Name: 脳膜タンパク質のパルミトイル化定量に関するアシル-PEGyl交換ゲルシフトアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: 学ぶ APEGSアッセイを用いたマウス脳膜タンパク質のパルミトイル化定量法。親和精製不要でゲルシフト変化を利用し、神経科学におけるタンパク質修飾解析を簡便かつ迅速に行う手法です。

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著者らは、APEGSアッセイに関するアドバイスとインプットをK.ウールフリーに感謝する。これらの研究は、ホワイトホール財団とNIH-NIMH(1R01MH119347)からE.D.への研究助成金によって資金提供されました。

すべての動物の手順は、国立衛生研究所(NIH)が定めたガイドラインに従い、カリフォルニア大学デービス校の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されています。
1. マウス脳膜の調製
<ol><li>ギロチン装置を使用してマウスの首を切り落とし、脳を急速に解剖する(可能であれば、解剖中に起こり得るパルミトイル化の変化を最小限に抑えるために、可能であれば、1分)。10 mLの均質化バッファー (表 1)をガラスホモジナイザー(〜12ストローク)で氷上で直ちに均質化する。</li>
	<li>遠心分離機は4°Cで1,400 x gで15分間にリセートする。上清を氷上の新しいチューブに移します。ペレットを均一な体積の均質化バッファーと遠心分離機の 710 x gで 4 °C で 10 分間再懸濁します。</li>
	<li>ステップ1.2の上清と遠心分離機を40,000 x gで4°Cで20分間組み合わせます。</li>
	<li>上清(細胞質画分)を捨て、ペレット化膜(P2)分を均質化緩衝液中で再懸濁する。 メモ:サンプルは、フラッシュ冷凍し、後で使用するために-80°Cで保存することができます。</li>
	<li>タンパク質レベルを定量化するために、ブチンチオン酸(BCA)アッセイを行います。APEGSアッセイの場合、1.5 mLチューブ内のバッファA(表1)の470 μLの体積で~100〜200mgのタンパク質(最大250mg)から始めます。25°Cで10分間、13,000 x gの超音波処理と遠心分離機を用いて不溶性タンパク質を除去します。可溶化したタンパク質を新しい1.5 mLチューブに移します。</li>
</ol>2. アシル-PEGyl交換ゲルシフト(APEGS)アッセイ
<ol><li>ディスルフィド債を破壊し、自由なシステインをブロックする。<ol>
<li>25 mMトリス(2-カルボクセチル)ホスフィン(TCEP;25 μL、ストック溶液から添加)でインキュベートすることにより、ジスルフィド結合を破壊する。表 1)55°Cで60分間。</li>
		<li>50 mM N-エチルマライムミド(NEM;12.5 μL)を含む無料システインをブロックし、ストック溶液から添加する。表 1)室温で3時間。 注:反応は一晩延長することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>クロロホルムメタノール(CM)沈殿を行う。<ol>
<li>1.5 mLチューブからポリプロピレンまたはガラスチューブにタンパク質溶液を移し、適度な速度で揺れるバケットローターで遠心分離することができます。5 mLの管は理想的である。メタノール(MeOH)と渦の4つのボリューム(2 mL)を短時間追加します。</li>
		<li>クロロホルムと渦の2つのボリューム(1 mL)を簡単に追加します。</li>
		<li>dH2Oと渦の3つのボリューム(1.5 mL)を短時間追加します。</li>
		<li>3,000 x gで 30 分間、25 °C のスイング バケット ローターでサンプルを遠心します。</li>
		<li>上のフェーズを慎重に削除して破棄します。</li>
		<li>3巻(1.5mL)のMeOHを加え、不透明なプロテインパンケーキを断片化しないように注意して、穏やかに、しかし徹底的に混ぜます。</li>
