Name: C.エレガンスにおけるRANペプチド毒性の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 学ぶ C.エレガンスを用いたRANペプチド毒性の定量的評価法。行動アッセイと細胞アッセイにより、神経変性疾患のメカニズム解明と治療戦略開発への貢献を目指す標準化プロトコルです。

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NIH R21NS107797

<ol><li>Cleary, J. D., Ranum, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeat+associated+non-ATG+%28RAN%29+translation%3A+new+starts+in+microsatellite+expansion+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Repeat associated non-ATG (RAN) translation: new starts in microsatellite expansion disorders.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 26, 6-15 (2014).</li>
<li>The Huntington's Disease Collaborative Research Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington%27s+disease+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li>
<li>Scherzinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin-encoded+polyglutamine+expansions+form+amyloid-like+protein+aggregates+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo.</a> Cell. 90 (3), 549-558 (1997).</li>
<li>Morley, J. F., Brignull, H. R., Weyers, J. J., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+threshold+for+polyglutamine-expansion+protein+aggregation+and+cellular+toxicity+is+dynamic+and+influenced+by+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The threshold for polyglutamine-expansion protein aggregation and cellular toxicity is dynamic and influenced by aging in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (16), 10417-10422 (2002).</li>
<li>Genetic Modifiers of Huntington's Disease Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electronic+address%2C+g.+h.+m.+h.+e.%2C+Genetic+Modifiers+of+Huntington%27s+Disease%2C+C.+CAG+Repeat+Not+Polyglutamine+Length+Determines+Timing+of+Huntington%27s+Disease+Onset%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Electronic address, g. h. m. h. e., Genetic Modifiers of Huntington's Disease, C. CAG Repeat Not Polyglutamine Length Determines Timing of Huntington's Disease Onset.</a> Cell. 178 (4), 887-900 (2019).</li>
<li>Wright, G. E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Length+of+Uninterrupted+CAG%2C+Independent+of+Polyglutamine+Size%2C+Results+in+Increased+Somatic+Instability%2C+Hastening+Onset+of+Huntington+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Length of Uninterrupted CAG, Independent of Polyglutamine Size, Results in Increased Somatic Instability, Hastening Onset of Huntington Disease.</a> American Journal of Human Genetics. 104 (6), 1116-1126 (2019).</li>
<li>Cleary, J. D., Ranum, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeat-associated+non-ATG+%28RAN%29+translation+in+neurological+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Repeat-associated non-ATG (RAN) translation in neurological disease.</a> Human Molecular Genetics. 22 (1), 45-51 (2013).</li>
<li>Banez-Coronel, M., Ranum, L. P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeat-associated+non-AUG+%28RAN%29+translation%3A+insights+from+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Repeat-associated non-AUG (RAN) translation: insights from pathology.</a> Laboratory Investigation. 99 (7), 929-942 (2019).</li>
<li>Banez-Coronel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAN+Translation+in+Huntington+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">RAN Translation in Huntington Disease.</a> Neuron. 88 (4), 667-677 (2015).</li>
<li>Ash, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unconventional+translation+of+C9ORF72+GGGGCC+expansion+generates+insoluble+polypeptides+specific+to+c9FTD%2FALS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Unconventional translation of C9ORF72 GGGGCC expansion generates insoluble polypeptides specific to c9FTD/ALS.</a> Neuron. 77 (4), 639-646 (2013).</li>
<li>Kramer, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+screens+in+human+cells+and+primary+neurons+identify+modifiers+of+C9ORF72+dipeptide-repeat-protein+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 screens in human cells and primary neurons identify modifiers of C9ORF72 dipeptide-repeat-protein toxicity.</a> Nature Genetics. 50 (4), 603-612 (2018).</li>
<li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+screen+connects+nuclear+transport+genes+to+DPR+pathology+in+c9ALS%2FFTD%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD.</a> Scientific Reports. 6, 20877(2016).</li>
<li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD%2FALS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nature Neuroscience. 18 (9), 1226-1229 (2015).</li>
<li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+Separation+of+C9orf72+Dipeptide+Repeats+Perturbs+Stress+Granule+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Phase Separation of C9orf72 Dipeptide Repeats Perturbs Stress Granule Dynamics.</a> Molecular Cell. 65 (6), 1044-1055 (2017).</li>
