Name: インタビセナーリナーリ注射によるレプトメニンゲ細胞改変の誘導 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: 学ぶ、曲げ針を用いたインタビセナール注射法によりレプトメニンゲ細胞の遺伝子改変を行う技術。マウスモデルで神経組織損傷を最小限に抑え、脳脊髄液の動態と細胞機能を正確に解析する方法です。

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この研究は、スウェーデン研究評議会、スウェーデン癌学会、スウェーデン戦略研究財団、クヌート・オーク・アリス・ワレンベルス・スティフタース、カロリンスカ研究所(StratRegen)の幹細胞と再生医療の戦略研究プログラムからの助成金によって支えられました。

ここに提示された外科的処置は、ストックホルム・ノラ・ジュルフェルセクセティスカ・ナムントによって承認され、研究所(スウェーデンのカロリンスカ研究所)が提供する仕様に同意して実施された。
注:インタシターナル注射は、複数の研究目的に柔軟に適応することができる。R26R-tdTomato12およびCreERを担うトランスジェニックマウスラインにおけるエンドキシフェンの注入に基づいて運命マッピング用レプトメニンゲ細胞を効率的に標識するために開発された手順を以下に提示し、後者はCx30プロモーター13の下で提示する。細胞のこの集団の標識は、以下に概説するのと同じ手順を用いてウイルス構築物の注入によって達成され得る。最後に、このアプローチは、蛍光トレーサーの注入によって、脳脊髄液の流れを追跡するために使用することができる。
1. インジェクションシステムの準備
注:適切な外科室と無菌状態で処置を行うことをお勧めします。手術用具は熱(オートクレーブ、ガラスビーズの殺菌器)を使用して殺菌するか、または熱に敏感であれば高レベルの化学消毒剤を使用して消毒することができる。化学消毒を使用する場合は使用前に使用する前に、機器をすすい、または熱で消毒するときに冷却することができます。
<ol><li>鉗子を使用して、注射注射器の針を先端から3mmで30°に曲げる。 注:30 G のベベリング針でハミルトンの注射器を使用します。</li>
	<li>1mg/mLのエンドキシフェン溶液を調製し、10%DMSOで希釈し、注射器に曲がった針を詰め戻します。 注:化合物の5 μLを投与して、成人C57Bl/6jマウス(ca. 25-30 g)の髄膜細胞の広範囲にわたる暴露を確実にしますが、異なる年齢や株の動物を治療する際に、異なる濃度および注射量をテストするパイロット実験が必要な場合があります。</li>
	<li>マウスのヘッドホルダーを調整して、口の部分が手術台の表面から約30°になるようにします。 注:この手順では、3点固定(すなわち、耳と口)を持つ定位フレームも使用できます。しかし、この場合、動物は口の部分でのみ固定されますが、耳の棒は動物の前肢の下に拡張し、処置中に動物の体を支えるために使用することができます。</li>
</ol>2. 麻酔の誘導
<ol><li>注射用麻酔薬の場合は、地元の機関で獣医ユニットが推奨する濃度と投与モードを使用してください。</li>
	<li>イオブルランなどの吸入麻酔薬については、メーカーの仕様に従って管理装置を用意します。</li>
	<li>イオブルランを用いて、麻酔の誘導のために化合物の濃度を4%に設定した。</li>
	<li>400 mL/minの速度で空気を届ける。</li>
	<li>麻酔ユニットが数分間麻酔剤でチャンバーを満たし、その後、チャンバーにマウスを置きます。 注:今回の実験では、Cx30-CreERおよびR26R-tdTomatoを持つ雄と雌のトランスジェニックマウスを、C57Bl/6jバックグラウンドで飼育した成人(>2ヶ月、約30g)を用いた。</li>
	<li>麻酔の誘導の間に動物を監視する。マウスが完全麻酔下にある場合、呼吸パターンは遅くなるはずです。</li>
	<li>チャンバーから動物を取り除き、後足を繊細につまんで足反射の抑制を確認します。 注:反射はまだ存在するかもしれませんが、数秒遅れます。その場合は、足反射の完全な抑制が達成されるまで、動物をチャンバーに戻します。</li>
