Name: 変形性関節症モデルにおけるマウス脾臓、骨髄、リンパ節および滑膜組織における免疫細胞サブセットのフローサイトメトリー解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: 学ぶ マウス脾臓・骨髄・リンパ節・滑膜組織におけるフローサイトメトリー解析法。変形性関節症モデルでの免疫細胞サブセット同定と免疫応答の詳細な特性評価に有用な再現性の高いプロトコルです。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

アンドリュー・リム博士とジャイルズ・ベスト博士のフローサイトメーターの設定に協力してくださったことに感謝します。このプロジェクトは、ドイツ・フォルシュングスゲミンシャフト(DFG)(DFG-HA 8481/1-1)がPHに授与した。

<ol><li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology%2C+treatment%2C+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2016).</li>
<li>Li, Y. S., Luo, W., Zhu, S. A., Lei, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+Cells+in+Osteoarthritis%3A+Alterations+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">T Cells in Osteoarthritis: Alterations and Beyond.</a> Frontiers in Immunology. 8, 356(2017).</li>
<li>Woolf, A. D., Pfleger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+major+musculoskeletal+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">Burden of major musculoskeletal conditions.</a> Bull World Health Organ. 81 (9), 646-656 (2003).</li>
<li>Little, C. B., Hunter, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-traumatic+osteoarthritis%3A+from+mouse+models+to+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials.</a> Nature Reviews Rheumatology. 9 (8), 485-497 (2013).</li>
<li>Riordan, E. A., Little, C., Hunter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+post-traumatic+OA+with+a+view+to+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research%3A+Clinical+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of post-traumatic OA with a view to intervention.</a> Best Practice & Research: Clinical Rheumatology. 28 (1), 17-30 (2014).</li>
<li>Muthuri, S. G., McWilliams, D. F., Doherty, M., Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((History+of+knee+injuries+and+knee+osteoarthritis%3A+a+meta-analysis+of+observational+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">History of knee injuries and knee osteoarthritis: a meta-analysis of observational studies.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 19 (11), 1286-1293 (2011).</li>
<li>Leheita, O., Abed Elrazek, N. Y., Younes, S., Mahmoud, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocytes+subsets+in+osteoarthritis+versus+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Egyptian+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lymphocytes subsets in osteoarthritis versus rheumatoid arthritis.</a> Egyptian Journal of Immunology. 12 (2), 113-124 (2005).</li>
<li>Yamada, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+accumulation+of+activated+Th1+cells+not+only+in+rheumatoid+arthritis+but+also+in+osteoarthritis+joints%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Preferential accumulation of activated Th1 cells not only in rheumatoid arthritis but also in osteoarthritis joints.</a> Journal of Rheumatology. 38 (8), 1569-1575 (2011).</li>
<li>Sakkas, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cells+and+T-cell+cytokine+transcripts+in+the+synovial+membrane+in+patients+with+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+and+Diagnostics+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">T cells and T-cell cytokine transcripts in the synovial membrane in patients with osteoarthritis.</a> Clinics and Diagnostics Laboratory Immunology. 5 (4), 430-437 (1998).</li>
<li>Guo, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+CD%284%29%28%2B%29+CD%282%29%285%29%28%2B%29+Foxp%283%29%28%2B%29+Treg+with+the+recovery+of+joint+function+after+total+knee+replacement+in+rats+with+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+and+Molecular+Research%22%5BJournal%5D)">Correlation of CD(4)(+) CD(2)(5)(+) Foxp(3)(+) Treg with the recovery of joint function after total knee replacement in rats with osteoarthritis.</a> Genetics and Molecular Research. 14 (4), 7290-7296 (2015).</li>
<li>Moradi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29CD25%28%2B%29%2FhighCD127low%2F%28-%29+regulatory+T+cells+are+enriched+in+rheumatoid+arthritis+and+osteoarthritis+joints--analysis+of+frequency+and+phenotype+in+synovial+membrane%2C+synovial+fluid+and+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">CD4(+)CD25(+)/highCD127low/(-) regulatory T cells are enriched in rheumatoid arthritis and osteoarthritis joints--analysis of frequency and phenotype in synovial membrane, synovial fluid and peripheral blood.</a> Arthritis Research & Therapy. 16 (2), 97(2014).</li>
<li>Saito, I., Koshino, T., Nakashima, K., Uesugi, M., Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+cellular+infiltrate+in+inflammatory+synovia+of+osteoarthritic+knees%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Increased cellular infiltrate in inflammatory synovia of osteoarthritic knees.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 10 (2), 156-162 (2002).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synovial+macrophage+M1+polarisation+exacerbates+experimental+osteoarthritis+partially+through+R-spondin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 77 (10), 1524-1534 (2018).</li>