<li>Lee, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C9orf72+Dipeptide+Repeats+Impair+the+Assembly%2C+Dynamics%2C+and+Function+of+Membrane-Less+Organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">C9orf72 Dipeptide Repeats Impair the Assembly, Dynamics, and Function of Membrane-Less Organelles.</a> Cell. 167 (3), 717-788 (2016).</li>
<li>Hao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+dysfunction+and+neurodegeneration+in+a+C9orf72+mouse+line+expressing+poly-PR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Motor dysfunction and neurodegeneration in a C9orf72 mouse line expressing poly-PR.</a> Nature Communications. 10 (1), 2906(2019).</li>
<li>Scior, A., Preissler, S., Koch, M., Deuerling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+PCR-free+engineering+of+highly+repetitive+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Directed PCR-free engineering of highly repetitive DNA sequences.</a> BMC Biotechnology. 11, 87(2011).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA transformation.</a> Methods in Cell Biology. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Rudich, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+localized+C9orf72-associated+arginine-containing+dipeptides+exhibit+age-dependent+toxicity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Nuclear localized C9orf72-associated arginine-containing dipeptides exhibit age-dependent toxicity in C. elegans.</a> Human Molecular Genetics. 26 (24), 4916-4928 (2017).</li>
<li>Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilizing+protein+polymorphisms+in+the+genetic+background+direct+phenotypic+expression+of+mutant+SOD1+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity.</a> PLoS Genetics. 5 (3), 1000399(2009).</li>
<li>Nollen, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNA+interference+screen+identifies+previously+undescribed+regulators+of+polyglutamine+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNA interference screen identifies previously undescribed regulators of polyglutamine aggregation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 101 (17), 6403-6408 (2004).</li>
<li>Satyal, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyglutamine+aggregates+alter+protein+folding+homeostasis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Polyglutamine aggregates alter protein folding homeostasis in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (11), 5750-5755 (2000).</li>
<li>Boccitto, M., Lamitina, T., Kalb, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Daf-2+signaling+modifies+mutant+SOD1+toxicity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Daf-2 signaling modifies mutant SOD1 toxicity in C. elegans.</a> PLoS One. 7 (3), 33494(2012).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C9orf72+BAC+Mouse+Model+with+Motor+Deficits+and+Neurodegenerative+Features+of+ALS%2FFTD%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD.</a> Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).</li>
<li>Peters, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+C9ORF72+Hexanucleotide+Expansion+Reproduces+RNA+Foci+and+Dipeptide+Repeat+Proteins+but+Not+Neurodegeneration+in+BAC+Transgenic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Human C9ORF72 Hexanucleotide Expansion Reproduces RNA Foci and Dipeptide Repeat Proteins but Not Neurodegeneration in BAC Transgenic Mice.</a> Neuron. 88 (5), 902-909 (2015).</li>
<li>O'Rourke, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C9orf72+BAC+Transgenic+Mice+Display+Typical+Pathologic+Features+of+ALS%2FFTD%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">C9orf72 BAC Transgenic Mice Display Typical Pathologic Features of ALS/FTD.</a> Neuron. 88 (5), 892-901 (2015).</li>
<li>Mizielinska, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C9orf72+repeat+expansions+cause+neurodegeneration+in+Drosophila+through+arginine-rich+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins.</a> Science. 345 (6201), 1192-1194 (2014).</li>
<li>Krajacic, P., Shen, X., Purohit, P. K., Arratia, P., Lamitina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomechanical+profiling+of+Caenorhabditis+elegans+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Biomechanical profiling of Caenorhabditis elegans motility.</a> Genetics. 191 (3), 1015-1021 (2012).</li>
<li>Zhang, L., Ward, J. D., Cheng, Z., Dernburg, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+auxin-inducible+degradation+%28AID%29+system+enables+versatile+conditional+protein+depletion+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The auxin-inducible degradation (AID) system enables versatile conditional protein depletion in C. elegans.</a> Development. 142 (24), 4374-4384 (2015).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここでは、筋肉またはC.エレガンスのニューロンでモデル化されたRANペプチド毒性をアッセイするために使用できる方法を報告します。神経変性タンパク質はヒト患者に発症する表現型の年齢を有する一方で、モデル系で過剰発現すると発達毒性を示すこともある。過剰発現には解釈上の限界は大きいが、毒性表現型を逆転させる遺伝子や薬物の同定を目的とした遺伝的または薬理学的スクリーンの強力な出発点を提供する。これは、疾患の最も正確な動物モデルが偏りのないスクリーニングアプローチ24、25、26に適していない表現型または弱い表現型を有しないことを考えると特25,26に重要である。当社のC.エレガンスRANペプチドモデルおよびアッセイは、酵母やショウジョウバエなどの他のRANペプチドモデルシステムに対する強力で補完的なアプローチを表し、これらの新しく記述されたタンパク質の毒性に重要な細胞経路を理解します。
<p cla...