		<li>3,000 x gで25°Cで10分間、揺れるバケットローターで遠心分離機。</li>
		<li>ガラス血清学的ピペットを使用して、タンパク質パンケーキを邪魔することなく、できるだけ多くのトップフェーズを取り除きます。</li>
		<li>慎重にMeOHの1 mLでペレットをすすいでください。</li>
		<li>ペレットを少なくとも10分間空気乾燥します。 注:乾燥ペレットは-20°Cで保存することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>パルミトイルチオエステル結合とヒドロキシルアミン(NH2OH,HAM)の切断を行う。<ol>
<li>タンパク質沈殿を125 μLのバッファーAと超音波処理で短時間再懸濁します。25°Cで10分間13,000xgの遠心分離機を用い、不溶性物質を除去する。 g可溶化したタンパク質を新しい1.5 mLチューブに移します。</li>
		<li>バッファH(HAM+;)の375 μLを加える;表 1)またはバッファー T (HAM-;表 1)25°Cで60分間サンプルをインキュベートする。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ステップ2.2に記載のCM沈殿を繰り返す。 注:乾燥ペレットは-20°Cで保存することができます。</li>
	<li>保護されていないシステインに mPEG を追加します。.<ol>
<li>10 mM TCEPを含むバッファAの100 μLにペレットを再懸濁します。1.5 mLチューブに移します。 注: CM沈殿工程中にタンパク質の著しい損失が発生するのは正常です。以降のすべてのステップは1.5 mLチューブで行われ、タンパク質の体積を最大120〜130μLに制限します。これにより、最終的なCM沈殿時のタンパク質損失が減少します。</li>
		<li>20 mM mPEG-5k (25 μL、ストックソリューションから追加)表 1)タンパク質サンプルにし、ピペットによって混合します。エンドオーバー回転で25°Cで60分間インキュベートします。</li>
		<li>非法人mPEG-5kを除去するには、ステップ2.2で説明したCM沈殿を、MeOH(500 μL)の4体積、クロロホルム(250μL)、3体積のdH2O(375 μL)を用いて行います。2遠心分離機で >13,000 x g 25 °Cで10分。</li>
		<li>厚くて凝集したパンケーキを避けて、以前と同じくらい慎重に上相を取り除きます。MeOHを1mL加え、やさしく混ぜます。遠心分離機で >13,000 x g 25 °Cで10分。</li>
		<li>上清を慎重に取り除き、1 mLのMeOHでペレットをすすきます。遠心分離機で >13,000 x g 25 °Cで10分。空気乾燥ペレット。 注:乾燥ペレットは-20°Cで保存することができます。</li>
		<li>乾燥したペレットをバッファーAの50 μL(TCEPまたは任意の還元剤なしで)再懸濁します。BCAタンパク質定量のために5 μLを予約してください。定量後、適切な量の4xレムリサンプルバッファーを追加し、目的のタンパク質に応じて、サンプルを70-100°Cに加熱して10分間加熱する可能性があります。 注意:沸騰は、いくつかの膜タンパク質の凝集を引き起こす可能性があります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. PEGylatedタンパク質のウェスタンブロット分析
<ol><li>試料をドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)ゲル13に載せる。 注:このプロトコルでは10%ポリアクリルアミドが使用されました。</li>
	<li>ウェスタンブロッティング14の標準分離、転送、および検出プロトコルを使用します。</li>
	<li>密度測定14を用い、PEGylatedと非PEGylate化タンパク質の相対的量を決定する。</li>
</ol>

