Name: アシル樹脂アシスト捕捉によるプロテインS-アシル化の検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 学ぶアシル樹脂アシスト捕捉法によるタンパク質S-アシル化の検出技術。生細胞や組織サンプルで複数タンパク質の脂質修飾を同時に解析し、細胞内輸送やシグナル伝達の研究に応用できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、国立衛生研究所の助成金5R01GM115446と1R01GM130840によって支援されました。

このプロトコルで使用されたマウスは、NIHガイドラインに従って安楽死させた。ヒューストンのテキサス大学保健科学センターの動物福祉委員会は、すべての動物の仕事を承認しました。
1. 細胞ライセートの調製
<ol><li>表1に記載されているように、リシスバッファを準備する。PBSを10mLに、0.1gのn-ドデシルβ-D-マルトシド洗剤(DDM)を加え、溶解させて回転させます。100 μL のホスファターゼ阻害剤カクテル 2、ML211(10 μM)、PMSF (10 mM)、プロテアーゼ阻害剤カクテル (1x) を加え、使用前に氷上でバッファーを冷やします。</li>
	<li>培養器から細胞を含む必要な培地を、350 x gで15mLまたは50 mLの円錐形チューブおよびスピン細胞に移し、細胞の破片を取り除くために吸気します。 注:我々は実行される各アシル-RAC反応のために1 x 107細胞を使用しました。</li>
	<li>ペレットをPBS 5 mL に再懸濁し、350 x gで 5 分間回転させて洗浄します。 注:PBSの拡張インキュベーションによる細胞溶菌を避けるために、ステップ1.3を迅速に実行してください。</li>
	<li>ステップ1.1で調製した600μLのリシスバッファーをペレットに加え、4°Cで30分間サーマルシェーカーで1500rpmで振って溶地します。</li>
	<li>透明溶解液は、ペレット洗剤不溶性材料に30分間4°Cで20,000 x gで遠心分離によって。予め冷却された1.5 mLマイクロフュージチューブでクリアしたライセートを収集し、氷の上に保管してください。</li>
	<li>ブラッドフォード/BCAアッセイを実行してタンパク質濃度を推定します。実験を行う前に、異なるサンプル間で同量のタンパク質を確保することが重要です。1回の反応で500μg以上のタンパク質を使用することを推奨します。 注:記載の実験では、マウス組織から培養された(Jurkat)細胞と初代脾細胞を使用しました。上記のライシス法は、他の細胞タイプにも採用することができる。上記の細胞タイプに対して得られる平均タンパク質濃度は、1×107細胞当たり7約500μgである。ジュルカット細胞は、2 mM L-グルタミン、10 mM HEPES、1 mMピルビン酸ナトリウム、4,500mg/Lグルコース、および1,500mg/L炭酸ナトリウムを5%CO2で37°Cで10%FBSを添加して含むRPMI-1640培地で維持した。我々は、反応ごとに1 x 107ジュルカット細胞を使用した。初代脾細胞は、26に記載したマウス脾臓組織から単離した。簡単に言えば、脾臓組織を氷上で浸食し、続いて低張性溶液中の赤血球の溶解と遠心分離によるリンパ球からの分離を行った。反応ごとに1 x 107の一次細胞を使用しました。</li>
</ol>2. アシル-RAC: フリーチオール群の遮断
注: 以降の手順はすべて室温(RT)で実行できます。
<ol><li>リセートを新鮮な1.5 mLマイクロフュージチューブに移し、以下に説明するクロロホルムメタノール(CM)沈殿を行う。<ol>
<li>メタノール(MeOH)とクロロホルム(CHCl3)3を、リセートの最終比でリセートに加え、MeOH:CHCl3 of 2:2:1を、均質な懸濁液を作り出すために激しく振る。</li>
		<li>水相と有機相の間の相でペレット(「パンケーキ」)を形成するために5分間10,000 x gで回転します。</li>
		<li>針またはゲルローディングチップを使用して、チューブを傾け、できるだけ多くの溶媒を吸引します。</li>
		<li>プロテインペレットを数分間空気乾燥し、600 μLのMeOHを加えて穏やかに洗浄し、ペレットを分解しないように穏やかに混合します。</li>
		<li>残りのMeOHを慎重に取り除き、ベンチトップのプロテインペレットを約5分間乾燥させます。</li>
		<li>(オプション)MeOH洗浄後に壊れたペレットをスピンダウンして、試料の損失を避けるために、追加の遠心分離ステップを実行します。 注: CM の降水ステップの後で実験を停止できます。ペレットが得られたら、500 μL の MeOH で-20 °Cで 1 週間まで保存できます。<ol>
<li>2SHBバッファーの200 μLにタンパク質ペレットを溶解し、42°C/1500 rpmでペレットが溶解するまでサーマルシェーカーでボルテックスします。</li>
		</ol>
</li>