DNA反復配列の不適切な拡大は筋萎縮性側索硬化症(ALS)、前頭側頭型認知症(FTD)、ハンチントン病(HD)1などのいくつかの神経変性疾患の遺伝的基盤である。これらの疾患には確立された細胞モデルと動物モデルがあるが、これらの条件の根底にあるメカニズムは十分に定義されていない。例えば、HDは、ハンチンチンタンパク質Htt2に対するコード配列におけるCAG反復配列の拡張によって引き起こされる。CAGはアミノ酸グルタミンをコードするので、CAGの繰り返し拡張は、ポリグルタミン、またはポリQ内の配列を挿入する結果、Tt.拡張されたポリQタンパク質の中で、毒性33、44に関連する長さと年齢依存性タンパク質凝集体を形成する。驚くべきことに、2つの最近の研究は、polyQ配列の長さがHD疾患発症の主な要因ではないことを示唆し、ポリQ独立因子も疾患55、66に寄与する可能性があることを示唆している。
可能なポリQ非依存のメカニズムの1つは、Repeat Aon-AUG依存(RAN)翻訳7と呼ぶ新たに発見されたタイプのタンパク質翻訳を含む。その名前が示すように、RAN変換は、拡張された繰り返しシーケンスが存在し、正規開始コドンを必要としない場合にのみ発生します。したがって、RAN変換は、3つの異なるポリペプチドを産生する繰り返しの3つの読み取りフレームすべてに起こる。また、多くの遺伝子が、拡大された反復配列の逆補体を含むアンチセンス転写産物を産生するので、アンチセンス転写物の3つの読み取りフレームにおいてもRAN変換が起こる。RANの翻訳は、1つのペプチドから6つのペプチドに拡大された反復含有DNA配列から産生されるタンパク質の数を拡大する。現在までに、RAN翻訳は少なくとも8つの異なる反復拡張障害8において観察されている。RANペプチドは、死後の患者サンプルにおいて観察され、患者が拡大された繰り返し99、1010を運ぶ場合にのみ観察される。これらのペプチドは患者細胞に明らかに存在するが、疾患病態生理学への寄与は不明である。
RANペプチドに関連する潜在的な毒性をより良く定義するために、いくつかのグループは、酵母、ハエ、マウス、および組織培養細胞,11、12、13、14、15、16,12,13,14などの様々なモデルシステムで各ペプチド15を16発現している。これらのモデルは、発現に繰り返し配列を利用するのではなく、反復配列が除去されるがアミノ酸配列が保存されるコドン変動アプローチを採用している。翻訳開始は正規ATGを介して起こり、ペプチドは通常、N末端またはC末端の蛍光タンパク質に融合し、いずれもRANペプチド毒性を妨げているようには見えなくなる。したがって、各コンストラクトは単一のRANペプチドを過剰発現する。多細胞生物の異なるRAN製品を、RANペプチド毒性を測定する簡単なアッセイでモデリングすることは、各疾患を引き起こす反復膨張とは異なるRAN製品が細胞機能障害や神経変性にどのように寄与するかを理解するために極めて重要です。
他のモデルシステムと同様に、C.elegansは、RANペプチド毒性などの新しい疾患メカニズムの研究を可能にする柔軟で効率的な実験プラットフォームを提供します。ワームは、RANペプチド毒性の他のモデルでは現在利用できないいくつかのユニークな実験的属性を提供します。第一に、C.エレガンスは生まれてから死ぬまで光学的に透明である。これにより、RANペプチド発現と局在化の簡単な可視化、ならびに生きた動物における神経変性のインビボ分析が可能になります。第2に、RANペプチド発現モデルを生成するためのトランスジェニック方法は、安価で高速である。C.エレガンスの短い3日間のライフサイクルを考えると、細胞型特異的な方法で任意のRANペプチドを発現する安定したトランスジェニックラインは、1週間以内に生成することができる。第三に、単純な表現型の出力は、化学変異誘発またはRNAiスクリーニングなどの遺伝子スクリーニング方法と組み合わせて、RANペプチド毒性に不可欠な遺伝子を迅速に同定することができる。最後に、C.エレガンスの短い寿命(〜20日)は、ほとんどの繰り返し拡張疾患の最大の危険因子である老化がRANペプチド毒性にどのように影響するかを決定することを可能にする。一緒に、実験属性のこの組み合わせは、他のモデルシステムでは比類のない、RANペプチド毒性の研究のための強力なプラットフォームを提供しています。
ここでは、C.エレガンスの実験的利点を利用して、RANペプチドの毒性を測定し、この毒性の遺伝的修飾因子を同定するいくつかのアッセイについて説明する。コドン変化したATG開始RANペプチドはGFPでタグ付けされ、myo-3プロモーターの下の筋肉細胞またはUNC-47プロモーターの下のGABAergic運動ニューロンのいずれかで個別に発現する。筋肉細胞の発現に関しては、毒性のRANペプチドが緑色蛍光タンパク質(GFP)、またはRNAiの摂食ベクターで標的とすることができる他の蛍光タンパク質(FP)タグでタグ付けされることが重要です。これは、毒性RANペプチド発現が通常増殖を妨げ、そのような株を生存不可能にするためである。gfp(RNAi)の使用は、条件付きでRANペプチド発現を不活性化し、ひずみの維持、遺伝的十字架などを可能にします。アッセイの場合、これらの動物は、RANペプチドの発現と結果の表現型を可能にするgfp(RNAi)から除去される。コドン多様なRANペプチド発現構築物を設計するための分子戦略に加えて、発生毒性(幼虫運動性および成長アッセイ)、発生後の年齢関連毒性(麻痺アッセイ)、およびニューロン形態異常(コミュニケールアッセイ)を測定するためのアッセイについて述べています。

