Name: チラピア湖ウイルスの特異的かつ迅速な検出のための逆転写ループ媒介等熱増幅(RT-LAMP)アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 学ぶRT-LAMPアッセイによるチラピア湖ウイルスの迅速検出法。従来のRT-PCRより簡便で高速なこの手法は、発展途上国での養殖現場での疾病管理とウイルス拡大防止に貢献します。

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このプロジェクトは、タイの高等教育研究推進・国立研究大学プロジェクトの下、タイの高等教育研究基金(TRF)助成金番号RDG6050078と農業・食品先端研究センター、バンコク、タイの高等教育研究推進と国立研究大学プロジェクトの下で、タイの教育研究委員会のオフィス、タイの教育委員会のオフィスで資金を提供しています。研究の一部は、カセサート大学大学院大学院大学院奨学金によって支援されています。著者たちは、ビデオの物語を話してくれたクワンラウィー・シリカンチャナ博士と、ビデオを編集してくれたピヤウォッチアラ・シカリンに感謝したいと思います。

この実験は、動物組織の使用を含む、カセサート大学、バンコク、タイの施設動物の世話と使用委員会によって承認されました (プロトコル番号ACKU61-VET-009).
1. 組織の収集
<ol><li>クローブオイルの過剰摂取(すなわち、3 mL/L以上)を使用してティラピア魚を安楽死させる。トリケインメタンスルホン酸塩は、クローブオイルの代替として使用することができる。</li>
	<li>滅菌マヨハサミと鉗子を使用して、死後のティラピアの腹部を切り開き、約30〜50mgの肝臓組織を切り離すか、顕微鏡カバーガラスを使用して、魚の皮膚層を縦方向(前から後部まで)に削り取って100μLの粘液を収集します。</li>
	<li>すぐにRNA抽出ステップに進むか、または、実験まで収集したサンプルを−80°Cに保ちます。無傷のRNAはDNAよりも敏感であるため、RNA抽出時にRNaseフリーの材料と試薬を使用してください。</li>
</ol>2. RNA抽出
<ol><li>肝臓組織からRNAを抽出するには、チラピア組織の30〜50mgをグアニジウム酸フェノール抽出試薬(材料表)600~1,000 μLを含む1.5mLマイクロ遠心チューブに加え、ハンドヘルド組織ホモジナイザーを使用して均質になるまでサンプルを粉砕します。組織サンプルは、グアニジニウム酸フェノール抽出試薬の約10%を必要とします。粘液サンプルの場合、グアニジニウム酸フェノール抽出試薬の300 μLのみを使用してください(3:1)。 注意:グアニジニウム酸フェノール抽出試薬は有毒です。したがって、取扱いは注意して行う必要があります。安全眼鏡、実験室用ガウン、および安全手袋などの保護具は着用する必要があります。</li>
	<li>均質化サンプルを室温で30sの10,000 x gで遠心分離し、上清を新しい滅菌1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。</li>
	<li>チューブに95%のエタノールの等しいボリュームを追加し、よく混ぜます。</li>
	<li>溶液を、コレクションチューブに入れたスピンカラム(材料表)に移し、遠心分離機を室温で30sの10,000 x gで移動します。フロースルーを破棄し、スピンカラムを新しいコレクションチューブに転送します。</li>
	<li>400 μL の RNA プレウォッシュ試薬 (材料表) をカラムに加え、遠心分離機を 10,000 x gで室温で 30 s で加え、流量を廃棄します。この手順をもう一度繰り返します。 注:RNAプレウォッシュを調製するには、95%エタノールの10 mLを40mLのRNAプリウォッシュ濃縮物に加えます。</li>