<ol><li>Blaskovic, S., Blanc, M., van der Goot, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+does+S-palmitoylation+do+to+membrane+proteins%3F%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">What does S-palmitoylation do to membrane proteins?</a> FEBS Journal. 280, 2766-2774 (2013).</li>
<li>Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+palmitoylation+in+neuronal+development+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protein palmitoylation in neuronal development and synaptic plasticity.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 161-175 (2010).</li>
<li>Globa, A. K., Bamji, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+palmitoylation+in+the+development+and+plasticity+of+neuronal+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Protein palmitoylation in the development and plasticity of neuronal connections.</a> Current Opinion in Neurobiology. 45, 210-220 (2017).</li>
<li>Thomas, G. M., Huganir, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylation-dependent+regulation+of+glutamate+receptors+and+their+PDZ+domain-containing+partners%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+Transactions%22%5BJournal%5D)">Palmitoylation-dependent regulation of glutamate receptors and their PDZ domain-containing partners.</a> Biochemical Society Transactions. 41, 72-78 (2013).</li>
<li>Kalashnikova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SynDIG1%3A+an+activity-regulated%2C+AMPA-+receptor-interacting+transmembrane+protein+that+regulates+excitatory+synapse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">SynDIG1: an activity-regulated, AMPA- receptor-interacting transmembrane protein that regulates excitatory synapse development.</a> Neuron. 65, 80-93 (2010).</li>
<li>Kaur, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-Dependent+Palmitoylation+Controls+SynDIG1+Stability%2C+Localization%2C+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-Dependent Palmitoylation Controls SynDIG1 Stability, Localization, and Function.</a> Journal of Neuroscience. 36, 7562-7568 (2016).</li>
<li>Wan, J., Roth, A. F., Bailey, A. O., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitoylated+proteins%3A+purification+and+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Palmitoylated proteins: purification and identification.</a> Nature Protocols. 2, 1573-1584 (2007).</li>
<li>Howie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+recognition+by+the+cell+surface+palmitoyl+transferase+DHHC5%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Substrate recognition by the cell surface palmitoyl transferase DHHC5.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 17534-17539 (2014).</li>
<li>Kanadome, T., Yokoi, N., Fukata, Y., Fukata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+Screening+of+Depalmitoylating+Enzymes+and+Evaluation+of+Their+Activities+by+the+Acyl-PEGyl+Exchange+Gel-Shift+%28APEGS%29+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Systematic Screening of Depalmitoylating Enzymes and Evaluation of Their Activities by the Acyl-PEGyl Exchange Gel-Shift (APEGS) Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2009, 83-98 (2019).</li>
<li>Percher, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-tag+labeling+reveals+site-specific+and+endogenous+levels+of+protein+S-fatty+acylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mass-tag labeling reveals site-specific and endogenous levels of protein S-fatty acylation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113, 4302-4307 (2016).</li>
<li>Percher, A., Thinon, E., Hang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-Tag+Labeling+Using+Acyl-PEG+Exchange+for+the+Determination+of+Endogenous+Protein+S-Fatty+Acylation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Mass-Tag Labeling Using Acyl-PEG Exchange for the Determination of Endogenous Protein S-Fatty Acylation.</a> Current Protocols in Protein Science. 89, 14.17.1-14.17.11 (2017).</li>
<li>Yokoi, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+PSD-95+Depalmitoylating+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identification of PSD-95 Depalmitoylating Enzymes.</a> Journal of Neuroscience. 36, 6431-6444 (2016).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Separating+Protein+with+SDS-PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Science+Education+Database.+The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Science Education Database. The Western Blot.</a> Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. (2019).</li>
<li>Chenaux, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+SynDIG1+Reduces+Excitatory+Synapse+Maturation+But+Not+Formation+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Loss of SynDIG1 Reduces Excitatory Synapse Maturation But Not Formation In Vivo.</a> eNeuro. 3 (5), (2016).</li>
<li>Matt, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SynDIG4%2FPrrt1+Is+Required+for+Excitatory+Synapse+Development+and+Plasticity+Underlying+Cognitive+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">SynDIG4/Prrt1 Is Required for Excitatory Synapse Development and Plasticity Underlying Cognitive Function.</a> Cell Reports. 22, 2246-2253 (2018).</li>
<li>Purkey, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AKAP150+Palmitoylation+Regulates+Synaptic+Incorporation+of+Ca%282%2B%29-Permeable+AMPA+Receptors+to+Control+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">AKAP150 Palmitoylation Regulates Synaptic Incorporation of Ca(2+)-Permeable AMPA Receptors to Control LTP.</a> Cell Reports. 25, 974-987 (2018).</li>
<li>Woolfrey, K. M., Sanderson, J. L., Dell'Acqua, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+palmitoyl+acyltransferase+DHHC2+regulates+recycling+endosome+exocytosis+and+synaptic+potentiation+through+palmitoylation+of+AKAP79%2F150%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The palmitoyl acyltransferase DHHC2 regulates recycling endosome exocytosis and synaptic potentiation through palmitoylation of AKAP79/150.</a> Journal of Neuroscience. 35, 442-456 (2015).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