		<li>(オプション)ペレットを溶解するために超音波式水浴で追加の5〜10分間インキュベート。 注:超音波処理の長さは、材料の溶解度によって異なります。しかし、長時間の超音波処理はタンパク質分解を引き起こす可能性があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>2SHBバッファーの998 μLに2 μL MMTSを加えて、2SHBで0.2%メチルメタンチオスルホン酸塩(v/v)を2SHBで調製します。 メモ:実験ごとに、作りたての0.2%MMTSを使用してください。</li>
	<li>2SHBに0.2%MMTSの200 μLを加えて、各チューブに0.1%MMTSの最終濃度を加えます。サーマルシェーカーで1500rpmで振るとともに42°Cで15分間インキュベートします。</li>
</ol>3. アシルRAC:ヒドロキシルアミン(HAM)の切断とS-アシル化タンパク質の捕獲
<ol><li>MMTSを除去するために、上記のように3〜4倍のCM沈殿を繰り返します。MMTSの除去は、MMTSの独特の臭気の欠如によって推定することができる。沈殿後、ペレットを溶解するまでサーマルシェーカーで42°C/1500rpmでボルテックスすることにより2SHBバッファーの100μLにペレットを溶解し、次いで300μLのバッファーAで希釈する。</li>
	<li>最終沈殿後、上記の2SHBバッファの200μLにサンプルを溶解し、240 μLのバッファAで希釈します。</li>
	<li>いくつかの処置条件に応じてS-acylationの変化を比較する場合、再びタンパク質濃度を測定し、各条件に対して同量のタンパク質を使用して進めます。</li>
	<li>各サンプルから40μLを入力コントロールとして保持します。</li>
	<li>サンプルを200 μLの2つの等しい部分に分割し、チューブを「+HAM」と「-HAM」としてマークします。50 μLの新たに調製したニュートラル 2 M HAM (pH 7.0-7.5) をチューブの 1 つに 400 mM の最終濃度 (+ HAM) に加え、2番目のチューブ (- HAM) に 50 μL を加え、負のコントロールとして使用します。チオプロピル・セファローズ(TS)ビーズの添加に進みます。 注: CM の降水ステップの後で実験を停止できます。ペレットが得られたら、500 μL の MeOH で-20 °Cで 1 週間まで保存できます。2 M HAM の中性 pH は、アシルシステインチオエステル結合の選択性を保証し、慎重に調整する必要があります。過度の発泡によるサンプルの損失を避けるために、2SHBバッファでサンプルを取り扱う際には注意が必要です。以下のすべてのステップは、HAM および + HAM サンプルと同じです。</li>
	<li>各チューブに30 μLのTSビーズスラリーを加え、RTで1~2時間回転させます。</li>
	<li>TSビーズをバッファAに1%SDSで4倍洗い、残ったHAMを取り除きます。<ol>
<li>マイクロフュージを使用して1分間、すべてのビーズサンプルをそっとスピンダウンし、上清を慎重に吸引します。</li>
		<li>バッファー A のビーズを 500 μL の 1% SDS で再中断します。</li>
		<li>ステップ 3.7.1 ~ 3.7.2 を繰り返します。 注:活性化チオプロピルセファローズ(TS)は、カップリングする前に中性pHで洗い流さなければならない添加剤の存在下で凍結乾燥供給される。蒸留水は、膨潤や洗浄におすすめです。0.1gのビーズの重量を量り、蒸留水1mLで再懸濁し、RTで30分間回転しながら膨らまじ、緩衝液Aでビーズ1xを洗浄し、50%のゲル化培地から50%のバッファーの比率でスラリーを調製します。腫れたTSは、4°Cで1週間まで20%エタノールの存在下で中性pHで保存され得る。アジドイオンは2-ピリジルジスルフィド基と反応するため、静電剤としてアジドナトリウムを使用しないでください。より高い効率のために、新鮮なビーズを準備します。ビーズを取り扱いながら、P200ピペットチップの先端を少し切って、損傷を防ぐことができます。 注:CMの降水後の任意の段階で実験を停止することができます。ペレットは、MeOHの500 μLで-20°Cで1週間まで保存することができます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. S-アシル化タンパク質の溶出と検出
<ol><li>最後の洗浄後、上記のようにビーズを軽く回転させ、ビーズを邪魔することなくできるだけ多くの上澄み物を吸い込みます。</li>
	<li>DTTを使用して4倍のSDSサンプルバッファーを使用してビーズからタンパク質を回収します。<ol>
<li>ビーズに50 μLの4倍のSDSサンプルバッファーを加え、80°Cでインキュベートし、サーマルシェーカーで15分間1500rpmでインキュベートします。チューブを冷まします。</li>
		<li>5,000 x gでビーズを 3 分間遠心分離し、ビーズを完全にペレットし、ゲルローディングチップを使用して溶出したタンパク質を新鮮な 1.5 mL チューブに移します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>SDS-PAGEを実行し、ウェスタンブロッティングによって目的のタンパク質のS-アシル化を分析します。</li>
</ol>