	<li>カラムに700 μLのRNAウォッシュバッファー(材料表)を加え、遠心分離機を10,000 x gで室温で2分間加えます。カラムを無菌1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。 注:RNAウォッシュバッファーを調製するには、95%エタノールの52 mLをRNAウォッシュバッファー濃縮物の12 mLに加えます。</li>
	<li>スピンカラムマトリックスに取り込まれたRNAサンプルを、100μLのヌクレアーゼフリー水で、遠心分離機を10,000 x gで室温で30sで溶出させます。</li>
	<li>マイクロボリューム分光光度計を用いて抽出したRNAの濃度を測定し、ヌクレアーゼを含まない水を用いてRNAを所望の濃度に希釈します。 注: OD260/OD280 の修飾吸光度値は 1.6 から 1.9 までであり、RT-LAMP アッセイに許容される RNA 純度を示します。</li>
	<li>直ちに次のステップに進むか、使用するまでサンプルを−80°Cに保ちます。</li>
</ol>3. プライマー設計
<ol><li>プライマーエクスプローラバージョン4を使用して、RT-LAMP用の特定のプライマーを設計します。ウェブサイトにアクセスし、https://primerexplorer.jp/e/、PrimerExplorer V4ボタンをクリックします。</li>
	<li>TiLVのセグメント3のシーケンスを含むファイルをFASTA形式で選択し、プライマーデザインボタンをクリックします。 注:ティラピア湖ウイルスTV1セグメント31を表すGenBankの加盟番号KX631923からFASTA形式のシーケンスを取得します。</li>
	<li>プライマーを設計するには、次の基本パラメータを入力します。 - 40%~60%のGC含有量 - ≥280 塩基対のアンプリコン(bp) - 5 °Cの最大差を有するプライマー間の同様の融解温度(Tm) 注: プライマーはお互いを補完してはなりません<ol>
<li>二次構造を形成しやすいシーケンス領域を避けます。</li>
		<li>最大のΔGの最適設計には最小-3.5のダイマープライマー解析を選択し、小さなΔGに最適な設計を行う場合は、最大-4のプライマーの端部を選択します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>[生成]ボタンをクリックします。 注: ソフトウェアが入力データの処理を終了すると、プライマーの結果が表示されます (図 1)。</li>
</ol>4. RTランプアッセイ
<ol><li>2.5 μLの1x SD II反応バッファー、3 μLの6 mM MgSO 4、1.4 mM dNTPセットの1.4 μL、0.8 Mベタインの4 μL、0.052 mMカルセイン混合物の1.3 μL、1μLの1.6μM TiLV-F3r、 1 μLの1.6 μM TiLV-B3プライマー、0.2 μM TiLV-BIPプライマーの1 μL、0.2 μM TiLV-FIPプライマーの1 μL、0.3 U Bst DNAポリメラーゼの1 μL、0.1 U AMV逆転写酵素の1 μL、および3.8 μLの核無反応反応。4 注:総反応量の少なくとも10%を含む余分なマスターミックスを準備してください。</li>
	<li>RT-LAMPマスターの22 μLを無菌1.5マイクロ遠心分離管に混ぜます。</li>
	<li>抽出したRNAを3μLずつ反応管に加え、ボルテックスで混合します。陰性のコントロールには、RNA材料の代わりに蒸留水を使用してください。</li>
	<li>65°Cで60分間反応をインキュベートし、続いて80°Cで10分間反応を終了させる。</li>
	<li>インキュベーション後、肉眼での色分け変化を目視で観察する。正の結果は蛍光グリーンの色として表示されます。</li>
</ol>5. アガロースゲル電気泳動
<ol><li>アガロース粉末の0.6 gを1x TAEバッファーの40 mLに懸濁させて1.5%w/vアガロースゲルを調製します。混合物を電子レンジで3〜5分間加熱してアガロースが完全に溶解するまで溶かし、混ぜ合わせます。</li>