<table><tbody><tr><td>35mm x 10mm ペトリ皿、滅菌</td><td>CELLTREAT Scientific Products</td><td>50-202-036</td><td>線虫成長プレートとRNAi</td></tr><tr><td>AGAR 粒状2キログラム</td><td>BD診断システム</td><td></td> DF0145070<td>線虫成長プレートとRNAi</td></tr><tr><td>アガロース 超純生命</td><td>技術</td><td></td><td>16500500 RANペプチドトランスジェニック株を生成するためのマイクロインジェクション</td></tr><tr><td>カルベニシリン 5G</td><td>サーモサイFAIRLAWN CHEMICALS</td><td>BP26485</td><td>Nematode Growth Plates and RNAi</td></tr><tr><td>Cover Glasses No 1 22MM 1OZ/PK</td><td>THERMO SCI ERIE</td><td>12542B</td><td>Imaging for commissure assay</td></tr><tr><td>FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS</td><td>EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS</td><td></td> E5242952008 <td>Microinjection to generate RAN peptide transgenic strains</td></tr><tr><td>FF COV Glass NO1 40X22MM 1OZPK</td><td>THERMO SCI ERIE</td><td>125485C</td><td>RANペプチドトランスジェニック株を生成するためのマイクロインジェクション</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp;Superfrost Plus Microscope Slides</td><td>THERMO SCI ERIE</td><td>12-550-15</td><td>Imaging for commissure assay</td></tr><tr><td>Gibco&nbsp;バクトペプトン&nbsp;</td><td>ギブコ&nbsp;</td><td>DF0118-17-0</td><td>線虫成長プレートとRNAi</td></tr><tr><td>ハロカーボンオイル 700</td><td>SIGMA-ALDRICH INC</td><td>H8898-50ML</td><td>RANペプチドトランスジェニック株を生成するためのマイクロインジェクション</td></tr><tr><td>IPTG BIOTECH 10G</td><td>THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS</td><td></td> BP162010 <td>線虫成長プレートとRNAi</td></tr><tr><td>ライカ 高度な蛍光イメージングソフトウェア</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>LAS-AF</td><td>ビデオ速度分析およびコミソシューアッセイ用画像取得ソフトウェア</td></tr><tr><td>ライカイマージョン タイプN (オイル)</td><td>W NUHSBAUM INC</td><td></td> NC9547002 <td>コミソシューアッセイ用イメージング</td></tr><tr><td>レバミゾール塩酸塩 10GR</td><td>THERMO SCI ACROS ORGANICS AC187870100</td> コ<td></td><td>ミッショナーアッセイ用イメージング</td></tr><tr><td>マイクロローダー ヒント 2 X 96 PCS エ</td><td>ッペンドルフ ノースアメリカ バイオツール</td><td></td> <td>E5242956003RANペプチドトランスジェニック株を生成するためのマイクロインジェクション</td></tr><tr><td> PETRI DISH、60X15MM,500/CS</td><td>CORNING LIFE SCIENCES PLASTIC</td><td></td> FB0875713A <td>Nematode Growth Plates and RNAi</td></tr><tr><td>TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS</td><td>CORNING LIFE SCIENCES DL</td><td>87721</td><td>Nematode Growth Plates and RNAi</td></tr></tbody></table>

