Name: ラットの心筋梗塞を誘導する半最小侵襲法と、単離した働く心臓システムによる心機能の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-06-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 学ぶラットの心筋梗塞誘導法と単離働く心臓システムによる心機能評価法。最小侵襲的アプローチと再現性の高い血流動態測定技術を用いて、心不全機構の解明と新規治療法の評価を支援します。

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著者らは、バイオメディカル研究センターの運営劇場チームと技術者の貢献、技術支援、貴重なインプット、アドバイスに感謝しています。プロジェクトは、ルートヴィヒ・ボルツマン研究所、心血管研究のためのクラスター(レムプロジェクト)によって資金提供されています。

この記事で説明した結果を提供した実験プロトコルは、ウィーン医科大学の実験動物実験のための地域倫理委員会とオーストリア連邦教育科学研究省(BMWFW-66.009/0023-WF/V/3b/2016)によって承認されています。すべての実験は、米国国立衛生研究所(NIH出版第85-23号、1996年改訂)が発行した実験動物のケアと使用のためのガイドに準拠しています。
注:10-12週齢の雄のスプレイグドーレーラットの体重250-300g(BW)が使用されています。手術室(OR)の無菌環境で以下の手順と治療を行うため、動物を扱う際にはスクラブ、手袋、フェイスマスク、フードを着用してください。ORに入る前に、手を洗って、感染を防いでください。手術セッションで複数の動物を手術する場合は、洗浄と消毒、または手術の間に器具をオートクレーブします。これらの衛生的なガイドラインは、プロトコルセクションで示されているすべての手順に有効です。
1. 術前準備と麻酔
<ol><li>腹腔内にキシラジン(4mg/kg BW)とケタミン(100mg/kg BW)の混合物を注入することにより、術前麻酔を開始する。</li>
	<li>14 G チューブと体積制御換気でラットを、O2、空気、イソフルラン (1-2.5%)75-85ストローク/分、100 mL/ストローク/BW(図1A)必要に応じて、挿管しながらより良いビューのために:局所的なリラクゼーションを達成するために、下咽頭に綿毛の先端を介してキシロカインを適用します。</li>
	<li>熱い手術台の上にラットを置き、テープで前肢を固定します(図1B)。</li>
	<li>プローブで直腸温度を測定します。 注: 37.5-38.5 °C の間で維持する必要があります。</li>
	<li>胸郭を剃り、消毒ポビドー素溶液で操作領域をきれいにします。目の乾燥を防ぐために、ラットに眼軟膏を塗布します。</li>
	<li>腹腔内にピリトラミド(0.1 mL/kg BW)を注入することにより、手術中鎮痛を投与する。</li>
	<li>ECGプローブを動物の四肢に皮下に置く。</li>
	<li>手術を行う前に、尾と足の前の反射神経をチェックしてください。</li>
</ol>2. 手術手順-心筋虚血の誘導
<ol><li>メスを使って皮膚切開を行う。第3肋間空間のレベルで左胸部の2mmのパラスターナルを開始し、第5肋間空間のレベルで前腋窩線に進み続けることを確認する(図1C)。</li>
	<li>表面筋を静かに交換して、リブを見えるようにします(図1D)。</li>
	<li>軽度の出血の場合は、コーターを使用して、周囲の組織を切断または切断する。</li>
	<li>第4肋間空間のレベルで胸部開裂術を行い、心臓と肺の視認性を得るためにレトラクターを挿入する(図1E)。出血を避けるために慎重に胸膜を開きます。</li>
	<li>一時的に定義された時間にわたって虚血/再灌流(MIR)を誘導するために止血帯を使用してLADを閉塞;または永久(MI)は、6-0縫合を使用して結紮を閉じ、6-7ノットを作ることによってそれを閉塞させる(図1F,G)。 注: LAD のオクルージョンの右の場所は、心臓の腹側/左側面のマージンの左耳の下に約 2-3 mm の位置にあります。正常な閉塞は、ECGの変化(STセグメントの標高)およびLVのパリングとしての巨視的な変化に関連付けられます。</li>
	<li>虚血/再灌流モデルの場合、閉塞の30分後に止血帯を除去することによってLADを再開する。</li>
	<li>4-0単一のモノフィラメント縫合線を使用して、3つの単一ボタン縫合糸で胸郭を閉じます(図1H)。最後の縫合糸を締める前に、気胸を防ぐために10 mLの注射器で胸郭から残留空気を取り除く(図1I)。</li>
	<li>筋肉を再配置し、揮発性麻酔をオフにします。</li>
	<li>4-0縫合を用いて連続縫合を使用して皮膚を縫合する(図1J)。</li>
	<li>感染やラットによる縫合糸の噛み付きから保護するために、消毒スプレーを投与します。</li>
</ol>3. 術後治療と除外基準
<ol><li>ネズミが目を覚ますまで暖房テーブルの上に置いておきなさい。彼らは自発的に呼吸を開始するとすぐにラットを排泄します.</li>
	<li>チューブされたラットを加熱ランプの下のケージに入れ、冷却を防ぎます。</li>
	<li>ラットは、再び正常に動作し始めるとき、標準化された条件下で動物の家に戻ります。</li>
	<li>術後の鎮痛のために、2アンプルのピリトラミドと5%グルコースの30 mLを250mLの水に3日間加えます。</li>