	<li>アガロースは、温度が65°Cに達するまで冷却します。40 mLのアガロース溶液をゲルトレイに注ぎ、ジェルモールドに櫛を加えます。</li>
	<li>アガロースゲルが完全に固まるまで室温で20〜30分間セットします。その後、くしを取り出し、ゲルをゲルタンクに入れます。</li>
	<li>ランニングバッファーを追加して、ゲルタンク内のゲルの表面を覆います。</li>
	<li>RT-LAMPサンプル10μLと6xゲルローディングバッファの2μLを各ウェルに加えます。参照レーンに1kbのDNAラダーの5μLを加えます。</li>
	<li>カソードに取り付けられた蓋と、電源に接続されたアノードを差し込みます。電源を入れ、一定の100Vに設定し、40分間稼働します。</li>
	<li>ゲル分離が完了したら、ゲルトレイからゲルを取り出します。その後、エチジウムブロマイド(EtBr)を使用して7分間10mg/mLの濃度で水切りゲルを染色し、蒸留水に5分間レステインします。 注意:EtBrは有毒であり、発がん性物質とみなされます。したがって、このエージェントを使用する際には注意してください。</li>
	<li>バンドが現れるゲルドキュメンテーションシステムを使用してゲルをUV光にさらし、ゲルの写真を撮ります。</li>
</ol>6. 相補DNA(cDNA)合成
<ol><li>2 μL の 5x RT バッファー、0.5 μL のプライマーミックス、0.5 μL の RT 酵素、および反応ごとに 2 μL のヌクレアーゼを含む cDNA 合成マスターミックスを準備します。 注:ピペット処理中の潜在的な損失による反応を1倍に含む余分なマスターミックスを準備してください。</li>
	<li>マスターミックスの5 μLを無菌1.5 mLマイクロ遠心分離チューブに分配します。</li>
	<li>希釈した抽出されたRNA(ステップ2.8から得た)の100 ngを反応管に加え、混合してスピンダウンして、すべての混合物を容器の底に移動させます。</li>
	<li>42°Cで60分間インキュベートし、PCR機で5分間98°Cを続けます。cDNAは使用するまで−20°Cで保存してください。</li>
</ol>7. RT-qPCR
<ol><li>10 μMリバースプライマーの0.3 μL、10 μMフォワードプライマーの0.3 μL、2x SYBRグリーンDNAポリメラーゼの5 μL、および反応ごとに0.4 μLのヌクレアーゼを含むTiLV qPCRマスターミックスを準備します。次のプライマーとコントロールを使用します。 フォワードプライマー(TiLV-112F):5'-CTGAGCTAAAGAGGCATATATATAtt-3' リバースプライマー(TiLV-112R):5'-CGTGCGTACTCGTTCAGTATAGTTCT-3'</li>
	<li>TiLV qPCRマスターミックスの6 μLを、使用するリアルタイムサーマルサイクラーと互換性のあるqPCRストリップの各ウェルに塗布します。</li>
	<li>cDNAテンプレートの4μL、陰性対照(ヌクレアーゼフリー水)、陽性対照(10pg/μL)、pTiLV(プラスミド)10または連続希釈されたTiLVプラスミドをウェルに加え、フリックして各サンプルを混合します。各サンプルを三重にして実施します。</li>
	<li>qPCR 反応をプログラムされたリアルタイムサーマルサイクラーに入れます。3分間95°Cでインキュベーションを行うqPCRプログラムを設定し、温度が0.5°C/5単位で65°Cから95°Cに上昇する必要がある融解曲線ステップの前に、10 sの95°Cと30sの60°Cの40サイクルが続くように設定します。</li>
	<li>増幅・融解曲線を評価してデータ解析を行い、連続希釈されたプラスミドを用いてデータから得られた標準曲線を用いてTiLVコピー数を計算します。</li>
</ol>