<ol><li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1-2), 93-103 (2009).</li>
<li>Magee, A. I., Courtneidge, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+classes+of+fatty+acid+acylated+proteins+exist+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Two classes of fatty acid acylated proteins exist in eukaryotic cells.</a> EMBO Journal. 4 (5), 1137-1144 (1985).</li>
<li>Fujimoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-selectin+is+acylated+with+palmitic+acid+and+stearic+acid+at+cysteine+766+through+a+thioester+linkage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">P-selectin is acylated with palmitic acid and stearic acid at cysteine 766 through a thioester linkage.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (15), 11394-11400 (1993).</li>
<li>DeMar, J. C., Anderson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+quantitation+of+the+fatty+acids+composing+the+CoA+ester+pool+of+bovine+retina%2C+heart%2C+and+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification and quantitation of the fatty acids composing the CoA ester pool of bovine retina, heart, and liver.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (50), 31362-31368 (1997).</li>
<li>Montigny, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S+-Palmitoylation+and+S+-Oleoylation+of+Rabbit+and+Pig+Sarcolipin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">S -Palmitoylation and S -Oleoylation of Rabbit and Pig Sarcolipin.</a> Journal of Biological Chemistry. 289 (49), 33850-33861 (2014).</li>
<li>Muszbek, L., Laposata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+modification+of+proteins+by+arachidonate+and+eicosapentaenoate+in+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Covalent modification of proteins by arachidonate and eicosapentaenoate in platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (24), 18243-18248 (1993).</li>
<li>Hallak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+binding+of+arachidonate+to+G+protein+alpha+subunits+of+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Covalent binding of arachidonate to G protein alpha subunits of human platelets.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 4713-4716 (1994).</li>
<li>Tsutsumi, R., Fukata, Y. F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+protein-palmitoylating+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archive%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Discovery of protein-palmitoylating enzymes.</a> Pflügers Archive: European Journal of Physiology. , 1206(2008).</li>
<li>Webb, Y., Hermida-Matsumoto, L., Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+protein+palmitoylation%2C+raft+localization%2C+and+T+cell+signaling+by+2-bromopalmitate+and+polyunsaturated+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Inhibition of protein palmitoylation, raft localization, and T cell signaling by 2-bromopalmitate and polyunsaturated fatty acids.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (1), 261-270 (2000).</li>
<li>Paige, L. A., Nadler, M. J., Harrison, M. L., Cassady, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+palmitoylation+of+the+protein-tyrosine+kinase+p56lck%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reversible palmitoylation of the protein-tyrosine kinase p56lck.</a> Journal of Biological Chemistry. 268, 8669-8674 (1993).</li>
<li>Blanc, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SwissPalm%3A+Protein+Palmitoylation+database%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">SwissPalm: Protein Palmitoylation database.</a> F1000Research. 4 (0), 1-23 (2015).</li>
<li>O'Brien, P. J., Zatz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acylation+of+bovine+rhodopsin+by+%5B3H%5Dpalmitic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Acylation of bovine rhodopsin by [3H]palmitic acid.</a> Journal of Biological Chemistry. 259 (8), 5054-5057 (1984).</li>
<li>Drahansky, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((We+are+IntechOpen+%2C+the+world%27s+leading+publisher+of+Open+Access+books+Built+by+scientists%5BTitle%5D)+AND+%22Intech%22%5BJournal%5D)">We are IntechOpen , the world's leading publisher of Open Access books Built by scientists.</a> Intech. 13, (2016).</li>
<li>Resh, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+analogs+and+inhibitors+to+study+the+functional+significance+of+protein+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Use of analogs and inhibitors to study the functional significance of protein palmitoylation.</a> Methods. 40 (2), 191-197 (2006).</li>
<li>Drisdel, R. C., Green, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+and+quantifying+sites+of+protein+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Labeling and quantifying sites of protein palmitoylation.</a> Biotechniques. 36 (2), 276-285 (2004).</li>
<li>Martin, B. R., Cravatt, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+profiling+of+protein+palmitoylation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Large-scale profiling of protein palmitoylation in mammalian cells.</a> Nature Methods. 6, 135-138 (2009).</li>
<li>Rami, N., Hannoush, N. A. -R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+lipidome%3A+omega-alkynyl+fatty+acids+for+detection+and+cellular+visualization+of+lipid-modified+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging the lipidome: omega-alkynyl fatty acids for detection and cellular visualization of lipid-modified proteins.</a> ACS Chemical Biology. 4 (7), 581-587 (2009).</li>
<li>Kostiuk, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+palmitoylated+mitochondrial+proteins+using+a+bio-orthogonal+azido-palmitate+analogue%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Identification of palmitoylated mitochondrial proteins using a bio-orthogonal azido-palmitate analogue.</a> FASEB Journal. 22 (3), 721-732 (2008).</li>