	<li>チェックリストと除外基準を使用して、ラットの適合性と行動を確認してください (表 1)。動物は次の週に1日2回、週に2回観察します。 注:国際基準に従って、治療関連の決定を行うために獣医に、チェックリストで評価で最大6ポイントを得る苦しんでいる動物、または動物を提示します。7以上のポイントを獲得する動物は、ケタミンとキシラジンの過剰摂取で直ちに犠牲にする必要があります。</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>試験</td>
			<td>観測</td>
			<td>スコア</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">体重</td>
			<td>安定</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>10%の損失</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>48時間の15%の損失</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>18%の損失</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>ノーマル(コートフラットと光沢)</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="8">外見</td>
			<td>ピロ勃起</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>血腫</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>皮膚創傷/切り傷/咬傷跡</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>ひどく減らされたグルーミング</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>(不浄/凝固または湿ったオリフィス)</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>重度の皮膚刺激または創傷</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>ハンチ姿勢 >2 h</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>重要な腹部の膨満感 (腹水)</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="9">動作</td>
			<td>正常(睡眠、好奇心、社会的接触、触れたときの反応)</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>異常な行動、例えば活動障害</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>自己分離、 顕著な多動性または立体性素</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>レタルギア 用 <6 h</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>6時間から8時間の無気力</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>アパチア >8 h</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>ステレオティピアは、>10分のために中断されず、2時間後に持続する</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>触れたときの痛みの徴候</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>オートマチレーション</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">消化</td>
			<td>通常</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>下痢 (ソフトフェス)</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>72時間または水水性の下痢</td>
			<td>7</td>
		</tr>
<tr>
<td>血まみれの便</td>
			<td>7</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: チェックリストと除外の条件このテーブルには、観察する必要がある検査と対応するスコアが含まれています。したがって、動物の術後治療を適応しなければならないか、獣医師に相談する必要があります。
4. 心エコー検査測定
注:心エコー検査は、通常、MIの誘導前と臓器が収穫される前に2回行われます。
<ol><li>キシラジン(4mg/kg BW)とケタミン(100mg/kg BW)の腹腔内混合物をラットに注入する。</li>
	<li>ラットを加熱トレイの上の上の上の上の上に置きます。胸部にエコージェルを塗布し、超音波が移動しやすく、信号干渉を低減します。</li>
	<li>乳頭筋のレベルでのLVキャビティの準船骨短軸図を取得します。</li>
	<li>左心室の駆出率と形態を測定するために、Mモード心エコー検査を行う。</li>
</ol>5. 臓器収穫(心臓を働かせずに)