<ol><li>Surachetpong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outbreaks+of+Tilapia+Lake+Virus+Infection%2C+Thailand%2C+2015-2016%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016.</a> Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).</li>
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<li>Mori, Y., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29%3A+a+rapid%2C+accurate%2C+and+cost-effective+diagnostic+method+for+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a rapid, accurate, and cost-effective diagnostic method for infectious diseases.</a> Journal of Infection and Chemotherapy. 15 (2), 62-69 (2009).</li>
<li>Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+by+turbidity+derived+from+magnesium+pyrophosphate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 289 (1), 150-154 (2001).</li>
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著者らは開示するものは何もない。

養殖産業は、継続的に実質的な経済的損失を引き起こすウイルス感染によって脅かされています9,23,,28.例えば、新興TiLVは、世界の多くの地域でティラピア生産国に大きな脅威を与えています1,,6,9.これまで、TiLVDを予防するための特定の治療法はありませんでした。ワクチンの開発が進行中である一方で、効率的なワクチンは商業目的で利用可能になる前にかなりの時間を必要とします。このような状況を考えると、TiLVD29,30,30の普及を防ぐために、魚農場では消毒剤の適用などの厳格なバイオセキュリティ測定が必要である。現在、TiLV透過を低減するための最...

ティラピア湖ウイルス病(TiLVD)は、アジア1、2、アフリカ、アメリカを含む世界の多くの地域でティラピアの死亡を引き起こすと伝えられているティラピア(1,オロークロミス属)のウイルス性疾患です。この病気は、2009年にイスラエルでティラピアの大量死亡時に初めて認められ、キネレット湖の野生のティラピアの数は年間257トンから8トンに劇的に急落した。この疾患は、チラピア湖ウイルス(TiLV)によって引き起こされ、これは、新しい属ティラピネウイルスおよび新種ティラピアチラピネウイルス3としてアムヌーンウイルス科に割り当てられている。TiLVの遺伝的特徴付,けは、ウイルスが10タンパク質,1、2、4をコードする10個のセグメントを有する新規なエンベロープ、陰1性感覚、一本鎖RNAウイルスであることを示した。4セロロドン属のティラピアの様々な種、オレオクロミス、およびティラピンおよび他の温水魚(例えば、巨大なグーラ(オスフロネムス・ゴラミー))はTiLV2,55の影響を受けやすいことが示2されている。現在、このウイルスは、感染した生きた魚66、77の動きを通じて世界的に広がり続けているが、凍結チラピアまたはその製品を介したウイルス感染のリスクは8に制限されている。TiLV感染による実質的な死亡率は、ティラピア産業に著しく有害な経済的影響を及ぼす可能性がある。例えば、TiLV感染に伴うエジプトにおける夏の死亡率症候群の経済的影響は、1億米ドル9と計算された。したがって、養殖場におけるこの病気の管理を容易にする迅速かつ適切な診断方法を開発することが重要である。
これまでTiLVDの診断は、分子アッセイ、ウイルス分離、組織病理学に基づいていました。TiLV診断10,11,11用に異なるPCRプロトコルおよびプライマーが開発されている。例えば、ウイルスの検出感度を有するSYBRグリーンベースの逆転写定量PCR(RT-qPCR)法が開発され、TiLV検出10のために検証されている。TiLV 検出の他の PCR 法としては、TaqMan 定量 PCR11、RT-PCR2、入れ子になった RT-PCR12、および半ネスト RT-PCR13が挙げられます。しかし、これらの方法は、反応の複雑さのために結果を生み出すために洗練された実験室機器と比較的長い時間を必要とし、フィールドアプリケーションには適していません。
ループ媒介アイソ熱増幅(LAMP)アッセイは、迅速でシンプルで実用的な分野アプリケーション14,15,15です。この技術はストランド変位反応の原理を採用し、増幅反応は洗練された高価なサーマルサイクラー14,15,15を使用せずに等温条件下で実行される。その結果、増幅されたLAMP製品またはRT-LAMP製品は、DNAまたはRNA14の安全な可視化または濁度または白い沈殿物,16、17、18,17の存在のために肉眼で観察するための蛍光染色を有するアガロースゲル電気泳動を用いてラダー状のバンドで分析される。18これらの理由から、この技術は、異なる魚病原体,,,17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27のオンサイト検出に使用されています。20,21,22,17,18,19,26,27232425本研究の目的は、TiLV検出のための迅速で敏感で正確なRT-LAMPアッセイを確立することであった。RT-LAMPアッセイは30分以内に魚のサンプルのTiLVのためのスクリーニングを提供する。この技術はTiLVDの診断および監視のために適用されるかもしれない。