<li>Culemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locally+renewing+resident+synovial+macrophages+provide+a+protective+barrier+for+the+joint%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Locally renewing resident synovial macrophages provide a protective barrier for the joint.</a> Nature. 572, 670-675 (2019).</li>
<li>Mocellin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+quantitative+real-time+PCR+to+determine+immune+cell+density+and+cytokine+gene+profile+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of quantitative real-time PCR to determine immune cell density and cytokine gene profile in the tumor microenvironment.</a> Journal of Immunological Methods. 280 (1-2), 1-11 (2003).</li>
<li>Ward, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+markers+for+the+rodent+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical markers for the rodent immune system.</a> Toxicologic Pathology. 34 (5), 616-630 (2006).</li>
<li>Blaker, C. L., Clarke, E. C., Little, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+models+to+investigate+the+pathophysiology%2C+treatment%2C+and+prevention+of+post-traumatic+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Using mouse models to investigate the pathophysiology, treatment, and prevention of post-traumatic osteoarthritis.</a> Journal of Orthopaedic Research. 35 (3), 424-439 (2017).</li>
<li>Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+surgical+destabilization+of+the+medial+meniscus+%28DMM%29+model+of+osteoarthritis+in+the+129%2FSvEv+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).</li>
<li>Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Staining+and+Flow+Cytometry+to+Identify+Lymphocyte+Subsets+within+Murine+Aorta%2C+Kidney+and+Lymph+Nodes+in+a+Model+of+Hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e55266(2017).</li>
<li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Protocol+for+the+Comprehensive+Flow+Cytometric+Analysis+of+Immune+Cells+in+Normal+and+Inflamed+Murine+Non-Lymphoid+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A Protocol for the Comprehensive Flow Cytometric Analysis of Immune Cells in Normal and Inflamed Murine Non-Lymphoid Tissues.</a> PLoS One. 11 (3), 0150606(2016).</li>
<li>Lorenz, J., Grassel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+osteoarthritis+models+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Experimental osteoarthritis models in mice.</a> Methods in Molecular Biology. 1194, 401-419 (2014).</li>
<li>Christiansen, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+mouse+models+of+post-traumatic+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Non-invasive mouse models of post-traumatic osteoarthritis.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 23 (10), 1627-1638 (2015).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+alteration+of+lymphatic+vessels+in+knee+joints+of+normal+and+osteoarthritic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+%26+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">Distribution and alteration of lymphatic vessels in knee joints of normal and osteoarthritic mice.</a> Arthritis & Rheumatology. 66 (3), 657-666 (2014).</li>
<li>Harrell, M. I., Iritani, B. M., Ruddell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+mapping+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Lymph node mapping in the mouse.</a> Journal of Immunological Methods. 332 (1-2), 170-174 (2008).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+culture+and+isolation+of+murine+synovial+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Reports%22%5BJournal%5D)">A protocol for the culture and isolation of murine synovial fibroblasts.</a> Biomedical Reports. 5 (2), 171-175 (2016).</li>
<li>Belluzzi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+Infrapatellar+Fat+Pad+and+Synovial+Membrane+to+Knee+Osteoarthritis+Pain%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Contribution of Infrapatellar Fat Pad and Synovial Membrane to Knee Osteoarthritis Pain.</a> BioMed Research International. 2019, 18(2019).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルに記載されている方法は、変形性関節症(OA)のマウスモデルにおけるマウス脾臓、骨髄、リンパ節、滑膜組織の中の単球/マクロファージおよびT細胞の両方から様々なサブセットを確実に同定するように設計され、テストされた。現在のプロトコルは、抗体を交換することによって異なる組織タイプ、または他の細胞タイプを調査するために容易に変更することができ、OAの代替マウスモデルに使用することができる。他の組織タイプを試験する場合、免疫細胞の表面マーカーの発現が各組織20に変化するとして、各抗体の特異性を試験することが重要である。また、抗体を交換する場合には、抗体の最適濃度を確立するとともに、スペクトル重複の変化に対処するための補償プロセスを繰り返す用量滴定曲線を行う必要がある。
現在のプロトコルでは、OAはDMMマウスモデル18を用いて誘導された。この種は、心的外傷後OA17の病態生理を調査する際に多重の利点を提供するので、最も一般的に使用され、...