<li>Charron, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+Fluorescent+Detection+of+Protein+Fatty-Acylation+with+Chemical+Reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Robust Fluorescent Detection of Protein Fatty-Acylation with Chemical Reporters.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (13), 4967-4975 (2009).</li>
<li>Roth, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+protein+palmitoylation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of protein palmitoylation in yeast.</a> Cell. 125, 1003-1013 (2006).</li>
<li>Kang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+palmitoyl-proteomics+reveals+dynamic+synaptic+palmitoylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural palmitoyl-proteomics reveals dynamic synaptic palmitoylation.</a> Nature. 456 (7224), 904-909 (2008).</li>
<li>Forrester, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+analysis+of+protein+S+-acylation+by+resin-assisted+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Site-specific analysis of protein S -acylation by resin-assisted capture.</a> Journal of Lipid Research. 52 (2), 393-398 (2011).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Profiling+of+Cysteine-Based+Reversible+Modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Proteomic Profiling of Cysteine-Based Reversible Modifications.</a> Nature Protocols. 9 (1), 64-75 (2014).</li>
<li>Zaballa, M. E., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+era+of+protein+S-acylation%3A+spotlight+on+structure%2C+mechanisms%2C+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The molecular era of protein S-acylation: spotlight on structure, mechanisms, and dynamics.</a> Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53 (4), 420-451 (2018).</li>
<li>Edmonds, M. J., Geary, B., Doherty, M. K., Morgan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+brain+palmitoyl-proteome+using+both+acyl-biotin+exchange+and+acyl-resin-assisted+capture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of the brain palmitoyl-proteome using both acyl-biotin exchange and acyl-resin-assisted capture methods.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).</li>
<li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+activation+of+murine+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and activation of murine lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (116), 1-8 (2016).</li>
<li>Schneider, U., Schwenk, H., Bornkamm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+EBV-genome+negative+%22null%22+and+%22T%22+cell+lines+derived+from+children+with+acute+lymphoblastic+leukemia+and+leukemic+transformed+non-Hodgkin+lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma.</a> International Journal of Cancer. 19, 621-626 (1977).</li>
<li>Bijlmakers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+acylation+and+localization+in+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein acylation and localization in T cell signaling.</a> Molecular Membrane Biology. 26 (1), 93-103 (2009).</li>
<li>Hundt, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylation-Dependent+Plasma+Membrane+Transport+but+Lipid+Raft-Independent+Signaling+by+Linker+for+Activation+of+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Palmitoylation-Dependent Plasma Membrane Transport but Lipid Raft-Independent Signaling by Linker for Activation of T Cells.</a> Journal of Immunology. 183 (3), 1685-1694 (2009).</li>
<li>Orwick-Rydmark, M., Arnold, T., Linke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+detergents+to+purify+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">The use of detergents to purify membrane proteins.</a> Current Protocols in Protein Science. 84, 4810-4835 (2016).</li>
<li>Brdicka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoprotein+associated+with+glycosphingolipid-enriched+microdomains+%28PAG%29%2C+a+novel+ubiquitously+expressed+transmembrane+adaptor+protein%2C+binds+the+protein+tyrosine+kinase+csk+and+is+involved+in+regulation+of+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (9), 1591-1604 (2000).</li>
<li>Akimzhanov, A. M., Boehning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+transient+palmitoylation+of+the+tyrosine+kinase+Lck+mediates+Fas+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid and transient palmitoylation of the tyrosine kinase Lck mediates Fas signaling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11876-11880 (2015).</li>
<li>Stetsenko, A., Guskov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+the+top+ten+detergents+used+for+membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Crystals%22%5BJournal%5D)">An overview of the top ten detergents used for membrane protein crystallization.</a> Crystals. 7 (7), (2017).</li>
<li>Adibekian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+characterization+of+a+triazole+urea+dual+inhibitor+for+lysophospholipase+1+%28LYPLA1%29+and+lysophospholipase+2+%28LYPLA2%29%5BTitle%5D)+AND+%22Probe+Reports+from+the+NIH+Molecular+Libraries+Program%22%5BJournal%5D)">Optimization and characterization of a triazole urea dual inhibitor for lysophospholipase 1 (LYPLA1) and lysophospholipase 2 (LYPLA2).</a> Probe Reports from the NIH Molecular Libraries Program. 1, 1-42 (2013).</li>
<li>Dekker, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibition+of+APT1+affects+Ras+localization+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibition of APT1 affects Ras localization and signaling.</a> Nature Chemical Biology. 6, 449-456 (2010).</li>
<li>Zhou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-background+acyl-biotinyl+exchange+largely+eliminates+the+coisolation+of+non-+s-acylated+proteins+and+enables+deep+s-acylproteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low-background acyl-biotinyl exchange largely eliminates the coisolation of non- s-acylated proteins and enables deep s-acylproteomic analysis.</a> Analytical Chemistry. 91 (15), 9858-9866 (2019).</li>
<li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (49), 17534-17539 (2014).</li>
<li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (16), 4302-4307 (2016).</li>
</ol>