<table><tbody><tr><td>ティッシュコレクション:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>クローブオイル</td><td>ベターファーマ</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>トリカインメタンスルホン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>クローブオイル</td></tr><tr><td>の代替オプション RNA抽出:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>酸性グアニジニウムフェノール系試薬(トリゾール試薬)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社</td><td></td><td></td>15596026</tr><tr><td>酸性グアニジニウムフェノール系試薬(GENEzol reagent)</td><td>Geneaid</td><td>GZR100</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA Kit:</td><td>Zymo Research</td><td>R2071</td><td></td></tr><tr><td>- Direct-zol RNA PreWash</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>- RNA Wash Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>- DNase/RNase-free water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>- Zymo-spin IIICGカラム</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>- Collection Tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RT-LAMP:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x SD II 反応バッファー</td><td>Biotechrabbit</td><td>BR1101301</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム (MgSO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7487-88-9</td><td></td></tr><tr><td>dNTP set</td><td>Bioline</td><td>BIO-39053</td><td></td></tr><tr><td>ベタイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2629</td><td></td></tr><tr><td>カルセイン混合物</td><td>メルク</td><td>1461-15-0</td><td></td></tr><tr><td>Bst DNA ポリメラーゼ</td><td>Biotechrabbit</td><td>BR1101301</td><td></td></tr><tr><td>AMV 逆転写酵素</td><td>プロメガ</td><td>M510A</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>Invitrogen</td><td>10320995</td><td></td></tr><tr><td>エリート ドライバス インキュベーター、シングルユニット</td><td>メジャー サイエンス</td><td>EL-01-220<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Gel電気泳動:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Vivantis Technologies</td><td>PC0701-500G</td><td></td></tr><tr><td>トリスホウ酸EDTA(TBE)バッファー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRE0062</td><td></td></tr><tr><td>Tris-acetic-EDTA(TAE)バッファー:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>- Tris</td><td>Vivantis Technologies</td><td>PR0612-1KG</td><td></td></tr><tr><td>- 酢酸(氷)、EMSURE</td><td>メルクミリポア</td><td>1000632500</td><td></td></tr><tr><td>-エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム(EDTA)、ベテック</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>V800170-500G</td><td></td></tr><tr><td>ネオ</td><td>グリーンネオサイエンス株式会社</td><td>GR107</td><td></td></tr><tr><td>DNAゲルローディング色素 (6X)</td><td>ThermoFisher Scientific Corp.</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>DNA ラダーおよびマーカー</td><td>Vivantis Technologies</td><td>PC701-100G</td><td></td></tr><tr><td>Mini Ready Sub-Cell GT (Horizontal electrophoresis system)</td><td>Bio-Rad</td><td>1704487</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac HC 電源</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc EZ System</td><td>Bio-Rad</td><td>1708270</td><td></td></tr><tr><td>UV sample tray</td><td>Bio-Rad</td><td>1708271</td><td></td></tr><tr><td>N&alpha;BIイメージャー</td><td>Neogene Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cDNA合成:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ReverTra Ace qPCR RTキット</td><td>東洋紡</td><td>FSQ-101</td><td></td></tr><tr><td>Viva cDNA合成キット</td><td>Vivantis Technologies</td><td>cDSK01</td><td>cDNA合成の代替オプション</td></tr><tr><td>NanoDrop2000(微量分光光度計)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック(株)</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>T100 サーマルサイクラー</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>RT-qPCR:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>1725120</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water, sterile water</td><td>MultiCell</td><td>809-115-CL</td><td></td></tr><tr><td>8-tube PCR strips, white</td><td>Bio-Rad</td><td>TLS0851</td><td></td></tr><tr><td>フラットPCRチューブ 8キャップストリップ、光学</td><td>バイオ・ラッド</td><td>TCS0803</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 タッチサーマルサイクラー</td><td>バイオ・ラッド</td><td>1855196</td><td></td></tr><tr><td>一般的な機器・材料:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>メイヨーハサミ</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2 (ボルテックスミキサー)</td><td>科学産業</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離機 LM-60</td><td>LioFuge</td><td>CM610</td><td></td></tr><tr><td>コーニング LSE ミニマイクロ遠心機</td><td>コーニング</td><td>6765</td><td></td></tr><tr><td>ピペット</td><td>レイニン</td><td>ピペットライト XLS</td><td></td></tr><tr><td>QSP フィルター付きピペットチップ</td><td>品質 科学プラスチック</td><td>TFシリーズ</td><td></td></tr><tr><td>コーニング アイソチップ メル</td><td>ク</td><td>CLSシリーズ</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー1.5 mL微量遠心チューブ、NEST</td><td>Wuxi NEST Biotechnology</td><td>615601</td><td></td></tr></tbody></table>