c.エレガンスにおけるranペプチド毒性の測定

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C.エレガンスは、筋萎縮性側索硬化症(ALS)やハンチントン病などの繰り返し膨張突然変異によって引き起こされる、年齢関連神経変性疾患をモデル化するために一般的に使用されます。近年、反復膨張含有RNAは、反復関連非AUG依存性(RAN)翻訳と呼ばれる新規型のタンパク質翻訳の基質であることが示された。正規翻訳とは異なり、RAN変換は開始コドンを必要とせず、繰り返しがしきい値の長さを超えた場合にのみ発生します。読み取りフレームを決定する開始コドンがないため、RAN変換は、反復膨張シーケンスを含むセンスおよびアンチセンスRNAテンプレートの両方からすべての読み取りフレームで発生します。したがって、RAN翻訳は、疾患関連の有毒ペプチドの数を1から6に拡大する。これまで、RAN翻訳は、8つの異なる反復拡張ベースの神経変性疾患および神経筋疾患で文書化されてきた。いずれの場合も、どのRAN製品が毒性であるか、ならびに毒性のメカニズムを解読することは、これらのペプチドが疾患病態生理学にどのように寄与するかを理解するための重要なステップです。本論文では、モデル系C.エレガンスにおけるRANペプチドの毒性を測定する戦略を紹介する。まず、開発中のC.エレガンスの成長と運動性に関するRANペプチド毒性を測定する手順を説明する。第2に、RANペプチドが運動性に及ぼす、発達後の年齢依存性の影響を測定するためのアッセイを詳述する。最後に、ニューロンの形態に対するRANペプチドの効果を評価するための神経毒性アッセイについて述べます。これらのアッセイは、RANペプチド毒性の広範な評価を提供し、疾患のメカニズムまたは治療法を同定するために大規模な遺伝的または低分子スクリーンを実行するのに有用であり得る。

ここで説明するアッセイを用いて、G4C2反復増殖を有するALS患者に見られるRANジペプチドの毒性に対する異なる遺伝子阻害2の影響を評価した。成長アッセイを用いて発生毒性を測定し、筋肉発現PR50-GFP毒性のゲノムワイドRNAiスクリーンサプレッサーで同定されたいくつかの遺伝的ノックアウト変異体の効果を分析した。PR50-GFPの発現だけでは完全に浸透性の成長阻止をもたらしたが、いくつかの遺伝子における機能変異の喪失は、PR発生毒性を12〜94%から抑制した(図1A)。
また、ビデオ速度解析法を用いて、PR50発現動物の発達運動性に対する特定の遺伝子ノックダウンの効果を測定した。予想通り、gfp(RNAi)は、PR50-GFP発現の阻害により、空のベクター(RNAi)と比較して運動性が大きく増加した。また、プロテアソームサブユニットrpn-7に対するRNAiがPR50運動性の有意な増加をもたらしたことも明らかにした(<str...

