存率または形態に影響を与えませんでした。さまざまな時点で IOP を増加させたり、ICP を減少させたりすると、上昇した層間圧力勾配の範囲を 7 日間維持できます。7日間の経層圧力勾配の上昇では、後部セグメントでカッピングと肥厚が観察され、コラーゲンIVの発現は、実験期間中にシグナル発現が増加したビームの肥厚を示しています。位相イメージングでは、神経節細胞層内の健康な網膜神経節細胞が明らかになり、対照セグメントにカッピングがなく、一方、高濃度の層間圧勾配培養からの画像は、網膜神経線維層内に網膜神経節細胞が残らず、余分な細胞マトリックスのリモデリングが増加した広範なカッピングを示します。この技術により、研究者は生体力学的疾患のパラダイムを効果的に研究し、ヒトの眼における分子病因を標的とする層間圧を発見することができます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

出典:Sharma, T. P., et al., Translaminar Autonomous System Model for the Modulation of Intraocular and Intracranial Pressure in Human Donor Posterior Segments.J. Vis. Exp.

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学ぶトランスラミナー自律システムを用いた眼内圧および頭蓋内圧の独立制御法。ヒト後部セグメントを用いて緑内障や外傷性脳損傷などの圧力関連疾患の病態メカニズムを解明する革新的なモデルです。

ヒトドナー後部セグメントにおける眼内圧および頭蓋内圧変調に対するトランスラミナー自律システムモデル

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