利益相反は宣言されていません。

ここで、マウス組織由来の培養ヒト細胞および一次細胞の両方で選択したタンパク質のS-アシル化を検出するために、アシル-RACアッセイを利用することに成功しました。この方法は、単純で敏感であり、標準的な生化学技術を使用して最小限の装置要件で簡単に行うことができます。この方法は、タンパク質転写系のβサブユニット(Sec61b)、リボソームタンパク質S11(Rps11)、およびミクロソームグルタチオン-S-トランストランスファーゼ3(MGST3)22のような新規S-acylate化タンパク質22を同定することに成功することが示されている。アシルRACの感度と適応性は、様々な生物学的サンプル中のタンパク質S-アシル化を研究するのに適しています。
S-acylatedタンパク質のかなりの割合は、脂質いかだとしても知られている原形質膜のグリコスフィンゴ脂質濃縮部分と関連付けることができます。したがって、トリトンX-100、NP-40またはBrij58のような中性洗剤がリシス30に使用...

S-アシル化は、陰唇チオエステル結合1を介して標的タンパク質上のシステイン残基に脂肪アシル鎖を付加することを含む可逆的な翻訳後修飾である。それはパルミテ酸塩、飽和16-炭素脂肪酸2を有するタンパク質の修飾として最初に報告された、したがって、この修飾は、しばしばS-パルミトイル化と呼ばれる。パルミチン酸に加えて、タンパク質は、様々な長く短い飽和(ミリステイトおよびステアレート)、一価不飽和(オレ酸塩)および多価不飽和(アラキドキおよびエイコサペンタノエート)脂肪酸33、4、5、6、74,5,6,7によって可逆的に修飾することができる。真核細胞において、S-アシル化はDHHCタンパク質アシルトランスセラーゼとして知られる酵素ファミリーによって触媒され、システイン脱アシル化の逆反応はタンパク質チオエステラーゼによって触媒され、そのほとんどは依然として謎8のままである。
チオスター結合の可射性により、この脂質修飾を可逆的にし、タンパク質のクラスタリング、細胞質膜局在、細胞内の密売、タンパク質相互作用およびタンパク質安定性99,1010を動的に調節することを可能にする。その結果、S-アシル化は、ハンチントン病、アルツハイマー病およびいくつかのタイプの癌(前立腺癌、胃、膀胱、肺、大腸)を含むいくつかの障害に関連しており、この翻訳後タンパク質改変11を検出するための信頼できる方法の開発を必要とする。
パルミテは、放射性([3H]、14C)または3[125I])を用いた代謝標識は、タンパク質S-アシル化12、13、14,13,をアッセイするために開発された最初のアプローチの1つである。14しかしながら、放射線標識ベースの方法は健康上の懸念を提示し、非常に敏感ではなく、時間がかかり、そして非常に豊富なタンパク質15の脂質を検出するだけである。放射性標識に対するより速く非放射性の代替は、生体直交脂肪酸プローブによる代謝標識であり、これはタンパク質S-アシル化16の測定ダイナミクスをアッセイするために日常的に使用される。この方法では、化学レポーターを有する脂肪酸(アルキンまたはアジ化基)を、アシルトランスファーーゼタンパク質によってS-acylatedタンパク質に組み込む。アジドアルキン・ウイスゲン・シクロ付加反応(クリック化学)は、フッ素酸またはビオチンなどの官能性基を、S-acylateタンパク質17、18、19,18,19の検出を可能にする集積脂肪酸に付着させるために使用することができる。
アシルビオチン交換(ABE)は、組織サンプル15に不適当な代謝標識の欠点のいくつかをバイパスするS-acylatedタンパク質の捕捉および同定に広く用いられている生化学的方法の1つである。この方法は、組織および凍結細胞試料20,21,21を含む多様な生物学的サンプルにおけるS-アシル化の分析に適用することができる。この方法は、中性ヒドロキシルアミンによるアシル基とシステイン残基との間のチオエステル結合の選択的切断に基づく。遊離チオール基は、次いでチオール反応性ビオチン誘導体で捕捉される。生成されたビオチン化タンパク質は、ストレプトアビジンアガロースを使用して親和性精製され、免疫ブロッティングによって分析されます。
アシル樹脂アシスト捕捉(Acyl-RAC)と呼ばれた代替アプローチは、後に、シオール反応性樹脂22,23,23による遊離システインの直接結合と共にビオチン化ステップを置き換えるために導入された。この方法は、ABEと比較して少ないステップを有し、同様に、サンプル1の広い範囲でタンパク質S-アシル化を検出するために使用することができる。
Acyl-RACは4つの主要なステップ(図1)で構成されています。 1. 無料チオール群のブロック; 2. システイン-アシルチオエステル結合の選択的切断中性ヒドロキシルアミン (HAM) システインチオール基を露出する; 3. チオール反応性樹脂を用いた脂質化されたシステインの捕獲; 4. 還元バッファーと溶出後の S-acylated タンパク質の選択的濃縮.
次いで、捕捉したタンパク質を免疫ブロッティングにより分析するか、または質量分析(MS)ベースのプロテオミクスを行い、S-acylatedプロテオームを様々な種および組織22、24、2524,25の範囲で評価することができる。22個々のS-アシル化部位は、捕捉されたタンパク質のトリプシン消化およびLC-MS/MS22による得られたペプチドの分析によっても同定することができる。ここでは、細胞株と組織サンプルの両方で、複数のタンパク質のS-アシル化を同時に検出するためにacyl-RACを使用する方法を示す。