反復関連非ATG依存的翻訳産物は、いくつかの繰り返し拡張ベースの疾患の新たな病原性特徴である。記載されたプロトコルの目的は、モデル系C.elegansにおける行動および細胞アッセイを用いてこれらのペプチドによって引き起こされる毒性を評価することである。

C.エレガンスにおけるRANペプチド毒性の測定

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

RANペプチドは、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭型認知症などの神経変性疾患の繰り返し拡大の特徴である。これらのプロトコルは、C.elegansモデルシステムにおけるRANペプチド毒性を定量化するための重要な標準化されたアプローチを提供します。説明する技術は、学習が簡単で安価で、迅速に実行でき、動きや再生などのC.elegansシステムの再現可能な機能を活用することができます。このプロトコルを試みるとき、主要な課題は、一貫したRANペプチド毒性および発現を得る。制御する主な要因には、薬物温度、温度変化のタイミング、アッセイプレートの調製などがあります。実験者は、この年齢依存性プロセスアッセイにおいて動物の表現型を一貫して分類することが重要である。この手法の視覚的なデモンストレーションでは、その分類基準を示します。24ウェルプレートに1ミリモルIPTGと25マイクログラムの1ミリモルIPTGと25マイクログラムの標準的な線虫増殖培地を注ぐことから始めます。RNAiは、LBカルベニシリン寒天にHT115細菌のクローンを供給し、24時間摂氏37度でそれらを成長させます。翌日、LBカルベニシリン液体培地の1ミリリットルに単一のコロニーを選び、250rpmで振りながら摂氏37度で18時間細菌を増殖させます。テキスト原稿に記載されているように、一晩細菌培養物の20マイクロリットルを有するNGM RNAi 24ウェルプレートの4つの個々の井戸を発見し、RNAi細菌が一晩で二本鎖RNA産生を誘導することを可能にする。標準的な次亜塩素酸塩法を使用して、一日目の成人C.elegansから卵を単離し、統合されたRANペプチドトランスジーンを発現させます。その後、24ウェルプレートの各ウェルに約30個の卵を播種し、7日間摂氏20度でプレートをインキュベートします。ビデオ速度解析を行うために、モノクロカメラを装着したステレオ解剖顕微鏡を用いて、RNAi状態ごとに2つの別々の井戸から2つのビデオを取得します。井戸間で一貫した取得設定を使用してください。ビデオごとに、10 秒の期間と時間間隔を 76 ミリ秒に設定します。イメージの露出時間を 4 ミリ秒に設定し、1.49 ズーム設定を使用します。次に、2つのビン分割で2つを選択します。解像度が 800 x 600 ピクセルであることを確認し、録音を開始します。取得後、各ビデオに株、RNAi条件、およびウェル番号をすぐにラベル付けします。次に、各RNAi状態について合計約40匹のワームを調べ、ビデオあたり20種類の動物の移動距離と各動物の長さを測定します。ソフトウェアで、注釈ツールボタンを選択します。次に、テキスト描画ツール。ビデオの最初のフレームで測定されているワームの中央にある点をクリックし、数字でマークします。ワームを視覚的に追跡しながらビデオを最後まで進めます。次にそれをクリックし、次の対応する番号でマークします。1 つ目の数値から 2 番目の数値までの線を描画し、スプレッドシートに移動した距離を記録するには、描画スケール バー ツールを使用します。解析ウィンドウで個々の測定を保存しながら、ビデオ内の19の他のワームに対してこの測定を繰り返します。測定が完了したら、すべての測定ラインを示す最終的なビデオフレームのスナップショットを作成し、データを元の動物に戻すことができます。次に、4 列のスプレッドシートを使用してデータを分析します。各ビデオの時間は、実験の下でビデオを右クリックし、プロパティに行くことによって見つけることができます。速度測定を正規化するには、各動物の長さを求めます。引きポリラインツールを使用して、頭の先端から尾の先端までC.elegansを自由にトレースします。次に、すべてのポリラインを示す最終的なビデオフレームのスナップショットを作成します。行の長さは統計の下に記録されます。スプレッドシートに 2 つの列を追加し、1 つは動物の長さ、もう 1 つは正規化された速度用です。最後に、一方向の ANOVA を使用して、非定型のテストと空のベクトル RNAi を使用して正規化された速度データを分析します。