変形性関節症(OA)は、関節1に関連するすべての組織の様々な病理を含む衰弱および痛みを伴う疾患である。世界人口の約3.8%に影響を及ぼす2,OAは最も一般的な筋骨格系疾患の1つであり、2020年までに世界の第4位の障害原因となる。外傷後OAは関節損傷後に発生し、膝4、5などの影響を受けやすい関節において、OAの少なくとも12%、OAの最大25%を占める。,5さらに、関節損傷はOAの生涯リスクを5倍以上6倍に増加させる。明らかに同様の不安定性を持つすべての傷害がOAの開発に進むわけではないので、長期的なOAリスクを引き起す要因を定義することは依然として困難です。OAに素因がある傷害特異的な病理、原因、およびメカニズムを調査し、より良く定義するために、心的外傷後OAを予防および/または治療するための効果的な治療法を開発することが1重要である。
OAとその定義軟骨破壊は、以前は完全に機械的ストレスに起因し、したがって、OAは非炎症性疾患2と考えられていた。しかし、最近の研究では、滑膜の炎症性浸潤と、OA患者の滑膜組織における炎症性細胞の増加が、健康なコントロール2と比較して、OAの潜在的な原動力として炎症成分に光を当てることが示されている。さらなる研究は、CD4+およびCD8+T細胞プロファイルの両方の異常ならびに自然免疫系の単球/マクロファージがOA2、7,7の病因に寄与する可能性があることを示した。これらの異常に関する詳細な調査は、様々なT細胞サブセット2、例えばTh1 8、Th299、Th178 8およびT規制(Treg)集団10、11,11のような関連する役割を明らかにした。この説得力のある証拠にもかかわらず、T細胞応答の変化とOAの発達と進行との因果関係はまだ不明である2.
OAに役割を持つ特定のT細胞に加えて、最近の研究では、分偏光/活性化マクロファージがOA12の病因と関連している可能性が示唆されている。特に、血液単球に由来するマクロファージは、滑膜に蓄積し、OAの開発中に古典的に活性化されたマクロファージ(M1)または代替活性化マクロファージ(M2)のいずれかに蓄積し、単球由来マクロファージとOA13との間の相関関係を暗示する。対照的に、マクロファージの特定のサブセットは、発達中の初期に臓器を移入し、単球独立物質14においてその数を自立する。近年、これらの滑膜組織居住マクロファージ(STRM)14について、密接的な接合バリアによって媒介された関節保護機能が14示された。これらの知見は、特にマクロファージサブセットの異常がOAの開発中に重要な役割を果たす可能性があることを示している。しかし、この炎症細胞反応と外傷後の関節の構造変化との相互作用は不明である。
歴史的に、滑液組織における免疫細胞の解析は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)が15,16,16に近づくことで免疫組織化学(IHC)またはmRNA発現に限定された。しかし、IHCとRT-PCRの両方が、複数の異なる細胞タイプとそのサブセットを同時に識別する能力を欠いているため、これらの方法の適用性が制限されます。さらに、IHCは組織の小さなサンプルの分析に限定され、焦点炎症性細胞蓄積を見逃す可能性がある。ここ数年、さまざまな細胞タイプの無数の表面マーカーが開発され、免疫細胞のサブセットは、これらのマーカーの明確な組み合わせによって確実に同定できるようになりました。着実な技術進歩により、フローサイトメーターは、多数の異なるフルオロクロムを同時に同定することができ、大型の多色抗体パネルの分析が可能になりました。
フローサイトメトリーは、多数の免疫細胞とそのサブセットを単一細胞レベルで同時に同定し、定量化できる強力な技術を研究者に提供します。私たちは、単球/マクロファージとそのサブセットを同定するための細胞外染色アッセイと、マウス脾臓、骨髄、リンパ節および滑膜組織内のT細胞およびそのサブセットを同定するための細胞外染色アッセイの両方を開発し、最適化しました。このプロトコルの各ステップは最適化され、テストされ、他の外科および非外科的OAマウスモデル17に利用することができる非常に再現性の高いアッセイを生じる。