<table><tbody><tr><td>cOmpleteプロテアーゼ阻害剤カクテル錠</td><td>Sigma</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5424</td><td>Eppendorf</td><td>22620444</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxylamine (HAM)</td><td>Sigma</td><td>159417</td><td></td></tr><tr><td>Methyl methanethiosulfonate (MMTS)</td><td>Sigma</td><td>64306</td><td></td></tr><tr><td>Miniチューブローテ</td><td>ーターLabForce</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ML211</td><td>ケイマン</td><td>17630</td><td></td></tr>マルチ<tr><td>サームクールヒートシェイク</td><td>ベンチマーク</td>科学<td>H5000-HCn</td><td></td></tr><tr><td>-ドデシル&β;-D-マルトシド(DDM)</td><td>シグマ</td><td>D641</td><td></td></tr><tr><td>ホスファターゼ阻害剤カクテル2</td>シ<td>グマ</td><td>P5726</td><td></td></tr><tr><td>チオプロピルセファロース6B(TS)</td><td>シグマ</td><td>T8387</td><td></td></tr>超音波ク<tr><td>オントレックスソニケーターL</td><td>&;アール</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

アシル樹脂アシスト捕捉によるプロテインs-アシル化の検出

Detection of Protein S-Acylation using Acyl-Resin Assisted Capture

プロテインS-アシル化は、S-パルミトイル化とも呼ばれ、陰茎チオエステル結合を介して長鎖脂肪酸を有するシステイン残基の可逆的な翻訳後修飾である。広範囲にわたる調節機構として出現するS-acylationは、複雑な形成からタンパク質の密売およびタンパク質安定性に至る、タンパク質の生物学的活性のほぼすべての側面を調節することができる。タンパク質S-アシル化の生物学的機能の理解の最近の進歩は、様々な生物学的サンプルにおけるタンパク質S-acylationの堅牢かつ敏感な検出を可能にする新しい生化学的ツールの開発によって大きく達成された。ここでは、チオール反応性セファロースビーズによる内因性S-acylatedタンパク質の選択的捕捉に基づく最近開発された方法であるアシル樹脂支援捕捉(Acyl-RAC)について述べている。既存のアプローチと比較して、Acyl-RACは、より少ないステップを必要とし、新しいS-アシル化ターゲットの同定のための質量分析と結合された場合、より信頼性の高い結果を得ることができます。この技術の主な制限は、同じチオスター結合を介してシステインに結合した脂肪酸種を区別する能力の欠如である。

上述したプロトコルに従って、我々は最初に、T細胞白血病患者27の末梢血に由来する不死化T細胞株であるJurkat細胞における複数のタンパク質のS-アシル化を同時に検出するために、acyl-RACを用いた。この方法の有用性を実証するために、以前にS-acylated9,289,28,2929と同定された調節性T細胞タンパク質が選択された。図2Aに示すように、チロシンキナーゼLckは、システイン残基と脂肪酸部分(+HAMレーン)との間のチオエステル結合を切断するために中性2Mヒドロキシラミンで処理されたライセートで検出することができる。2M NaCl(-HAMレーン)で処理した試料は重要な陰性対照を表し、チオエステル結合の検出に対するアッセイの選択性を示す。入力レーンは、シグナルの特異性をさらに確認し、目的のタンパク質がS-acylatedでない場合...

Acyl-RAC(アシル-レジンアシストキャプチャ)は、様々な生物学的サンプル中のシステイン残基の可逆的脂質修飾(S-acylation)を検出する方法を非常に敏感で、信頼性が高く、実行しやすいです。

アシル樹脂アシスト捕捉によるプロテインS-アシル化の検出

Protein S-acylation, also referred to as S-palmitoylation, is a reversible post-translational modification of cysteine residues with long-chain fatty ...