チラピア湖ウイルスの特異的かつ迅速な検出のための逆転写ループ媒介等熱増幅(rt-lamp)アッセイ

Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for the Specific and Rapid Detection of Tilapia Lake Virus

ティラピア湖ウイルス病(TiLVD)は、ティラピア湖ウイルス(TiLV)によって引き起こされるチラピアの新興ウイルス病であり、世界の多くの地域でティラピアの大量罹患率と死亡率をもたらした養殖業における永続的な課題です。TiLV感染に対する効果的で迅速かつ正確な診断アッセイは、初期感染を検出し、養殖農業における病気の蔓延を防ぐために必要です。本研究では、魚類組織におけるティラピア湖ウイルスを検出するために、高感度かつ実用的な逆転写ループ媒介等温増幅法(RT-LAMP)法を発表した。感染したサンプルのRT-qPCRとRT-LAMPアッセイの比較は、63(100%)で肯定的な結果を明らかにしましたおよび 51 (80.95%)それぞれサンプル。さらに、感染していないサンプルの分析は、全63の未感染組織がRT-qPCRおよびRT-LAMPアッセイの両方に否定的な結果をもたらすことを示した。ティラピアの5つの病原体との交差反応性をRT-LAMPを用いて評価し、すべての試験は否定的な結果を示した。感染した魚から得られた肝臓と粘液の両方のサンプルは、RT-LAMP法を使用して同等の結果を示し、粘液は魚を殺すことを避けるために非致死的なアッセイとしてRT-LAMPで使用できることを示唆した。結論として、この結果は、提示されたRT-LAMPアッセイが1時間以内にティラピア組織におけるTiLV検出に有効な方法を提供することを実証した。したがって、この方法は、TiLVの迅速な診断のための農場でのスクリーニングツールとして推奨されます。

本研究では、ティラピアにおけるTiLV感染を検出するためのRT-LAMPアッセイが開発された。試験されたサンプルは、2015年から2016年の間にタイの異なる地域にある14の農場から収集されました。感染した魚と感染していない魚は、主に物理的な診断と症候性TiLVDの出現に基づいてグループ化されました。TiLV感染は、その後、回収プロセス後にRT-PCRを用いて確認された。ランプアンプリコンの評価方法として、アガロースゲル電気泳動と発光緑色の検出を選択した(図2)。感染したティラピア魚の肝臓と粘液は、皮膚の浸食、皮膚の赤み、外眼筋、腹部の腫脹を含むTiLV疾患症状の臨床的出現によって特徴付けられました。以前の報告は、TiLV35の存在を決定する分子診断アッセイにおける肝臓サンプルの使用を実証している。あるいは、粘液は動物を殺すことを避けるのに役立つかもしれないので、アッセイにおいて有益であり得る。結果は、感染した魚の感染した肝臓および粘液サンプルにおけるラダー様DNAバンドパターンと蛍光緑色を示した(<strong class="x...

従来のRT-PCR技術と比較して比較的短時間で簡単な機器を使用したティラピア魚のTiLV検出用RT-LAMPアッセイを発表します。このプロトコルは、特に発展途上国において、TiLVDの流行の広がりを制御するのに役立つ可能性がある。

チラピア湖ウイルスの特異的かつ迅速な検出のための逆転写ループ媒介等熱増幅(RT-LAMP)アッセイ

Tilapia lake virus disease (TiLVD), an emerging viral disease in tilapia caused by the tilapia lake virus (TiLV), is a persistent challenge in the ...