<table><tbody><tr><td>APC 抗マウス CD194 (CCR4)</td><td>BioLegend</td><td>131212</td><td>T 細胞パネル</td></tr><tr><td>ブリリアント染色バッファー プラス 1000Tst</td><td>BD</td><td>566385</td><td>バッファー</td></tr><tr><td>固定生存率染色 510、100 &micro;g</td><td>BD</td><td>564406</td><td>T細胞パネル</td></tr><tr><td>固定生存率染色剤 510, 100 & micro;g</td><td>BD</td><td>564406</td><td>単球パネル</td></tr><tr><td>リベラーゼ、研究用グレード</td><td>Roche</td><td>5401127001</td><td>滑膜組織用酵素</td></tr><tr><td>Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 & micro;g</td><td>BD</td><td>564985</td><td>単球パネル</td></tr><tr><td>Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 & micro;g</td><td>BD</td><td>562454</td><td>単球パネル</td></tr><tr><td>Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 & micro;g</td><td>BD</td><td>742274</td><td>T細胞パネル</td></tr><tr><td>Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 & マイクロ;g</td><td>BD</td><td>565250</td><td>単球パネル</td></tr><tr><td>Ms CD25 BV605 PC61, 50 & マイクロ;g</td><td>BD</td><td>563061</td><td>T細胞パネル</td></tr><tr><td>Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 & micro;g</td><td>BD</td><td>557596</td><td>T細胞パネル</td></tr><tr><td>Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 & micro;g</td><td>BD</td><td>552775</td><td>Tセルパネル</td></tr><tr><td>Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 & マイクロ;g</td><td>BD</td><td>565480</td><td>Tセルパネル</td></tr><tr><td>Ms CD62L BB515 MEL-14、100 & マイクロ;g</td><td>BD</td><td>565261</td><td>Tセルパネル</td></tr><tr><td>Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 & micro;g</td><td>BD</td><td>740664</td><td>Tセルパネル</td></tr><tr><td>Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 & micro;g</td><td>BD</td><td>563687</td><td>単球パネル</td></tr><tr><td>Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 & micro;g</td><td>BD</td><td>563332</td><td>Tセルパネル</td></tr><tr><td>Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 & マイクロ;g</td><td>BD</td><td>565411</td><td>単球パネル</td></tr><tr><td>Ms Foxp3 PE MF23, 100 & micro;g</td><td>BD</td><td>560408</td><td>Tセルパネル</td></tr><tr><td>MS I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 & マイクロ;g</td><td>BD</td><td>563414</td><td>単球パネル</td></tr><tr><td>Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 & micro;g</td><td>BD</td><td>560593</td><td>単球パネル</td></tr><tr><td>Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 & micro;g</td><td>BD</td><td>560600</td><td>単球パネル</td></tr><tr><td>Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 & マイクロ;g</td><td>BD</td><td>564143</td><td>T細胞パネル</td></tr><tr><td>Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 & マイクロ;g</td><td>BD</td><td>562894</td><td>T細胞パネル</td></tr><tr><td>赤血球溶解バッファー</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>バッファー</td></tr><tr><td>転写因子バッファーセット 100Tst</td><td>BD</td><td>562574</td><td>バッファー</td></tr></tbody></table>

変形性関節症モデルにおけるマウス脾臓、骨髄、リンパ節および滑膜組織における免疫細胞サブセットのフローサイトメトリー解析

Flow Cytometry Analysis of Immune Cell Subsets within the Murine Spleen, Bone Marrow, Lymph Nodes and Synovial Tissue in an Osteoarthritis Model