アシル樹脂アシストキャプチャまたはアシルRACは、様々な生物学的サンプルでプロテインS-アシル化を検出するために使用できる敏感で信頼性の高い方法です。このプロトコルは、代謝標識とラジオ標識の制限の一部をバイパスし、複数のタンパク質のS-acylationの同時検出を可能にします。生細胞だけでなく、一次組織や凍結サンプルも。S-acylationは、タンパク質の密売、血漿膜ターゲティング、シグナル伝達、鉄輸送、タンパク質-タンパク質相互作用など、さまざまな細胞プロセスを調節することができます。チオスター結合の効率的かつ特異的な切断を確実にするために、各実験に対して慎重に調整されたpHで作りたてのヒドロキシルアミン溶液を使用することが重要です。この方法のデモンストレーションでは、クロロホルム、メタノール沈殿のようなステップのために重要です。このステップの間に得られるパンケーキの形のペレットは非常に注意深く扱うべきである。それは、工程中にサンプルの壊れやすいおよび部分的な損失であり、不均一なサンプル回復につながる可能性があります。この手順のデモンストレーションは、私たちの研究室の大学院生であるサバンナ・ウェストです。細胞ライセートを得るために、目的の細胞を円錐形遠心分離管に集める。遠心分離により細胞の破片を除去します。ペレットをPBSの5ミリリットルで洗います。そして、すぐに作りたてのリシスバッファーの600マイクロリットルで細胞を再懸濁します。サーモシェーカーで1分あたり1,500回転でサンプルを4°Cで30分間攪拌します。溶解物をクリアする前に、ペレット洗剤および可溶性物質を遠心分離によって。遠心分離の終わりに、氷の上に予冷した1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管にクリアしたライセートを集める。そして、ブラッドフォードまたはビチンチオニン酸アッセイを実行して、標準的なプロトコルに従ってタンパク質濃度を推定する。メタノールとクロロホルムを加えて、2:1の比率でライセートします。均質な懸濁液を作成し、サンプルを遠心分離して、水相と有機相の界面でタンパク質ペレットを収集するために厳密に振ります。チューブを傾け、できるだけ多くの溶媒を吸引するために針またはゲルローディングチップを使用してください。空気は、数分間、タンパク質ペレットを乾燥させます。600マイクロリットルのメタノールでチューブ内容物を軽く混合する前に、ペレットを分解しないように注意してください。メタノール洗浄を慎重に除去した後、ベンチトップのプロテインペレットを約5分間乾燥させます。次に、2SHBバッファーの200マイクロリットルでタンパク質ペレットを再懸濁する。そして、サーモシェーカーで摂氏42度と毎分1、500回転で渦。ペレットが溶解したら、2SHBに0.2%MMTSの200マイクロリットルをサンプルに加えます。そして、熱シェーカーで摂氏42度で15分間、毎分1,500回転をインキュベートします。インキュベーションの終わりに、実例のように3:4クロロホルムメタノール沈殿を行う。MMTSを除去するには、ペレットをボルテックスで新鮮な2SHBバッファーの100マイクロリットルに溶解します。そして、各沈殿後に300マイクロリットルのバッファーAでサンプルを希釈する。最終的な沈殿後、2SHBバッファーの200マイクロリットルにサンプルを溶解し、240マイクロリットルのバッファーAで希釈し、タンパク質濃度を再び測定し、各サンプルから40マイクロリットルを入力コントロールとして確保します。サンプルを200マイクロリットルの2つの等しい量に分割します。そして、プラスヒドロキシラミンとマイナスヒドロキシラミンとしてチューブをマークします。プラスヒドロキシルアミンチューブに400ミリモルの最終濃度に作りたての中性2モルヒドロキシラミンの50マイクロリットルを追加します。そして50マイクロリットルの中性2モル塩化ナトリウムを負の対照に、マイナスヒドロキシルアミンチューブとした。その後、各チューブに30マイクロリットルのTSビーズスラリーを加えます。そして、室温で1〜2時間チューブを回転させます。インキュベーションの終わりに、ビーズをバッファーAに1%SDSで4回洗浄し、残留ヒドロキシルアミンを除去します。最後の洗浄後、3つの穏やかな1分間のマイクロ遠心ですべてのビーズサンプルを洗います。慎重に上清を吸引し、各洗浄時にバッファーAの1%SDSの500マイクロリットルでビーズを再懸濁する。最後の洗浄後、実演したようにビーズをそっと回転させます。そして、ビーズを邪魔することなく、できるだけ多くの上清を吸引します。ビーズからタンパク質を回収するには、各チューブに4%SDSサンプルバッファーの50マイクロリットルを加え、サーモシェーカーで15分間、摂氏80度、1分あたり1,500回転でサンプルをインキュベートします。インキュベーションの終わりに、サンプルを冷やしてから遠心分離機を放ち、ビーズを完全にペレットにします。次に、ゲルローディングチップを使用して、溶出したタンパク質を新しい1.5ミリリットルチューブに移します。そして、SDS-PAGEゲルでサンプルを実行して、ウェスタンブロッティングによる目的のタンパク質のS-アシル化を分析します。チロシンキナーゼLckは、中性2モルヒドロキシルアミンで処理されるライセートで検出することができる。システイン残基と脂肪酸部分との間のチオスター結合を切断する。FynおよびLATタンパク質に対する抗体によるストリッピングと再確認は、アシル樹脂支援捕捉アッセイを使用して、複数のタンパク質のS-acylationを同時に分析できることを実証しています。さらに、Lck、Fyn、およびLATのS-アシル化は、一次マウスの脾細胞において容易に検出することができる。この修飾が2種間で保存されていることを示す。新しいS-acylatedタンパク質の同定に加えて、この方法は、異なる生物学的条件下でのタンパク質S-アシル化の変化を評価するためにも使用することができる。新たに同定されたS-acylatedタンパク質の数は、ダブルアップがAcyl-RACのような高速で信頼性の高い技術を意味した後、大幅に増加しました。新しいS-acylatedタンパク質の同定に加えて、この方法は、異なる生物学的条件下でのタンパク質S-アシル化の変化を評価するためにも使用することができる。

detection-of-protein-s-acylation-using-acyl-resin-assisted-capture

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

キャプチャ化合物は、光架橋および精製に続いて​​機能的な可逆小分子 -...