ティラピア湖ウイルスは、チラピアとそのハイブリッド種で高い死亡率を引き起こす新興ウイルスおよび伝染病原体である。ティラピアは多くの発展途上国の主要なタンパク質源であるため、新しいウイルス感染はティラピア養殖に大きな影響を与え、世界の食料安全保障にも大きな影響を与えます。魚の組織でウイルスを検出するための高速で正確で敏感な方法の開発は、病気のコントロールを助け、ウイルスの影響を減らします。このビデオでは、魚のサンプル中のティラピア湖ウイルスを迅速に検出するための逆転写ループ媒介等温増幅(RT-LAMPアッセイ)を紹介します。第2部、RNA抽出。まず、3250ミリグラムの肝臓組織を無菌1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに加え、600〜1000マイクロリットルの酸グアニジニウムフェノールベース試薬を含み、均質になるまでミンチする。遠心分離機を10,000 RCFで30秒間、上清を新しいチューブに移します。等量の95%エタノールをチューブに加え、十分に混ぜます。溶液をスピンカラムに移し、回収管に入れ、遠心分離機を10,000 RCFで30秒間転送します。フロースルーを破棄し、列を新しいコレクション チューブに転送します。カラムに400マイクロリットルのRNA PreWashを加え、遠心分離機を10,000 RCFに30秒間加えます。フロースルーを破棄し、この手順を繰り返します。カラムに700マイクロリットルRNAウォッシュバッファーを加え、遠心分離機を10,000 RCFに2分間加えます。その後、カラムを無菌1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移します。最後に、100マイクロリットル、ヌクレアーゼフリー水、遠心分離機を10,000 RCFで30秒間、カラムマトリックスに溶出させます。第3部、プライマーデザイン。PrimerExplorerバージョン4は、効率的なLAMP、またはRT-LAMPプライマーを設計するための最も一般的なバイオインフォマティクスツールで、ソフトウェアの優れたマニュアルがウェブサイト上で入手可能です。ここでは、2つの内部および2つの外部プライマーから構成される4つの特定のプライマーは、タイから生まれたTiLVのセグメント3の6つの異なる領域を認識するように設計された。リンクがビデオに表示されているウェブサイトに入った後、PrimerExplorer V4をクリックします。TiLVのセグメント3のシーケンスを含むファイルを、GENBankアクセス番号KX631923またはティラピア湖ウイルスTV1セグメント3から取得したFASTA形式で選択し、プライマーデザインボタンをクリックします。生成ボタンをクリックすると、ソフトウェアが処理され、結果が表示されます。LAMP増幅のための配列を最適化した後、合計で、1対の外部プライマーと2組の内部プライマーを、この研究のために選択し、TiLV感染を検出した。プライマーのこのセットをここに示します。第4部、RT-LAMPのデモンストレーション。ティラピア湖ウイルスに対するRT-LAMP特異的なマスターミックスは、以下の化学物質から構成される。表に示す化学物質を使用してマスターミックスを準備します。22マイクロリットルのマスターミックスを無菌1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに分配します。次に、反応管に3マイクロリットルのRNAテンプレートを加えます。陰性のコントロールには、RNA材料の代わりに蒸留水を使用し、よく混ぜます。65°Cで60分間、摂氏80度で10分間インキュベートします。30分間のインキュベーション後、カロリーメトリック変化は目の目で視覚的に観察される。適切な場合には、RT-LAMPアッセイの結果を確認し、1.5%アガロースゲルにゲル電気泳動を行い、100ボルト定数で40分間実行し、それによって1キロベースペアの分子サイズDNAラダーをマーカーとしてロードしてフラグメントサイズを決定します。第5部、代表的な結果と解釈。30分間のインキュベーション後、魚組織におけるTiLVの陽性増幅を示唆する穀物蛍光反応は、明らかに365ナノメートルの波長でUV光下で感染したサンプルで観察され、一方で陰性対照のサンプルは透明で、わずかに無色の溶液を有していた。これに対応して、RT-LAMP製品の増幅はアガロースゲル電気泳動で確認され、反転DNA反復の複数の増幅の様々なサイズを示し、TiLV感染サンプルのUVランプ下にステムループ構造を形成したのに対し、負の対照の井戸にはバンドが表示されなかった。したがって、チラピア湖ウイルスの拡散を減らすために、効果的に診断方法を用いて、これらの感染した魚の即時スクリーニングは、重要な鍵の一つである。したがって、新しく開発されたRT-LAMPアッセイは、バイオセキュリティ対策の過程で適用される迅速かつ敏感な診断ツールを提供する必要があります。このアッセイは、実験室またはオンサイト施設のいずれかで使用することができます。この方法が、ティラピア湖ウイルスの拡散の減少につながる可能性のある感染魚の個体数をスクリーニングするために実装されることを願っています。