変形性関節症(OA)は、痛みや身体的な制限に苦しむ患者に影響を与える最も一般的な筋骨格疾患の一つです。最近の証拠は、T細胞と単球/マクロファージの両方がOAの病因に関連する可能性のある疾患の潜在的な炎症成分を示している。さらなる研究は、Th1、Th2、Th17、およびT-調節性リンパ球、およびM1、M2、および滑膜組織居住マクロファージなどの炎症性細胞系のサブセットに重要な役割を果たした。しかしながら、局所滑液および全身性炎症細胞反応と関節の構造変化との相互作用は不明である。T細胞と単球/マクロファージがOAにどのように寄与するかを完全に理解するには、滑膜組織、二次リンパ器官および全身(脾臓および骨髄)においてこれらの細胞とそのサブセットを同時に定量的に同定できることが重要である。今日では、異なる炎症細胞サブセットは、これらの細胞プロセスを調査する際に多色流サイトメトリーを強力な技術にする細胞表面マーカーの組み合わせによって同定することができる。このプロトコルでは、滑液組織および二次リンパ器官の収穫に関する詳細なステップと、単一細胞懸濁液の生成について説明する。さらに、単球/マクロファージとそのサブセットを同定するための細胞外染色アッセイと、マウス脾臓、骨髄、リンパ節および滑膜組織内のT細胞およびそのサブセットを同定するための細胞外染色アッセイを提示する。このプロトコルの各ステップは最適化され、テストされ、他の外科および非外科的OAマウスモデルに利用することができる非常に再現性の高いアッセイをもたらした。

単球サブセットパネルとT細胞サブセットパネルの両方からの代表的な結果を以下に説明する。
図1 は、DMM処理動物の骨髄から集められた免疫細胞上の単球サブセットパネルの階層格紙戦略を示す。同じ戦略が使用され、他のすべての組織タイプで検証されました.実験を設定する際、各組織タイプに対してフォワード散乱面積(FSC-A)と側散乱面積(SSC-A)電圧を決定し、単球/マクロファージを同定し、T細胞およびデブリを除外した。各実験の間に、各組織タイプの非染色制御を分析し、必要に応じてFSC-AおよびSSC-A電圧を調整した。電圧は、パラメータが急激に変化すると、サイトメーターの閉塞が発生する可能性が高い場合、時間の経過とともに同様のままになります。さらに、染色されていないコントロールを使用して死んだ/生きている汚れの真の陰性を決定し、ゲートは実験が行われるたびに調整された(図2A)。実験を設計する際には、蛍光色素を慎重に選択し、通常は発現が低い表面マーカーを明るい蛍光色素と組...

ここでは、マウス変形性関節症の確立された外科モデルを利用して、マウス脾臓、骨髄、リンパ節および滑膜組織内の細胞外染色アッセイと細胞内染色アッセイの両方を使用して、単球/マクロファージおよびT細胞サブセットを同定するための詳細で再現可能なフローサイトメトリープロトコルについて述べた。

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent ...