前の研究では、SynDIG1が2つの保存された並膜貫通Cys残基(すべてのSynDIGタンパク質に見られる)で、安定性、局在化、機能を調節する活性依存的な方法でパルミトレートされていることを実証するためにABEアッセイを利用しました。制限は、ABEアッセイは、手順の最終ステップとしてアビジン部分に結合したアガロース樹脂との親和性精製を必要とし、定量分析を複雑にするシグナルの大幅な損失をもたらすことです。さらに、ABEアッセイでは、タンパク質が一度、または複数の部位でパルミトレートされるかどうかを区別することはできません。
ここでは、APEGSアッセイ88、9、10、11、1210,11,12を使用して、AMPAR補助膜貫通タンパク質SynDIG1および関連タンパク質SynDIG4(...

S-パルミトリューションは、安定した膜会合、タンパク質の密売、およびタンパク質とタンパク質相互作用を調節する標的タンパク質の可逆的な翻訳後修飾である。パルミトイルアシルトランスセファーゼ(PAT)酵素によって触媒チオエステルリンケージを介してシステイン残基に16-炭素パルミチン酸部分を添加することを含む。脳内の多くのシナプスタンパク質は、安定性、局在化,、および機能,2、3、4を調節する活動依存的な方法で、AMPA-RsおよびPSD-95を含むパルミトレート化される。24PSD-95のようなシナプス足場との補助因子の相互作用によるPSD中のシナプスAMPプラスチックのレベルの変化は、シナプス可塑性を下にしている。したがって、シナプスタンパク質のパルミトイル化状態を決定する方法は、シナプス可塑性のメカニズムに関する重要な洞察を提供する。
以前は、AMPA5と関連する脳特異的な膜貫通タンパク質をコードする4つの遺伝子(SynDIG1-4)の5SynDIGファミリーを同定した。解約されたラット海馬ニューロンにおけるSynDIG1の過剰発現またはノックダウンは、それぞれ増加または減少し、AMPA-Rシナプスサイズおよび数は免疫細胞化学および電気生理学を用いて検出された〜50%ずつ増加または減少する。我々は、アシルビオチン交換(ABE)アッセイを利用して、SynDIG1が2つの保存された並膜貫通Cys残基(全SynDIGタンパク質に見られる)でパルミトレートされ、安定性、局在化、機能6を調節する活性依存的な方法で実証した。ABEアッセイは、改変とその後の親和性精製によって保護されたシステインに対するビオチンの交換に依存する7。ここでは、アシル-PEGyl交換ゲルシフト(APEGS)アッセイ,88、9、10、11、1210,11という革新的な生化学的アプローチについて説明します。,912プロトコルは、適切な抗体が利用可能なマウス脳からの内因性膜タンパク質の調査のために記述されている。

<table><tbody><tr><td>ヒドロキシルアミン (HAM)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>26103</td><td></td></tr><tr><td>メトキシ-PEG-(CH2)3NHCO(CH2)2-MAL (mPEG)</td><td>NOF</td><td>ME-050MA</td><td>MW ~5000 kDa</td></tr><tr><td>Microfuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td>または同等の機器</td></tr><tr><td>N-エチルマレミド (NEM)</td><td>Calbiochem</td><td>34115</td><td>非常に有毒です。</td></tr><tr><td>デンシトメトリー用光学イメージャー</td><td>Azure Biosystems</td><td>Sapphire Biomolecular Imager</td><td>または同等の機器</td></tr><tr><td>キャップ付きポリプロピレンチューブ</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-956-1D</td><td></td></tr><tr><td>血清ピペット (ガラス)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>13-678-27D</td><td></td></tr><tr><td>卓上遠心分離機</td><td>Beckman</td><td>Allegra X-15R</td><td>または同等の機器</td></tr><tr><td>トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)</td><td>EMDミリポア</td><td>580560</td><td></td></tr></tbody></table>

脳膜タンパク質のパルミトイル化定量に関するアシル-pegyl交換ゲルシフトアッセイ

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

シナプス後密度(PSD)内のシナプスAMPA受容体(AMPA)のレベルにおける活動依存的変化は、学習および記憶のための細胞メカニズムを表していると考えられている。パルミトイル化は、AMPA-Rs、補助因子、シナプス足場を含む多くのシナプスタンパク質の局在化と機能を活動依存的に調節します。我々は、AMPAに関連付け、シナプス強度を調節する脳特異的な膜貫通タンパク質をコードする4つの遺伝子(SynDIG1-4)のシナプス分化誘導遺伝子(SynDIG)ファミリーを同定した。SynDIG1は、活性依存性励起シナプスの発達に重要な並置膜貫通領域の位置191および192に位置する2つのシステイン残基でパルミトレート化される。ここでは、革新的な生化学的アプローチであるアシルPEGyl交換ゲルシフト(APEGS)アッセイについて、目的のタンパク質のパルミトリューション状態を調査し、マウス脳リセート中のSynDIGファミリーのタンパク質との有用性を実証する。

