新しい切除された乳癌腫瘍のテラヘルツ画像化と特性化プロトコル

このプロトコルは、テラヘルツイメージングと分光法を使用して、乳房腫瘍の外科的マージンを評価し、2回目の手術の必要性を大幅に減らすことを目的としています。テラヘルツイメージングは、非電離および生物学的に安全な方法で、それらの光学特性に基づいて癌性組織と非癌性組織を区別するために使用することができる。この技術は乳がんマージン評価のために開発されましたが、外科的切除とマージン評価を必要とする他の固形腫瘍にも適用可能です。

この方法は、物理的なスライスを必要とせずにFFPE組織ブロックの内部をイメージングすることを可能にし、正確な任意の深さで腫瘍マージンの同定を容易にする。このプロトコルでは、組織処理やステージバランスなどの重要なステップのパフォーマンスが必要であり、視覚的なデモンストレーションなしでは理解が難しくなります。バイオハザードバッグで組織カバーステンレス鋼の金属トレイを取り扱う前に、カバーされたトレイの手の届くところに適切なラボ材料のすべてを置きます。

次に、新鮮な腫瘍サンプルをトレイのシャーレに移し、グロス検査を使用して、十分に平らで、血液がほとんどなく、血管が少ない腫瘍の側面を選択します。次に、1種のフィルターペーパーに画像化する側を置いて過剰な需要媒体を除去し、液体または分泌物の組織をクリアし、紙が飽和するにつれて腫瘍を乾燥した場所に再配置する。腫瘍を5分間乾燥させながら、厚さ1.2ミリメートルのポリスチレンプレートを直径約37ミリメートル以内のスキャンウィンドウに置き、スキャンウィンドウとポリスチレンプレートをテラヘルツイメージャーのサンプルステージに置きます。

メインウィンドウで固定点スキャンアイコンをクリックしてテラヘルツアンテナをアクティブにし、ポリスチレンプレート上の単一点から反射したテラヘルツ信号の送受信を開始します。モーターステージダイアログアイコンをクリックします。モーターコントロールウィンドウが開きます。

メインウィンドウのポリスチレンからの反射パルスを中央に配置するには、光遅延軸矢印をクリックして、光遅延軸を調整します。[データ取得設定] ボタンをクリックして [データ取得設定] ダイアログ ウィンドウを開き、光遅延値を 5 ~ 4 ボルトに変更します。マイクロメートルスケールで走査ステージの垂直位置を調整し、最小の二次パルスが最も強くなるまで、モータ制御ウィンドウ内の軸を光遅延に調整して、測定される反射信号の範囲外に一次反射を配置する。

サンプルステージを平準化して基準信号を記録するには、モーター制御ダイアログボタンをクリックしてモーター制御ウィンドウを開き、モータの位置を調整しながらタイムドメイン信号が表示されるようにモーター制御ウィンドウとメインソフトウェアウィンドウを再配置します。モーターコントロールウィンドウで次の手順を使用してA軸を平準化するには、x軸の値をゼロから負の10に変更し、Enterキーを押します。ステージはA軸のマイナス10ミリメートルの位置に移動し、信号位置のシフトはメインウィンドウで観察されます。

調整可能なマイクロメートルスケールを使用して、信号の最小ピークを前の垂直位置に戻し、A軸の値をプラス10に変更します。[入力] をクリックします。ステージはA軸上のプラス10ミリメートルの位置に移動し、信号のシフトが再び観察されます。

信号が前の位置から移動し、A 軸の値をマイナス 10 に戻した方向と距離に注意してください。信号は元の垂直位置に戻ります。スキャンステージのA軸でレベリングねじを回転させ、信号をシフトして同じ方向に距離を2倍にし、ステージは元の位置から移動します。

スキャンステージのマイクロメーターを使用して信号を元の位置に戻し、プラス10とマイナス10の信号が両方の位置のピークで等しくなるまで調整を繰り返します。A 軸の平準化が完了したら、A 軸の値をゼロに変更し、B 軸についても同じ手順を繰り返します。両方の軸が平準化されたら、A軸とB軸の両方をゼロミリメートルに戻し、モーターコントロールウィンドウを囲み、信号が少しずれた場合に備えて信号が元の位置にあることを確認します。

このシグナルを「データ収集プロパティー」ウィンドウの参照として記録するには、平均値を 5 に変更し、その他のすべてのパラメーターをデフォルト設定のままにします。次に、[新しい参照] をクリックします。平均化カウンターは 0 から 20 までカウントされます。

カウンタが 20 に達したら、平均値を 1 に変更し、[OK] をクリックします。ポリスチレンからの反射信号は、後続のスキャンの基準として保存されます。すべてのパラメータが設定されたら、スキャン段階から組織処理領域にイメージングウィンドウを移し、ポリスチレンプレートに腫瘍を取り付けます。ピンセットで腫瘍内の気泡を取り除くか、空気の隙間が最小限になるまでサンプルをポリスチレンにそっとロールします。

吸収性スペーサーを試験試料の周りに一定間隔で配置し、腫瘍の上に別のポリスチレンプレートを置きます。腫瘍表面をできるだけ平らに静かに押し、サンプルウィンドウ内の腫瘍とポリスチレンプレート配置をテープダウンします。平らな組織表面とポリスチレンプレートとの良好な接触は、気泡、過剰な流体および不均一な表面が腫瘍組織イメージングを台無しにする可能性があるとして不可欠です。

サンプルウィンドウを反転し、腫瘍の写真を撮って、その向きを記録します。サンプル ウィンドウをスキャン 段階に戻し、イメージ パラメーター ダイアログ ボタンをクリックして、画像取得パラメーター ウィンドウを開きます。軸の最小値を1つ、軸1最大値、軸2最小値、軸2最大値を設定し、画像化ウィンドウ内で腫瘍の位置を完全に囲む。

撮像スキャンの場合は、軸を1ステップ、軸2ステップを0.2ミリメートルに設定します。次に、[計測] メニューの [Flyback 2D スキャン] を選択し、ポップアップ ウィンドウにスキャン データを保存するフォルダとファイル名を作成します。この分析では、左乳房乳房切除手術を介して49歳の女性から得られたグレード1〜2の浸潤性乳管癌を評価した。

テラヘルツ像を病理画像と相関させると、癌領域が脂肪領域よりも高い反射を示すことが明らかであった。断層画像法は、周波数が増加するにつれて、脂肪ピクセルの癌の計算された吸収係数値が増加し、両方の周波数で脂肪よりも高い値を示す癌ピクセルが増加することを明らかにした。これに対し、両組織の屈折率は、周波数が増加するにつれて減少した。

同一腫瘍の透過分光分析は、腫瘍から抽出された両切片の抽出吸収係数および屈折率の両方の周波数範囲に対する良好な一致を明らかにする。なお、組織の取り扱いが不十分であると、誤解を招く画像化結果を招き、例えば未乾燥腫瘍試料内に過剰な液体が存在することによる腫瘍における癌のより大きな存在を示唆する結果となる。追加の特性評価は、Terahertz画像データに対して行われ、組織の周波数依存性に関する情報を取得し、かつ、自動画像セグメンテーションのために統計解析を行うことができる。

この技術は、その際の管癌のシグネチャを調べるための画像化および分光法アルゴリズムの開発につながり、低グレード腫瘍を致命的な高グレード腫瘍と区別する。癌組織とホルマリン溶液を慎重に処理し、腫瘍組織に接触するシステム要素またはツールを適切に洗浄または廃棄する必要があることを覚えておいてください。