我々のプロトコルは、単球およびマクロファージおよびT細胞およびそれらの関連サブセットをニューロンおよびオビウムおよび免疫系の様々な他の組織内で詳細に同定し、分析することを可能にする。我々の技術は、変形性関節症免疫応答の包括的な特性評価のための滑膜および他の関連組織からの生命免疫細胞の信頼できる収穫を促進する。変形性関節症モデルマウスから目的の組織を分離するために、マウスを上弦の位置に、胸、腹部および脚を70%エタノールで拭く。腹腔をそのままにしたまま、腹部の正中線に沿って皮膚を慎重に開くには、はさみを使用してください。そして、動物の右側の皮膚を下の筋肉からそっと引っ張り、皮下脂肪組織を皮膚に取り付けたままにします。マウスを解剖顕微鏡の下に置き、2つの湾曲した細かい鉗子を使用して、太ももに位置する脂肪組織を優しくいじめます。3つの十字船を特定した後、細かい解剖鉗子を使用して、血管の交点にあるリンパ節を取り除き、カプセルを破裂させないように注意する。鉗子を使用して、残りの脂肪をリンパ節の表面から取り除き、腹腔を開きます。残りの脂肪が見えない場合は、リンパ節を以前に調製し、0.5ミリリットルのRPMI培地で満たされた6つのウェルプレートに直ちに配置します。以降、腹腔を開く。細かいはさみを使って脾臓を切除し、腸を優しく抽出して大腸とその分岐を露出させる。以下、前に準備した6つのよく再生されたRPMI培地に直ちに脾臓を置く。腹部大動脈の末端部に位置する腸骨リンパ節と共通の腸骨動脈の起源を取り除き、両方の後肢から皮膚を慎重に取り除く。すぐに前に準備され、2つの動物からすべてのリンパ節をプールするRPMI培地の0.5ミリリットルでラベル付けされた6つのウェルプレートビルドにリンパ節を置きます。細かいはさみやメスを使用して、付属の筋肉組織の左大腿骨をきれいにし、慎重にスティフレと股関節の両方を切断し、大腿骨を取り除きながら骨全体をそのまま残します。その後、以前に調製された6つのウェルプレートに大腿骨を入れ、0.5ミリリットルのRPMI培地で満たされた6つのウェルプレートにラベルを付けた。右の息苦しい関節の膝蓋腱を特定し、膝蓋骨に近い四頭筋腱の約5ミリリットルが露出するまで、接合する筋肉組織近位の関節を取り除くために細かいはさみを使用する。膝蓋骨に近い約3〜4ミリメートルの四頭筋腱を切断してハンドルを形成し、細かい鉗子を使用して関節から緊張をそっと引き離し、関節カプセルアタッチメントの端を露出させます。大腿骨から始まり、脛骨に向かって移動し、メスを使用して両側の関節カプセルの端に沿って慎重に切断し、四頭筋腱の穏やかな牽引力を維持します。滑膜組織ブロックが脛骨にのみ付着する場合、関節内脂肪パッドは膝蓋骨に遠位にはっきりと見えるようにし、ミンスキーの関節および前側面から穏やかに切り離すことができる。次いで、関節カプセルの残りの部分に沿って切断し、滑液組織ブロックを除去し、すぐにそれを以前に調製した6つのウェルプレートに配置し、1.5ミリリットルのRPMI培地で満たされたラベル付けした。すべての組織が採取されたら、条件ごとに2つのプールされた脾臓を15ミリリットルチューブの70マイクロメートル細胞ストレーナーに置き、無菌3ミリリットルシリンジプランジャーを使用して、ストレーナーを頻繁に洗い流すメッシュフィルターを通して組織を穏やかに質量評価し、RPMI 1640培地の合計6ミリリットルで頻繁に組織を質量レートします。遠心分離により細胞を沈下し、5ミリリットルの赤血球リシスフグ中にペレットを再懸濁させた。5分後、PBSの10ミリリットルで反応を停止し、細胞を遠心分離します。赤血球がこれ以上観察されない場合, カウントのための新鮮なPBSの1ミリリットルでペレットを再中断.リンパ節処理の場合、4つのリンパ節すべてを新しい15ミリリットルチューブの70マイクロメートル細胞ストレーナーに配置し、新しい無菌3ミリリットルプランジャーを使用してメッシュを通してリンパ節を単一の細胞懸濁液に優しくいじめ、5分間Gの500倍の細胞を遠心し、上澄み物を捨て、ペレットを500マイクロリットルで再中断します。骨髄を分離するには、組織の親指鉗子を使用して無傷の大腿骨を慎重に把握し、鋭利なはさみを使用して近位大腿骨の端を切断します。大腿骨の間音のノッチの中央に23ゲージの針を挿入し、ノッチに穴を開けるために穏やかな圧力を加えながら針を回します。必要に応じて針を変更し、新しい15ミリリットルチューブ上の70マイクロメートルセルストレーナーに10%FBSを補ったRPMIの6ミリリットルで骨の内容物を洗い流し、新しい3ミリリットルシリンジプランジャーを使用してメッシュを通して骨髄を穏やかに押し込みます。