	<li>鎮痛薬(例えば、カルプロフェン、皮下注射による5mg/kg)を投与し、術後の疼痛管理を支援する。</li>
</ol>3. 処置のための動物の位置決め
<ol><li>動物の頭をヘッドホルダーに固定します。水槽マグナへのアクセス性を向上させるために、動物の体を表の表面から約30°、頭を下向きに位置し、体の残りの部分と120°の角度を確立し、首の後ろを延長して水槽マグナへのアクセスを容易にする(図1A)。</li>
	<li>手順を通して体を支えるために、動物の下にペーパータオルを追加します。</li>
	<li>口の部分を通して麻酔の配達を安全にし、イオブルランの濃度を2.5%に減らし、空気送達を200 ml/minに減らす。</li>
	<li>眼科軟膏を適用します。</li>
</ol>4. シスターナマグナの暴露
<ol><li>動物の首の後ろを剃り、70%エタノールとベタジンで地域を消毒します。</li>
	<li>手術用ハサミを使用して、後頭部骨のレベルから始まり後部に伸長する中線切開(長さ7mm)を行う。</li>
	<li>細かい先端ピンセットで中線から横に引っ張る表面的な結合組織と首の筋肉を穏やかに分離します。これは、逆三角形として形作られたシステルナマグナを重ね合わせ、硬膜を露出します。</li>
	<li>結果として生じる出血を制御するために無菌吸収槍または綿棒を使用してください。</li>
	<li>首の筋肉を脇に引っ張って維持し、手順全体の水槽のマグナの視覚化を可能にするために小さな外科用分離器を配置します。</li>
</ol>5. インタビシナルインジェクション
<ol><li>水槽マグナへのアクセスを得るために、後頭部骨の尾端を識別し、以前に下に曲がっていた針を挿入する。 注:硬膜が穿刺されると、抵抗が急激に低下します。しかし、針の先端は、そのフック形状のおかげで、髄膜表面の下にわずかに浸透します。</li>
	<li>硬膜が穿穿付されたら、針を頭蓋骨に「引っ掛ける」ために、注射器を動物の体に優しく引っ張って動物の体に平行に引っ張って、針の曲がった先端が硬膜表面の下に浸透することを許可する(図1Bを参照)。これにより、より良い安定性が確保され、針が深く貫通するのを防ぎ、基礎となる小脳や髄質を損傷するリスクを回避します。</li>
	<li>脳脊髄液の自然な流れとの干渉を避けるために、化合物をゆっくりと注入します。 注:実験の目的に応じて、輸液速度が異なる場合があります。遅くて安定した注入速度が必要な場合(例えば、脳脊髄液の動きを追跡する手順を使用する場合)、シリンジと組み合わせて自動化されたマイクロ注入システムを使用することをお勧めします。</li>
	<li>注射後、針を1分間部位に置き、慎重に取り外します。細かい先端鉗子を使用して、針を引っ掛けた位置から引き込むのを助けます。 注:細い針(例えば、30G)の使用は髄膜の実質的な損傷、および結果的に脳脊髄液の流出をもたらさない。より大きな針のサイズが必要な場合は、無菌綿先端を使用して注射部位に圧力をかけることによって、流体の漏れを止めることをお勧めします。</li>
</ol>6. 手続きと術後ケアの締結
<ol><li>セパレータを取り外し、筋肉が硬膜を重ねた元の位置に戻るようにします。</li>
	<li>シアノアクリル酸接着剤を数滴使用して皮膚切開を閉じます。 注:あるいは、吸収性縫合糸(例えば、5-0ビリル縫合糸)を使用し、中断されたステッチで皮膚切開を閉じる。</li>
	<li>切開部位に局所麻酔薬(例えば、5%リドカインの100 μL)を塗布します。</li>
	<li>動物をホルダーから取り出し、暖房パッドの上に置いたきれいなケージに入れます。意識を取り戻すまで動物を監視します。 注:この処置は、動物に長期的な痛みや苦痛を引き起こすとは考えられていない。それにもかかわらず、マウスは術後の最初の日のために注意深く監視されるべきであり、痛みの軽減措置は必要と認められるときに、そしてあなたの機関の獣医ユニットによって提供される勧告に従って行われるかもしれない。</li>
</ol>