目的のタンパク質に対する抗体を用いた免疫ブロッティングは、HAMが含まれていないサンプルと比較して移動性シフトによって決定されるマウス脳ライゼにおけるパルミトレート状態(非、独り、二重など)を明らかにする。以前は、SynDIG1がABEアッセイ6を用いて2つのサイトでパルミトレートされていることを実証しました。しかし、両方の部位が脳組織で改変されたかどうかは判断できませんでした。ここでは、SynDIG1、SynDIG4/Prrt1、およびPrrt2がマウス脳でパルミトレートされ、2つの潜在的なパルミトレーション部位があることを示します(図1)。興味深いことに、各タンパク質は、非、1つの、かつ二重にパルミトレートされたタンパク質のシグナルに基づいて、マウス脳内で異なるパルミトイル化状態を有する。ブロットのデンシトメトリー分析は、パルミトレート状態に関する定量的情報を提供します。
<p class="jove_content" fo:keep-together....

パルミトイル化は、16炭素パルミチン酸部分を、可逆的に標的タンパク質のシステイン残基に取り込む必要があります。ここでは、生化学的アプローチ、アシル-PEGyl交換ゲルシフト(APEGS)アッセイについて、マウス脳ライセートに関心のある任意のタンパク質のパルミトイル化状態を調べる。

脳膜タンパク質のパルミトイル化定量に関するアシル-PEGyl交換ゲルシフトアッセイ

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...