以降、脾臓について実証したようにRBCステップを行う。赤血球がこれ以上観察されない場合, カウントのための新鮮なPBSの1ミリリットルでペレットを再中断.滑液組織の処理のために小片に2つの滑液組織ブロックをサイコロに微細な外科用はさみを使用し、新しい15ミリリットルのチューブにサンプルを移す。500マイクロリットルの培地で回収容器をすすい、残りの細胞と滑液組織を採取し、サンプル採取管で洗浄液を引っ張ります。次に、1ミリリットルの最終濃度で達成するのに十分な量の酵素を加え、2時間の回転子のインキュベーターで37°Cで滑液組織サンプルを消化する。チューブを回転器に入れる際には十分な動きを確認してください。インキュベーションの終わりに、10%FBSで補ったRPMIの8ミリリットルで消化を停止し、新しい15ミリリットルチューブに70マイクロメートルの細胞ストレーナーを介して細胞懸濁液を濾過します。古い15ミリリットルのチューブを5ミリリットルの媒体で洗い流し、これを使用してフィルターを洗浄します。次いで、遠心分離により細胞を沈下し、500マイクロリットルのPBSでペレットを再懸濁してカウントする。単離された免疫細胞の生存性染色を行うために、各細胞懸濁液の5つの細胞に5倍10を加えて、2つの異なる96ウェルUボトムプレートの適切なウェルに細胞を加え、各ウェルの底部に細胞を集める。各組織タイプの十分な染色されていない細胞を常に陰性対照として含む。200マイクロリットルのPBSで細胞を洗浄し、ペレットを100マイクロリットルの細胞で再懸濁し、光から保護された摂氏4度で15分間のインキュベーションを行います。インキュベーションの終わりに、1回の洗浄につき200マイクロリットルのFACSバッファーで細胞を2回洗浄し、適切な目的の抗体または対照カクテルの100マイクロリットルの各ペレットを再懸濁します。細胞内染色と細胞外染色の両方が同じで行われる場合は、今すぐ細胞外染色工程を行う。光から保護された摂氏4度で30分間のインキュベーションの後、細胞をウェルあたり200マイクロリットルのFACSバッファで2回洗浄し、1ミリモルEDTAを補ったFACSバッファーの250マイクロリットルで細胞および単球サブセットパネルプレートを再中断する。細胞内染色が計画されていない場合にのみ、このステップを実施し、それ以外の場合はプロトコルの細胞内染色の側面に進みます。次に、各単球サブセットサンプルを、光から保護された氷上の適切な対応するFACSチューブに移す。T細胞サブセットパネルセルの細胞間染色の場合、適切な固定および透過性キットから200マイクロリットルの固定バッファーのペレットを、光から保護された摂氏4度で40分間インキュベーションします。インキュベーションの終わりに、200マイクロリットルの透過性洗浄バッファーで細胞を2回洗浄し、目的の適切な抗体またはコントロールカクテルの100マイクロリットルでペレットを再中断し、光から保護された摂氏4度で40分間インキュベーションします。次いで、1回の洗浄液のパーメビライゼーション洗浄バッファーの200マイクロリットルで細胞を2回洗浄する。そして、光から保護された氷の上の適切な対応するFACSチューブにサンプルを移す前に、FACSとEDTAバッファーの250マイクロリットルで細胞を再中断します。ここで、DMM処理動物の骨髄から集められた免疫細胞上の単球サブセットパネルに対する階層格数戦略が観察できる。染色されていないトロールは、死んだ生きている汚れの真の陰性を決定するために使用することができ、ゲートは実験が必要に応じて行われるたびに調整することができます。この代表的な分析では、免疫細胞を滑液組織から単離し、DMMまたはシャムコントロール手術の6週間後に細胞外表面マーカーで染色した。DMM治療動物では、陰性の手術マウスで観察された細胞集団と比較して、Ly-SC陽性MHC2陰性およびM2マクロファージの割合が高いことが観察される。ここで、DMM処理動物の脾臓から単離された免疫細胞上の細胞外および細胞内T細胞パネルに対する階層的な格子化戦略が観察できる。TH1細胞の高い割合は、DMM動物のリンパ節および滑液組織だけでなく、T調節細胞およびTH17細胞の数が多い。高品質のサンプルの取得を確実にするために、組織は迅速、細心の注意を払って、一貫した方法で収穫されなければなりません。免疫細胞が単離されると、他の下流分析は、RTPCR、細胞培養および血液上で休息し、目的の分子プロセスに光を当てるなど、行うことができる。