<ol><li>Vanlandewijck, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+atlas+of+cell+types+and+zonation+in+the+brain+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A molecular atlas of cell types and zonation in the brain vasculature.</a> Nature. 554 (7693), 475-480 (2018).</li>
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</ol>

著者らは競合する利益を宣言しない。

ここで概説するプロトコルは、運命マッピングのためにレプトメニンゲ細胞にラベルを付ける簡単で再現可能な手順を示しています。我々は、Cx30-CreERでtdTomato蛍光レポーターの発現を誘導するために、タモキシフェンの活性代謝産物であるエンドキシフェンのインタセラシサーナル注射を使用する。R26R-tdトマトマウス12,,13.
シスターナマグナ9を介して脳脊髄液へのアクセスを得るために使用される他のプロトコルと比較して、我々のアプローチは、頭蓋骨の後頭部骨に安定させることができる曲がった針の使用のおかげで安全な手動投与を保障する。システルナマグナの硬膜が穿穿されると、抵抗が急激に低下します。この時点で、他のプロトコルは、針を硬膜表面から最大1〜2mmまで下げ、手動で手順9を通して安定した位置に保つことを推奨する。針がまっすぐとは対照的に、針は頭蓋骨に固定され、組織の深...

レプトメニンゲ細胞は、脳を重ねた薄層に組織化された線維芽細胞様集団であり、コラーゲン架橋に関与する遺伝子(例えばDcnおよびLum)を発現し、脳髄膜バリア(例えばCldn11)1、2の確立に1,含まれる。レプトメニンゲ細胞は、脳脊髄液排液3の厳密な制御から、発達中の脳44,55における神経前駆細胞の指導まで、幅広い生理機能に関与している。最近の研究では、新生児のレプトメニンジが脳のパレンチマに移行し、機能的皮質ニューロン6に発展する放射状グリア様細胞を収容する可能性が提案されている。
レプトメニンゲ細胞は、表面アストロサイトに近接して位置し、それらと共有し、ならびに他の層状アストロリア、コネキシン-30(Cx30)7の発現を共有する。7以下に概説する外科的処置は、Cx30+細胞中のtdTomatoを条件付きで発現するトランスジェニックマウスのシスターナマグナへのエンドキシフェンの1回の送達を介して、これらの髄膜細胞の広範かつ+特異的な標識を可能にする(すなわち、運命マッピングのためのCreER-loxPシステムを使用する)。エンドキシフェンはタモキシフェンの活性代謝産物であり、タモキシフェンと同じ方法でCreER発現細胞の再結合を誘導する。しかし、高濃度のエタノールの代わりに5〜10%のDMSOに溶解するため、局所適用に推奨される溶液である。さらに、エンドキシフェンは脳・髄膜バリアを越えず、それにより、基になるCx30+占星団集団の標識なしにレプトメニンゲザル細胞の特異的な組換えを可能にする(代表結果を参照)。
ここで提示される技術は、水槽のマグナへの直接アクセスを介して、手動で安全に脳脊髄液中の化合物を注入することを目的としています。頭蓋骨切除術を必要とする他のより侵襲的な手順とは異なり、このアプローチは、頭蓋骨または脳の気質に損傷を与えることなく化合物を注入することを可能にする。したがって、実質グリア細胞の活性化によって引き起こされる炎症反応の誘導とは関連しない。,88、9、109の前に記載された他の注射戦略と同様に、本アプローチは、頸部筋肉を重ね合わせた鈍解の後、システルナマグナを覆うアトラント後頭膜の外科的暴露に依存する。10しかし、他の手順とは異なり、投与中に後頭骨に対して安定化することができる先端に曲がった針の使用をお勧めします。これは、針があまりにも深く貫通し、基礎となる小脳と髄質を損傷するリスクを防ぎます。
この外科的処置は、細胞の同一性およびペラキマル層を通る移動経路の変化をマッピングすることを目的とする系統追跡調査と互換性がある。また、皮質の発達に寄与する細胞や細菌性髄膜炎,3,11の広がりなど、健康や疾患におけるレプトメニンゲ細胞の役割を調査しようとする遺伝子アブレーション研究にも適応することができる。3最後に、野生動物の蛍光トレーサーの送達と組み合わせると、脳脊髄液の動きを追跡するために利用することができる。