この生化学的方法は、適切な抗体が利用可能な脳内で発現される任意の膜タンパク質のパルミトイル化状態の決定を可能にする。この技術の主な利点は、アフィニティー精製を必要とせず、代わりにゲル移動性の変化を利用して、目的のタンパク質の改変数を決定することです。脳を解剖した後、氷上のガラスホモジナイザーで均質化バッファーの10ミリリットルですぐに均質化します。約12ストロークを使用して、1400倍Gで15分間、摂氏4度の間、ライセートを遠心分離する。上清を氷上の新しいチューブに移します。ペレットを均質化バッファーの 10 ミリリットルに再懸濁します。約6ストロークで均質化します。サスペンションを710倍Gで、摂氏4度で10分間遠心分離します。上清と遠心分離機を40,000倍Gと摂氏4度で20分間組み合わせます。上清を捨て、ペレットをピペットチップで分解し、上下にピペット処理することで、ペレット化膜分率を均質化バッファーに再懸濁します。ABCAアッセイを実行してタンパク質レベルを定量化する。APEGSアッセイを実行するには、470マイクロリットルのバッファーAを1.5ミリリットルチューブに入れ、約100~200ミリグラムのタンパク質を加えます。チューブを超音波処理し、25°Cでチューブを遠心分離し、10分間Gの13,000倍以上で不溶性タンパク質を分離します。水化したタンパク質を新しい1.5ミリリットルチューブに移します。まず、25マイクロリットルのTCEP中の溶解タンパク質を摂氏55度で60分間インキュベートすることにより、二硫化物結合を破壊する。次いで、NEMのストック溶液12.5マイクロリットルを室温で3時間インキュベートして遊離システインをブロックする。次に、クロロホルムメタノール沈殿のプロセスを開始する。1.5ミリリットルチューブからポリプロピレンまたはガラスチューブにタンパク質溶液を移し、適度な速度で揺れるバケットローターで遠心分離することができます。メタノールと渦を2ミリリットル加えます。クロロホルムと渦を1ミリリットル加えます。その後、1.5ミリリットルの脱イオン水と渦をもう一度短時間加えます。必要に応じて、チューブを反転して、徹底的な混合を確実にします。スイングバケットローターで30分間、Gの3000倍と摂氏25度でサンプルを遠心分離します。慎重に除去し、チューブ内の溶液の上相を捨てます.1.5ミリリットルのメタノールを加えます。不透明なタンパク質パンケーキを断片化しないように注意して、チューブの穏やかな反転によって穏やかだが徹底的に混ぜます。スイングバケットローターで10分間、Gの3000倍と摂氏25度でサンプルを遠心分離します。ガラス血清ピペットを使用して、タンパク質パンケーキを邪魔することなく、溶液のトップフェーズをできるだけ多く取り除きます。ペレットを1ミリリットルのメタノールで慎重にすすいで、少なくとも10分間空気乾燥させます。クロロホルムメタノール沈殿が完了したら、125マイクロリットルのバッファーA.Transferを新しい1.5ミリリットルチューブに再懸濁させることでパルミトイルチオエステル結合の切断を開始します。チューブを短時間超音波処理し、不溶性物質を除去するために13,000倍G以上、摂氏25度で遠心分離します。水化したタンパク質を新しい1.5ミリリットルチューブに移し、375マイクロリットルのバッファーHまたはバッファT.室温でサンプルを60分間インキュベートした後、クロロホルムメタノール沈殿を繰り返します。保護されていないシステインにm-PEGを添加するには、10mil以上のTCEPを含む100マイクロリットルのバッファーAにペレットを再懸濁させることから始める。その後、懸濁液を1.5ミリリットルのチューブに移します。25マイクロリットルのストックM-PEG 5K溶液を加え、ピペットで混合します。終点回転で室温でインキュベートします。60分間のインキュベーションの後、クロロホルムメタノール沈殿を再度行うことにより非法人m-PEG5Kを除去した。13,000倍Gと摂氏25度を超える遠心分離機を10分間。厚くて凝集したパンケーキを避けて、以前と同じくらい慎重に上相を取り除きます。1ミリリットルのメタノールを加え、穏やかに、しかし十分に混ぜます。13,000倍Gと摂氏25度を超える遠心分離機を10分間。上清を慎重に取り除き、1ミリリットルのメタノールでペレットをすすきます。繰り返しますが、遠心分離機は13,000倍Gを超え、摂氏25度で10分間です。ペレットを空気乾燥させた後、TCEPまたは任意の還元剤を使用せずに50マイクロリットルのバッファーAで再懸濁する。BCAタンパク質定量用に溶液の5マイクロリットルを予約してください。定量後、適切な量の4倍のレムリサンプルバッファーを加えます。サンプルを SDS ページゲルにロードします。ウェスタンブロッティングには標準の分離転送および検出プロトコルを使用してください。SynDIGタンパク質のパルミトリューション状態を調べるため、均質化マウス脳からのP2膜画分をAPEGSアッセイに供した。抗体による分離とプローブは、SynDIG1、SynDIG4 Prrt1、およびPrrt2がマウス脳でパルミトレートされていることを実証した。クロロホルムメタノール沈殿の目的は、NEMのような1つの化学物質を防止し、プロトコルの次のステップを妨害することにある。適切なクロロホルムメタノール沈殿は、タンパク質の損失を最小限に抑えながら、望ましくない化学物質を除去します。この方法は、異なる年齢のマウスまたは異なる脳領域からの脳ライセートに適用され、パルミトイル化の空間的時間的規制を調査することができる。

acyl-pegyl-exchange-gel-shift-assay-for-quantitative-determination

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

規制エンドサイトーシスは、膜タンパク質の大部分の細胞表面発現レベルを制御します。ここでは、ドーパミントランスポーター（DAT）、ポリトープ膜​​タンパク質のエンドサイトーシス率を測定するために還元、膜非透過性ビオチン化試薬を利用する。メソッドは、ほとんどの細胞膜タンパク質のエンドサイトーシス率を測定するための直接的なアプローチを促進する。...

リバーシブルビオチン化によって原形質膜タンパク質エンドサイトーシス率を測定

このビデオは、マウスの脳組織から単離された細胞膜タンパク質のパルミトイル化状態の解析を示しています。このプロセスでは、非パルミトイル化システインを露出させてブロックし、次にパルミトイル化システインに結合するポリマーを使用して、単離されたタンパク質のパルミトイル化状態の評価を支援します。...