<ol><li>キシラジン(4mg/kg BW)およびケタミン(100mg/kg BW)を臓器収穫前に腹腔内投与する。反射が負であることを確認します。 注: 手順は 1 分以上続かないため、挿管は必要ありません。</li>
	<li>メスを使用してシフォイドの下で皮膚切開を行い、はさみを使用して両側の肋骨に平行に拡張します。</li>
	<li>前頭腋線のリブを切り、シフォイドをつかんで胸を持ち上げます(図2A)。</li>
	<li>2組の鉗子で組織を慎重に破裂させることにより、解剖学的または線維組織の接着を除去する。</li>
	<li>5 mL シリンジを用いて、静脈内の下から血液サンプル(血液ガス評価または分子分析用)を採取します。</li>
	<li>入口と出口レベルで心臓全体の切除を行う(図2B)。必要に応じて、セクション6に記載されているように、作業心臓評価を進める。</li>
	<li>収穫臓器は、液体窒素でそれらを衝撃霜、さらなる分子分析のために-80°Cで保存し、または組織学的目的のためにホルムアルデヒドで保存します。</li>
</ol>6. 働く心臓システムを介したエキソビボ血球体力学測定
メモ:装置の一般的なセットアップとコンポーネントは、前に説明されています11.次のプロトコルは、動物の心臓の取り扱いと、LV機能を評価するために必要な手順を説明します。
<ol><li>ステップ5.1に記載されているようにラットを麻酔し、静脈内に200 IUのヘパリンを注入する(大腿静脈)。</li>
	<li>メスで肋骨のアーチの下の切開部を介して胸郭を開き、はさみで前軸線の両方にそれを拡張し、胸骨を高めます。</li>
	<li>その出口の近くの大きな容器を切り取るか、それを切除するために心臓に入口(図2B)。</li>
	<li>心臓を氷冷クレブス-ヘンセライトバッファーに浸し、大オルタをカニューララットして赤血球透過性の孤立した心臓システムに取り付ける(図3A)。</li>
	<li>LDモードから開始し、60 mmHg(安定化期間)の一定の後荷重を使用します。</li>
	<li>LDモードの15分後、WHモードに切り替えます。したがって、肺静脈を介して左心房をカニュールする(図3B)。そして、心房カニューレを遮蔽するクリップを開けてシステム内の流れ方向を変える。これは左心房の灌流と左心11の生理学的血流をもたらす。</li>
	<li>WHモードで20分間の血行力学測定を記録します。</li>
	<li>2 mLシリンジで冠血の滴を収集し、5分ごとに冠状流量(CF、mL/min)を測定します。 注: CF は、左心房流量(LAF)と大動脈流量(AF)の差として測定されます。</li>
	<li>流動プローブを用いて、LAF(心拍出量に相当)とAFの連続測定を行います。 注意:プローブは、WH装置を介してLVに挿入されます。すべてのデータは継続的に登録されます。</li>
	<li>進行中のプロトコル要求がある場合は、大動脈弁を介して逆行して高忠実度カテーテルをLVに挿入し、左心室収縮期圧(LVSP)を測定します。</li>
	<li>毎分行われる圧力-体積の作業を評価するには、心拍出量を心拍数で割ったストローク量を計算します。</li>
	<li>次の式に従って外部心臓の仕事(EHW)を計算する:COg x LVSP(g x m/min)は心臓の重量に正規化した。</li>
</ol>

<ol><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+Health+Estimates+2015%3A+Deaths+by+Cause%2C+Age%2C+Sex%2C+by+Country+and+by+Region%2C+2000-2015%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organization%22%5BJournal%5D)">Global Health Estimates 2015: Deaths by Cause, Age, Sex, by Country and by Region, 2000-2015.</a> World Health Organization. , (2016).</li>
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<li>Liu, P., Xu, B., Cavalieri, T. A., Hock, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+difference+in+myocardial+function+and+inflammation+in+a+rat+model+of+myocardial+ischemia-reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Age-related difference in myocardial function and inflammation in a rat model of myocardial ischemia-reperfusion.</a> Cardiovascular Research. 56 (3), 443-453 (2002).</li>