flow-cytometry-analysis-immune-cell-subsets-within-murine-spleen-bone

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

本論文では、大動脈の免疫成分を調査するために、フローサイトメトリーベースの方法を提示。本稿では、また別々に周囲の外膜と血管壁を調べることができる追加のテクニックを示しています。このメソッドは、大動脈白血球の表現型解析を実行し、アテローム性動脈硬化症の研究のためにいくつかの免疫学的アッセイを適用する可能性を開きます。...

マウス大動脈内の免疫細胞のフローサイトメトリー分析

このビデオは、マウスの自己免疫性関節炎に対する細胞ベースの治療法を紹介しています。オボアルブミン特異的受容体を発現するiPS細胞由来T制御細胞に、アジュバントで乳化したメチル化ウシ血清アルブミン(mBSA)を注入します。マウス抗原提示細胞(APC)は、mBSAを処理してT細胞に提示し、T細胞の活性化と膝関節の滑膜への移動を促進します。その後の注射では、左膝にmBSAのみを使用し、右膝にmBSAとオボアルブミンの組み合わせを投与します。左膝では、mBSAに対する免疫応答が関節炎を引き起こし、右膝では、オボアルブミンと相互作用するT制御細胞が炎症を軽減し、関節炎の症状を改善します。...

マウスモデルにおける自己免疫性関節炎の細胞ベース療法

この記事では、スペクトルサイトメトリー、蛍光色素を区別するために、発光スペクトルの形状を使用するフローサイトメトリーでの新しいアプローチを説明します。このアルゴリズムは、補償を置き換え、独立したパラメータとして自家蛍光を扱うことができます。この新しいアプローチは、固形臓器から単離された細胞の適切な分析が可能になります。...

スペクトラルフローサイトメトリーにより固形組織から単離された細胞懸濁液の分析

マウスの坐骨神経内のセルのコンテンツの定量的解析は組織の欠乏のために困難です。このプロトコルでは、組織の消化と個々...

単一の坐骨神経とフローサイトメトリーを使用して単一のマウスの後根神経節における免疫系細胞の解析

ここでは、マウス骨髄細胞を表現型造血幹および前駆細胞に単離および染色するための簡単なプロトコルと、支持するニッチ内皮および間葉系幹細胞について説明します。内膜および中枢骨髄領域に位置する細胞を濃縮する方法も含まれる。...

マウス骨髄造血幹・前駆細胞および間質ニッチ細胞のフローサイトメトリー解析

透過光、偏光顕微鏡、および補償光顕微鏡下での滑液分析は、サンプルの炎症性または非炎症性を簡単なステップで評価するために使用されます。変形性関節症において、カルシウム結晶を検出し、変形性関節症のより重篤なサブセットを特定することは特に有用である。...

変形性関節症を特定するための滑液分析

本研究は、マウス炎症性関節炎組織から滑膜マクロファージおよび線維芽細胞を単離するための修正されたプロトコルを提供する。...

マウス関節炎組織からの初代滑膜マクロファージおよび線維芽細胞の単離と培養

関節の生体内画像診断は、白血球の移動挙動や炎症関節内の分子動態を明らかにする貴重な技術です。ここでは、タイプIIコラーゲン誘発性関節炎(CIA)のマウスモデルを用いた関節のin...

インビボ 画像診断により関節内の白血球の移動行動が明らかになります

ここでは、SKGマウスからのCD4+...

マウスにおける関節リウマチの養子移植モデル

急性炎症性、感染性、構造的滑膜の変化を評価することができるヒト の生外...

機能と構造が保存された体内ヒト滑膜 組織を用いた前 臨床モデル

学ぶ マウス脾臓・骨髄・リンパ節・滑膜組織におけるフローサイトメトリー解析法。変形性関節症モデルでの免疫細胞サブセット同定と免疫応答の詳細な特性評価に有用な再現性の高いプロトコルです。

変形性関節症モデルにおけるマウス脾臓、骨髄、リンパ節および滑膜組織における免疫細胞サブセットのフローサイトメトリー解析

さらに動画を探す