reverse-transcription-loop-mediated-isothermal-amplification-rt-lamp

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

出典: Domesle, K. J. ほか。ループ媒介の等温増幅による動物性食品中の サルモネラ のスクリーニングおよび培養分離による サルモネラ の確認。 J. Vis.

細菌遺伝子検出のためのループ媒介等温増幅

このビデオでは、リアルタイムの逆転写PCRを使用してウイルス感染を検出するための定量的な方法を示しています。逆転写ステップでは、RNAがcDNAに変換され、PCRサイクルによって増幅されます。サンプル中のウイルスRNAの存在は、PCRから得られたDNAの増幅曲線と解離曲線を分析することによって確認されます。...

ウイルス感染の診断のためのリアルタイム定量的逆転写PCR

現在では、複雑なサンプル準備と高価な計測器が必要し、低リソース環境では使用しにくいジカ、チクングニア ウイルスおよびデング...

多重等温増幅ベース ジカ、チクングニア ウイルスおよびデング熱 1 を検出する診断プラットフォーム

このプロトコルは、効率的かつ低コスト ジカのウイルスを検出または逆のトランスクリプション ループ lamp 法 (RT ランプ) で人間の尿や血清のサンプルや蚊のターゲットを制御するメソッドを提供します。このメソッドは、RNA の隔離を必要としないし、30...

逆にジカと尿、血清、蚊のサンプルでハウスキーピング遺伝子の転写-ループ - Lamp 法 (RT ランプ) アッセイ

このプロトコルは、RT-PCR の方法論を利用したティラピア生体ティラピア湖ウイルス (TiLV) を診断します。全体の方法は、総 RNA の抽出、続いて cDNA を合成して、従来の PCR またはバインディングの蛍光色素を結合 dsDNA を使用して量的な PCR によって TiLV...

ティラピア湖ウイルスを使用して従来 RT-PCR および SYBR の検出グリーン Rt-qpcr

dsDNAインターカリング色素を用いてこのリアルタイムRT-PCRは、リサウイルス感染の診断に適しています。この方法は、狂犬病から抽出されたRNAから始まり、マンテモーテムまたは死後サンプル、マスターミックス調製、RNA添加、リアルタイムマシンのセットアップ、結果の正しい解釈を詳細に説明します。...

狂犬病診断のためのパンリサウイルスリアルタイムRT-PCR

脳生検サンプリングから最終解釈まで、迅速な免疫クロマトグラフィー診断検査(RIDT)を用いて、現場条件下での動物狂犬病の死後診断のための完全なプロトコルを提示する。また、分子解析やウイルス遺伝子作成用の装置を用いたさらなる応用についても説明する。...

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ここでは、逆転写ループ媒介等温増幅(RT-LAMP)によりヒトサンプル中のSARS-CoV-2ウイルスを検出する方法を標準化し、実装するための完全なプロトコルを提供します。この方法は60分以内に完了し、低コストで安価な機器を使用して、あらゆる検査室やポイントオブケアに適応できます。...

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学ぶRT-LAMPアッセイによるチラピア湖ウイルスの迅速検出法。従来のRT-PCRより簡便で高速なこの手法は、発展途上国での養殖現場での疾病管理とウイルス拡大防止に貢献します。

チラピア湖ウイルスの特異的かつ迅速な検出のための逆転写ループ媒介等熱増幅(RT-LAMP)アッセイ

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