<table><tbody><tr><td>麻酔ユニット</td><td>ユニベントール 410</td><td>8323102</td><td>気化器、チャンバー、チャンバーとマウスヘッドホルダーに接続するチューブの完成</td></tr><tr><td>麻酔(イソフルラン)</td><td>バクスターメディカル AB</td><td>000890</td><td></td></tr><tr><td>ベタジン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td>カルプロフェン</td><td>オリオン ファーマ</td><td>AB 014920</td><td>商品名 リマジル</td></tr><tr><td>シアノアクリレート接着剤</td><td>カール</td>ロス<td>0258.1</td><td>代替の</td></tr><tr><td>メドボンド組織接着剤</td>スト<td>ールティング</td><td>50479</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>エンドキシフェン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>E8284</td><td></td></tr><tr><td>エタノール70%</td><td>ヒストラブ</td><td>01370</td><td></td></tr><tr><td>ハミルトンシリンジ(30G斜め針)</td><td>ハミルトン</td><td>80300</td><td></td></tr><tr><td>リドカイン</td><td>アスペン ノルディック</td><td>520455</td><td></td></tr><tr><td>マウスヘッドホルダー</td><td>ナリシゲインターナショナル</td><td>SGM-4</td><td>吸入性鎮痛薬用マウスピース付き。あるいは、定位フレームを使用してください</td></tr><tr>は<td>さみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>シェーバー</td><td>Aesculap</td><td>GT420</td><td></td></tr><tr><td>滅菌吸収スピア</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>18105-01</td><td>滅菌綿棒も良い選択肢です</td></tr><tr><td>外科用セパレーター</td><td>ワールド精密機器</td><td>501897</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>デュモン</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>ビスコティアーズ</td><td>バウシュ&ロムノルディックAB</td><td>541760</td><td></td></tr></tbody></table>

インタビセナーリナーリ注射によるレプトメニンゲ細胞改変の誘導

Induction of Leptomeningeal Cells Modification Via Intracisternal Injection

ここで概説するプロトコルは、基礎となるパンキチマへの損傷のリスクを排除しながら、水槽マグナを介して溶液を安全かつ手動で注入する方法を説明しています。以前に公開されたプロトコルは、硬膜表面から最大1〜2mmに下げる必要があるストレート針を使用することをお勧めします。硬膜が穿刺されると、抵抗の急激な低下は、針を安定した位置に維持することが困難になります。私たちの方法は、代わりに、頭蓋骨の後頭部骨に対して安定させることができる先端に曲がった針を使用し、したがって、注射器が硬膜の穿孔後に組織に浸透するのを防ぎます。手順は、簡単で再現性があり、操作された動物に長続きする不快感を引き起こすものではありません。我々は、血管レプトメニンゲ細胞の遺伝的運命マッピングの文脈におけるインタセラセナーナル注射戦略について述べている。さらに、神経発達におけるレプトメニンの役割の調査や細菌性髄膜炎の蔓延など、これらの現象に関連する遺伝子の遺伝的切開を通じて、幅広い研究課題に取り組むためにも利用できる。さらに、この手順は、一定の送達のための自動注入システムと組み合わせることができ、蛍光標識された分子の注入を介して脳脊髄液の動きを追跡するために使用される。

Cx30プロモーター13と誘導蛍光レポーターの下でCreERを発現するトランスジェニックマウスにおけるエンドキシフェンのインタシビサーナル注射は、皮質中の隣接するCx30発現表面およびパレンキカルアストロサイトに標識することなく、レプトメニンゲン細胞の特異的な組み換えを可能にする(図1)。システルナマグナへのアクセスを得るために、麻酔動物は体と頭部を約120°の角度に配置し、首の後ろを伸ばすことを可能にする(図1A)。硬膜のアトラント後頭部部分は、首の筋肉の鈍い解剖を通して露出され、したがって、基礎となるシステルナマグナへのアクセスを得る。安全な手動注入は先端から3mmでおよそ30°に曲がった針で行われる。これにより、シリンジを頭蓋骨の後頭骨に対して保持することができ、投与中の安定性が向上する(図1...