6センチメートルのGFP RNAiプレートにRANペプチドGFPを発現する4〜6個のトランスジェニックL4 C.エレガンを置き、摂氏20度で成長させます。実験がRANペプチド毒性に対する遺伝的効果をテストするためにRNAiを利用している場合、10のトランスジェニックグラビッド成人を2つの空のベクターRNAi GFP RNAiまたは遺伝子特異的RNAiプレートのそれぞれに移動させる。変異体がRANペプチド毒性に対する遺伝的効果を分析するために使用されている場合、2つの空のベクターRNAiまたはGFP RNAiプレートのそれぞれに同じRANトランスジーンを発現する10グラムの野生型または突然変異動物を配置する。摂氏20度で48時間育ててください。RNAiプレートから10個のトランスジェニックL4を10セットピックアップし、各セットを3センチメートルのRNAiプレートに置きます。アッセイ用に選択されたワームがすべて表面的に正常な運動性を持っていることを確認してください。プレートをビニール袋に入れて水分を保持し、摂氏25度でインキュベートします。24時間後、解剖顕微鏡のプレートをタップし、動きを確認して移動性のために動物を分析します。ワームが体長以上動く場合は、移動体としてカウントし、新しい3センチメートルのRNAiプレートに転送します。頭と尾の残りのワームをタップするプラチナピックを使用してください。動物が体の長さ以上に動く場合は、移動体として動物を数え、新しい3センチメートルのRNAiプレートに移します。2日目までに空のベクトル制御で有意な麻痺が見られない場合は、アッセイを終了して最初からやり直してください。すべての動かないワームをグループ化して、体長以上の動きを簡単に検出できるようにします。すべての麻痺、袋詰め、または死んだワームを数え、プレートを捨てます。毎日5~7日間、麻痺の動物を採点し続けます。増殖アッセイは、G4C2反復拡張を有するALS患者に見られるRANジペプチドの毒性に対する遺伝子阻害の効果を測定するために使用された。PR50 GFPの発現だけでは完全な成長停止が生じたが、いくつかの遺伝子のノックダウンは発達毒性を抑制した。PR50発現動物の発達運動性に対する特異的遺伝子ノックダウンの効果を、ビデオ速度解析法を用いて測定した。予想通り、PR50 GFP発現の阻害は、空のベクターRNAiと比較して運動性の大幅な増加をもたらした。さらに、プロテアソームサブユニットRPN7に対するRNAiは、PR50運動性の有意な増加をもたらした。成人表現型を年齢依存性麻痺アッセイで分析した場合、PR50 GFPは5日までに最大80%の麻痺を示した。しかし、RNAiは、PR50 GFP毒性に対して袋-6が必要であることを示唆する有意に遅延した麻痺の遺伝子に向けられた。ランタンパク質がC.elegansニューロンで発現したときに神経病理学を引き起こすかどうかを判断するために、ニューロン特異的毒性をコミュランスアッセイを用いて検討した。2日目の成人では、運動ニューロンにおけるPR50 GFP発現が運動ニューロンの出血の有意な増加につながった。この神経病理学は、インスリンIGF受容体遺伝子ホモログDAF-2の変異によって有意に抑制され、いくつかの神経変性タンパク質の毒性特性を遅延させた。行動アッセイでは、RANペプチドが浸透性の高い表現型を生成することが重要です。このような遺伝子または薬物は、RANペプチド疾患の新しいバイオマーカーまたは治療オプションを提供することができる。これらのアッセイを用いて、C9ORF72に関連するRANペプチドプロリンアルギニンのサプレッサーに対するゲノムワイドRNAiスクリーンを実施した。この画面で同定された遺伝子には、将来の機械研究の対象となる多くの新しい保存された遺伝子が含まれる。

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Research

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Biology

生物学

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学ぶ C.エレガンスを用いたRANペプチド毒性の定量的評価法。行動アッセイと細胞アッセイにより、神経変性疾患のメカニズム解明と治療戦略開発への貢献を目指す標準化プロトコルです。

C.エレガンスにおけるRANペプチド毒性の測定

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