マウス脳組織由来細胞膜タンパク質のパルミトイル化状態の評価

タンパク質へのパルミチン酸の可逆的付加は、細胞内タンパク質輸送の重要な調節因子である。これは、多くのシナプス蛋白質はパルミトイルているニューロンで特に重要である。我々は、複数の種類の細胞や組織に適応することができる培養神経細胞において、パルミトイル化タンパク質を検出するための簡単​​な生化学的方法を利用しています。...

免疫沈降およびアシル-ビオチン所（阿部）による培養海馬神経細胞におけるタンパク質パルミトイル化の検出

神経細胞の膜輸送を動的に原形質膜タンパク質の可用性と大幅に影響を与える神経伝達を制御します。今日まで、成体ニューロンにおけるニューロンのエンドサイトーシス輸送を測定するために挑戦してきた。ここでは、急性の脳切片における表面タンパク質発現のex vivoでの急速な変化を測定するための非常に効果的な、定量的な方法を記載している。...

脳スライスビオチン：<em&gt;生体外</emアダルトニューロンにおいて地域固有の細胞膜のタンパク質輸送を測定するために&gt;の取り組み

人間とマウスの脳組織のために尿素/チオ尿素/ SDS緩衝液を使用した一般的なタンパク質抽出プロトコルを可能にする2D-DIGEとミニ2DEのイムノブロット法によるそれに続くキャラクタライゼーションによるタンパク質のINDENTIFICATION。この方法は、人間の生検および実験モデルから、より再現性と信頼性の高い結果を得るために1を可能にします。...

コンセンサス脳由来のタンパク質、2D-DIGEとミニ2DEイムノ両方を使用して、ヒトおよびマウスの脳プロテオーム研究のための抽出プロトコール

Acyl-RAC(アシル-レジンアシストキャプチャ)は、様々な生物学的サンプル中のシステイン残基の可逆的脂質修飾(S-acylation)を検出する方法を非常に敏感で、信頼性が高く、実行しやすいです。...

アシル樹脂アシスト捕捉によるプロテインS-アシル化の検出

ここでは、ジアシルグリセリルペプチドとアルキンリン脂質を基質としてクリックケミストリーを用いて、アポリポタンパク質N-アシルトランスフェラーゼ活性をモニターするための高感度蛍光アッセイを紹介します。...

酵素特性評価からハイスループットスクリーニングまでのアポリポタンパク質N-アシルトランスフェラーゼのクリックケミストリーベースの蛍光アッセイ(英語)

脂肪アシル化の研究は、細胞タンパク質相互作用および疾患において重要な意味を有する。ここでは、脂肪アシル化タンパク質のクリックケミストリー検出を改善するための修正プロトコルを示しており、これは様々な細胞タイプに適用し、パルスチェイスおよび質量分析を含む他のアッセイと組み合わせることができる。...

クリックケミストリーを用いた脂肪酸アシル化タンパク質の検出のためのアルキニル脂肪酸類似体の最適化された組み込み

ここでは、蛍光脂質センサーおよびリポソームを用いて、タンパク質抽出物を用いてホスファチジルセリンまたはホスファチジルイノシトール4-リン酸...

ホスファチジルセリン/ホスファチジルイノシトール4-膜間のリン酸交換の蛍光ベースの測定

シクロデキストリンを使用して、原形質膜の脂質と外因性脂質との交換を仲介する方法について説明します。この手法は、脂質ラフト様環境と非ラフト様環境で異なる振る舞いをする膜貫通タンパク質を研究する実験と組み合わせることができます。...

生細胞における脂質交換アッセイ

本研究は、フィラメントの組み立て、凝集、翻訳後修飾に焦点を当て、GFAPおよびその病原変異を生化学的に特徴づける実験的方法を示しています。高純度のGFAPタンパク質を解析し、アレクサンダー病のメカニズムに関する洞察が明らかになり、潜在的な治療標的の研究やGFAP変異および関連疾患の理解の枠組みとなり得ました。...

グリア線維酸性タンパク質およびその疾患関連変異体の生化学的解析における実験的アプローチ

学ぶ APEGSアッセイを用いたマウス脳膜タンパク質のパルミトイル化定量法。親和精製不要でゲルシフト変化を利用し、神経科学におけるタンパク質修飾解析を簡便かつ迅速に行う手法です。

脳膜タンパク質のパルミトイル化定量に関するアシル-PEGyl交換ゲルシフトアッセイ

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