我々は、頭蓋骨に安定させることができる先端に曲がった針を採用するインタセラセナーナル注射を記述し、したがって、基礎となるパレンチマへの損傷のリスクを排除する。このアプローチは、レプトメニンゲ細胞の遺伝的運命マッピングおよび操作や脳脊髄液の動きを追跡するために使用することができます。

The protocol outlined here describes how to safely and manually inject solutions through the cisterna magna while eliminating the risk of damage to the ...

我々の外科的処置により、レプトメニンゲ細胞の特定の遺伝子編集は、神経発達および細菌性髄膜炎の広がりなどの多くの生理学的および病理学的状態においてその機能を研究することを可能にする。エンドキシフェンの内膜送達中の損傷を最小限に抑えるために、頭蓋骨の尾縁に対して固定できる曲げ針を利用して、組織の深部に浸透するのを防ぎます。この手順は、機能実験の喪失および利益を通じてレプトメニンゲ細胞を発現する遺伝子の役割を調査するために使用することができる。また、脳脊髄液の流れを追跡するために採用することができます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、内膜注射のための注射部位の同定に成功し、後頭部骨に対して針を固定する方法についての理解を確実にする。注射用の30ゲージのベブリング針でハミルトン注射器を準備することから始めます。鉗子を使用して、針を先端から3ミリメートル30度に曲げます。次に、10%DMSOでエンドキシフェンを1ミリリットル当たり1ミリグラムの濃度に希釈し、シリンジをバックフィルする。イオフルランチャンバーで動物を麻酔します。次に、マウスピースが手術用テーブルの表面から約30度の角度になるようにマウスヘッドホルダーを調整し、動物の頭部をホルダーに固定します。水槽マグナへのアクセス性を向上させるために、体の残りの部分と120度の角度を確立し、シスターナマグナへのアクセスを容易にするために首の後ろに拡張する頭を下に傾けたテーブルの表面から約30度に動物の体を配置します。動物が適切に配置されたら、眼科軟膏を塗布し、首の後ろを剃り、アルコール拭きとベタジンで地域を消毒します。手術用はさみを使用して、後頭部骨のレベルから始まり、後頭部に伸びる正中線切開を行います。水槽マグナの上に硬膜を露出させる細かい先端ピンセットで中線から横に引っ張ることによって、表面的な結合組織と首の筋肉を穏やかに分離します。小さな外科用分離器を配置して、手順全体を通して水槽マグナを可視化できるようにします。後頭部骨の尾端を特定し、以前に曲がった針をすぐ下に挿入します。硬膜が穿穿られたら、よりよい安定性を保障する動物のボディに対してシリンジを穏やかに引っ張ることによって、針の曲がった先端が表面の下に浸透することを許す。脳脊髄液の自然な流れとの干渉を避けるために、化合物をゆっくりと注入する。注射後、針を1分間中に置き、細かい先端鉗子の助けを借りて慎重に取り除きます。シアノクリレート接着剤の数滴で皮膚を閉じ、注射部位で局所麻酔薬を塗布します。動物をホルダーから取り出し、暖房パッドのきれいなケージに入れます。その後、意識を取り戻すまで動物を監視してください。Cx30プロモーターの下でCreERを発現するトランスジェニックマウスにおけるエンドキシフェンのインタビシカル注射は、誘導可能な蛍光レポーターであり

induction-leptomeningeal-cells-modification-via-intracisternal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

出典: Zamboni, M., et al., Induction of Leptomeningeal Cells Modification via Icisternal Injection.J. Vis.