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<li>Kiss, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vagal+nerve+stimulation+reduces+infarct+size+via+a+mechanism+involving+the+alpha-7+nicotinic+acetylcholine+receptor+and+downregulation+of+cardiac+and+vascular+arginase%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Vagal nerve stimulation reduces infarct size via a mechanism involving the alpha-7 nicotinic acetylcholine receptor and downregulation of cardiac and vascular arginase.</a> Acta Physiologica. 221 (3), 174-181 (2017).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

逆のリモデリングポストMIは心不全の発症の重要なメカニズムであると考えられている。したがって、心血管研究の連続性を確保するために、実験手順および技術は再現可能であるべきである。理解可能で明確に定義された実験プロトコルは、再現性の基本的な要素です。再現性とは、複数の科学者が繰り返し、実験室全体で検証できる結果を指します。本研究は、慢性または再浸透したMIを誘導し、ラットの心臓血行力学的機能を評価するための半低侵襲的方法を提示することを目的とした。
これらの結果およびさらに公表されたデータは、この外科的方法の高い効力とMI、リモデリングおよびHFに関する研究におけるその重要性を示す。虚血/再灌流傷害は、その後の再灌流とのMIの変化を理解するために使用することができるが、永久的な閉塞は、心筋の短期および長期のリモデリングプロセスのさらなる理解を可能にする。他の外科的アプローチはより多くの組織損傷を引き起こし、動物は感染症および気胸を発症するリスクが高く、その結果、より高い中退率をもたらす。これに対し、この手順は、セットアップと取り扱いの特定の改善によって死亡率を減らすことを目的としています。さらに、それらは不安定なLAD閉塞による線維性瘢痕拡張の変動を示す。
当社のプロトコルは、全手順の中で最も重要なステップの1つである挿管のための簡単な方法を提供します。他のいくつかの出版物12とは対照的に、気管切開は我々の手順では行われない。これは、術後の動物の覚醒およびリハビリテーションを促進し、動物が術後測定を受ける前に、この外科的処置によって意図された病態生理学的変化の発症につながる。明らかに、それが非生存プロトコルである場合、気管切開は視力の下で行われ、したがって実行しやすい。さらに、生存プロトコルにおける気管切開術の閉閉は適用されない。胸郭が開いている場合は、崩壊を防ぐために肺を換気することが必須です。したがって、ラットは外科的処置の前に挿管される。低侵襲のアプローチは、胸郭のコンパクトさと安定性を維持するために、肋骨や胸骨を切断しません。その結果、動物の回復が改善され、自然気胸や出血のリスクは比較的低くなります。
前述のように、挿管は明らかな利点であるが、実験の開始時に高い脱落率を引き起こすことがあり、行うことが困難である。この問題は、トレーニングといくつかの解剖学的知識で軽減することができます。チューブを直角に挿入し、チューブを優しく前方に押し出すことができるボーカルの唇を通して光が輝くまで動物の体を伸ばすることが重要です。これは腫れ、その後の鼻孔の閉塞および窒息を引き起こす可能性がありますので、声の唇に害を与えないように注意してください。
LAD が正しく連結されていることも重要です。小さな外科用窓、速い鼓動心臓、換気された肺(すべての接触が肺の出血をもたらす可能性がある限り触れないように)は、血管をはっきりと見えないようにする。したがって、解剖学的知識は不可欠です。左耳結は、危険な領域の標準化とLADの周りのライゲーションの位置の両方を助けるために不可欠です。このステッチは、LVの内壁ではなく、内壁に行う必要があり、これは病理学的プロセスに起因しないLVチャンバー直径および体積の減少を引き起こす可能性がある。成功した閉塞は、心電図上のSTセグメントのリスクおよび上昇における心筋領域のチアノーシスに関連する。この手順の主な制限は、縫合線の正しい位置です。同等の結果を得るためには、ステッチは同じレベルにする必要があり、同様の量の組織を使用する必要があります。これは、訓練の高いレベルを必要とし、動物の異なる重量を考慮する必要があります。もう一つのポイントは、肋間空間の閉鎖前に気胸を適切に除去することです。これが正確に行われなければ、左肺の膨張が気胸によって妨げられるので、動物は呼吸困難を示す。前述のように、これは、スポラックスから任意の残留空気を除去するために注射器を使用することによって軽減することができる。
現在、このMI手順は、重要なステップが高精度で実行された場合、同等の結果と高い生存率を保証する一般的に使用される方法です。MI、HFまたは心臓リモデリングにおける様々な治療、デバイスまたは薬物に関する将来のプロジェクトは、この低侵襲技術を行うことによって評価することができる。
WH測定は、前述のように、そのメンテナンスや取扱いには特定の機器や知識が必要とされる一般的には使用されません。代表的なデータと同等のデータを取得するには、落とし穴を避ける必要があります。最も重要なステップは、心臓の取り付けとDモデルからWHモードへの切り替えです。心臓が十分に切除されない場合、装置に心臓を固定するのに十分な大動脈組織長が必要となるため、装着が困難な場合がある。LDモードに接続した直後に、冷たい緩衝液での洗浄、体内での生理学的刺激の切断、または装置による他の種からの血液との再灌流により、心臓の頻度が低下する可能性があります。このような場合、ペースメーカーは生理学的頻度の復元と保存の両方に適用する必要があります。これはすべての動物の同等の結果を保障する。装置内の血液量がラットにおける生理的体積の倍数となるように、クレブス・ヘンセレイト緩衝液系懸濁液中のウシ赤血球が用いられる。