メチルトランスフェラーゼのプロファイリングおよびその他の S -アデノシル- L</subキャプチャの複合質量分析法（CCMS）別> -ホモシステイン結合タンパク質

細胞表面タンパク質は、生物学的に重要かつ広範にグリコシル化されている。我々は、可溶化豊かに、そして容易なLC-MSベースのプロテオミクス解析のための脱グリコシル化は、これらのタンパク質には、ここグリコペプチド捕捉アプローチをご紹介します。...

細胞表面プロテオミクスのための糖ペプチドキャプチャ

このプロトコルは、サーチュインの特異的脱アセチル化基質としてのタンパク質の役割を確立し、翻訳後修飾としての可逆的リジンアセチル化の役割をさらに研究するために、in vitroおよびin...

脱アセチル化アッセイは、サーチュインの間にInterplay（SIRT2）と特異的なタンパク質 - 基質を解明します

タンパク質機能、時空間的な細胞内局在、タンパク質-タンパク質相互作用ネットワークを調査するための、局在化および親和性精製(LAP)タグ付き誘導性安定細胞株の生成方法について説明します。...

タンパク質機能を調べるための誘導LAP-タグ付けされた安定な細胞株、時空間局在とタンパク質相互作用ネットワーク

シアル酸は、典型的な単糖単位の複合糖質は、です。分子と細胞の相互作用の茄多になっています。代謝独自のN- acetylmannosamine...

Nを用いたシアル酸の代謝独自-アシル-Mannosamines を変更

複数の調査、ターゲット蛋白質の翻訳後修飾を内因性は非常に挑戦的なすることができます。ここで説明したテクニックを活用開発特定 PTM ターゲットでターゲットのアセチル化、ユビキチン化、sumo 化 2/3、およびチロシンのリン酸化の変更を検出する親和性のマトリックス最適化された換散バッファーとフィルター システム1...

標的タンパク質の翻訳後修飾の内因性プロファイルを識別するために包括的な免疫沈降濃縮システムを活用

部位特異的タンパク質アセチル化および/またはサクシニル化入居 (化学量論) 内因性変更後導入された変更のレシオ メトリック分析を通して全体の proteome...

部位特異的タンパク質のリジンのアセチル化のサクシニル化化学量論組成データに依存しない取得質量分析法による定量

複雑な生体試料から生じるユビキチン化タンパク質を起源とするdiGlyペプチドの精製、検出、同定方法を紹介します。提示された方法は、ユビキチノメ分析の深さのレベルに関して、再現性、堅牢性、および優れたメソッドを上回る。...

ペプチド濃縮と質量分析によるタンパク質ユビキチン化部位の検出

このワークフローは、定量的なグローバルプロテオーム分析のために、複数のタンパク質翻訳後修飾(PTM)を同時に時間効率とコスト効率の高い濃縮のパフォーマンスを説明します。このプロトコルは、ペプチドレベルPTM濃縮を複数の結合抗体で利用し、続いてデータ非依存の獲得質量分析を行い、PTMクロストークに関する生物学的洞察を得る。...

定量化とサイトローカリゼーションのための2つの翻訳後修飾の同時アフィニティエンリッチメント

脂肪アシル化の研究は、細胞タンパク質相互作用および疾患において重要な意味を有する。ここでは、脂肪アシル化タンパク質のクリックケミストリー検出を改善するための修正プロトコルを示しており、これは様々な細胞タイプに適用し、パルスチェイスおよび質量分析を含む他のアッセイと組み合わせることができる。...

クリックケミストリーを用いた脂肪酸アシル化タンパク質の検出のためのアルキニル脂肪酸類似体の最適化された組み込み

タンパク質チオール酸化は、通常の生理学的および病態生理学的条件下で重要な意味を持ちます。レジンアシストキャプチャー、アイソバリック標識、質量分析を利用して、タンパク質の可逆的に酸化されたシステイン残基の部位特異的同定と定量を可能にする定量的レドックスプロテオミクス法の詳細について説明します。...

タンパク質チオール酸化の多重化定量のための同重体タンデム質量タグ標識と組み合わせた樹脂支援キャプチャ(英語)

学ぶアシル樹脂アシスト捕捉法によるタンパク質S-アシル化の検出技術。生細胞や組織サンプルで複数タンパク質の脂質修飾を同時に解析し、細胞内輸送やシグナル伝達の研究に応用できます。

アシル樹脂アシスト捕捉によるプロテインS-アシル化の検出

さらに動画を探す