Cisterna Magna注射によるマウスモデルにおける標的薬物送達

この動画では、ヒト由来の腫瘍細胞をマウスの脳の大槽に送達する手順を説明しています。同所性マウスモデルを使用して、がんの頭蓋髄膜への転移性転移を研究することができます。...

外科的大槽注射:マウスモデルの中枢神経系に腫瘍細胞を直接投与する方法

このビデオでは、髄膜炎感染を生成するためのマウスモデルへの髄膜炎の腸内送達を実演します。...

髄膜炎菌性髄膜炎を誘発するためのマウスモデルへの髄膜炎菌の槽内送達

このビデオは、広範囲にわたる大脳皮質の脱髄を伴うラットモデルを生成する方法を示しています。これには、組換えミエリン鞘タンパク質でプライミングされたマウスに炎症誘発性サイトカインを注入することにより、血液脳関門を破壊することが含まれます。このプロセスは免疫細胞の浸潤を促進し、広範囲にわたる大脳皮質の脱髄をもたらします。...

ラットモデルにおける広範囲にわたる大脳皮質脱髄の生成

このビデオでは、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を使用して多発性硬化症のマウスモデルを確立しています。マウスにニューロンペプチドとアジュバントを含むエマルジョンを注入すると、自己反応性T細胞を活性化する免疫応答が引き起こされます。これに続いて、百日咳毒素(PTX)を注射して血液脳関門の透過性を高め、自己反応性T細胞が脳に浸潤できるようにします。この浸潤は、最終的にミエリン損傷をもたらすシグナル伝達カスケードを開始し、多発性硬化症の脱髄状態を模倣しています。...

マウスモデルにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の誘導

ここで提示されるプロトコルは、成人雄のダークアグーチラットにおける両方の皮質半球の広範な灰色物質脱髄の再生を可能にする。この方法は、カテーテルの脳内移植、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質に対する非臨床的免疫、および移植されたカテーテルを介した炎症性サイトカイン混合物の脳内注射を含む。...

炎症性サイトカインの脳内注射による広範囲にわたる大脳皮質脱髄のラットモデル

ここでは、成体マウスにおける感染の内因性経路を介して髄膜炎球菌性髄膜炎を誘発する方法について説明する。我々は、接種の調製から内人種差別感染までの髄膜炎球菌感染のステッププロトコルによるステップを提示する。その後、動物の生存を記録し、マウス組織の細菌負荷を評価します。...

インティリカレルナルデリバリーによるマウスにおける髄膜炎球炎血清群Cの誘導

ここでは、患者のOmmaya貯留層に機能的に類似したマウス異種移植片モデルについて述べる。私たちは、普遍的に致命的なレプトメニンゲール病の新しい治療法を研究するためにマウスオンマヤを開発しました。...

レプトメニンゲレス病の直接標的療法を研究するマウス・オンマヤ異種移植片モデル

本プロトコルは、遺伝子編集および薬物送達のために新生児マウスで髄腔内注射を行うためのステップバイステップの指示を概説する。...

ゲノム編集とドラッグデリバリーのための新生児マウスの髄腔内注射

このプロトコルは、マウスの軟髄膜転移を強力に誘導し、外傷および頭蓋外腫瘍の負担を軽減する経皮的穿刺経路を通じて腫瘍細胞を大槽に注入する方法を説明しています。...

マウスにおける軟髄膜転移研究のための低侵襲槽マグナ注射モデル

ここでは、複数の神経疾患に重要な役割を果たすマウス髄膜リンパ管(MLV)を評価するプロトコルを提示します。このプロトコルの目的は、トレーサー排出の機能的評価と背面MLVネットワークの詳細な形態的特徴付けの両方を可能にする統合的手法を提供することです。...

髄膜リンパ質評価のための統合プロトコル:大胸椎注射、リンパ節画像診断、髄膜郭清、全マウント染色

学ぶ、曲げ針を用いたインタビセナール注射法によりレプトメニンゲ細胞の遺伝子改変を行う技術。マウスモデルで神経組織損傷を最小限に抑え、脳脊髄液の動態と細胞機能を正確に解析する方法です。

インタビセナーリナーリ注射によるレプトメニンゲ細胞改変の誘導

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