LD モードから WH モードへの切り替えは、パッシブからアクティブな心臓作業への切り替えと同義です。LD モードは、新しい環境に心臓を慣用するために使用されます。WHモードでは、心臓は生理的な放出機能を実行しなければならない。したがって、後負荷を増やすことによって評価の前に、新しい状況への短い適応段階が必要とされる。
一般的に忘れられているもう一つの重要なステップは、装置および透過物の適切な準備および維持である。各化合物の正確な体積を混合する必要があり、システム内の温度を制御し、調整する必要があります。それにもかかわらず、WHは心拍出量、打撃容積、左心室収縮期圧および冠状動脈流動を同時に評価する上品な方法である。
この再現性の高い手順は、MIを誘導し、WH装置が取得したデータを表すことで、その能力自体を証明しています。半低侵襲アプローチ、LAD閉塞および挿管法のレベルは、梗塞サイズの迅速な回復および低い変動性を促進する。さらに、孤立した作業心臓の心機能分析は貴重な血行力学的結果を提供する。

発生率は継続的に減少しているが、急性心筋梗塞(MI)は依然として世界的に罹患率と死亡率の主要な要因である。急性MIを予防および治療する薬物または外科的処置としての潜在的な治療法の有効性を評価することには制限がある。ヒトで効果を調べる前に、これらの治療法は、動物のインビボ検査を含め、事前にリスクについてテストする必要があります。インビボの条件下よりも病理学を研究するより良い機会はありません。したがって、ラットやマウス、さらには大型動物モデル(ブタまたは羊)のMI誘導は、冠状動脈および周囲の心筋の虚血による短い(急性)および長期(慢性)変化、ならびに心機能障害による全身的な変化の調査を可能にする。梗塞サイズは以前は主な目的でしたが、最近では急性MIや虚血/再灌流傷害、および連続性心不全(HF)における心臓のリモデリングプロセスが大きな関心事となっています。したがって、一貫した結果を得るためには、同等かつ容易に再現可能な方法が必要です。
MIを得るための凍結アブレーションの使用が報告されている間2、我々の方法は、研究者が単一のステッチライゲーションによって左前下降動脈(LAD)を閉塞する他の研究に基づいています。(ヘミ)ステロトミー手順と比較して、この記事で提示される低侵襲アプローチは、より速い術後回復を可能にし、著しく操作時間を短縮する。他の外科的処置の一般的なステップは、胸郭から心臓のリフトアウトが心臓ステッチ3を行う。このメソッドのアプローチでは、この手順は不要になります。プロトコルに応じて、2つの異なる手順を実行することができます:止血帯を使用して一時的な閉塞が虚血/再灌流を定義された時間にわたって誘導します。または合字を固定することによって動脈の永久的な閉塞。閉塞の成功は心電図(ECG)と左心室(LV)の巨視的変化とその青白で評価することができる。
手術前のもう一つの重要なステップは挿管です。ほとんどの場合、挿管は気管切開術を介して、または喉の皮膚切開によって視力下のチューブの経口挿入を介して行われるが、このプロトコルは、術後呼吸困難または感染を減少させる麻酔動物の気管内挿管を記述する44,5。5術後の合併症を避けるために、胸部を閉じる前に注射器を介して胸郭から空気を取り除く。
この記事の2番目のタスクは、孤立した作業心臓実験モデルを介した血行力学的機能の評価であり、それが私たちの研究所66,77内の他のプロジェクトでどのように使用されているかです。心エコー検査、心磁気共鳴画像法(MRI)および圧力-体積ループの侵襲的定量は、生体内の心機能を評価するためによく知られており、広く使用されている方法であるが、それらはいくつかの制限を有することが知られている。心臓のグローバル機能や特定のパラメータを調べるためにカテーテルを使用するような侵襲的なアプローチは、一般的に使用され、心臓測定のゴールドスタンダードを表します。対照的に、ex vivo作動性心臓装置は、その複雑さとコストのためにほとんど使用されない。パーフューズの混合物から心臓の適切な缶取まで、多くの重要な側面があり、評価を成功させるために重要です。孤立した作業心臓装置は、最初にオスカー・ランゲンドルフによって18978年に記述され、ここ数十年にわたって変更されました9.現在、ランゲンドルフ (LD) モードと作業心臓 (WH) モードの 2 つのモデルが使用されています。我々の研究では、LDモードは、その新しい環境(約15分)に心臓を順応するために使用されます。このモードでは、心臓は大動脈を介してカニューレ化され、冠状動脈は前向きに透過させ、心筋を十分に供給する。LDモードでは、心臓は圧力量の作業を行っていません。対照的に、WHモードでは、左心房は肺静脈を介してカニューレ化され、透過物は左心房に入る。心臓は、次に、事前に定義された後負荷に対して生理学的にこのパーフューズをポンプします。時間の経過に伴って後負荷を増加させることにより、心機能を連続的に測定することができる。冠状流れ、心拍出量(CO)、脳卒中量(SV)および仕事、心房流量およびLV収縮期および拡張期圧などのパラメータを測定することができる。心臓に直接、そして単独で様々な治療の影響を調べることができます6,,10.LiaoとPodesser9によるレビューは、心臓機能および代謝に対する薬理学的効果の評価ならびにMI、HF、肥満および糖尿病などの様々な疾患の探索において、この方法の広範な使用を示した。
要約すると、このプロトコルは、MIまたは心筋虚血/再灌流(MIR)傷害を生体内で行う再現可能な方法を提示する。さらに、MI後の単離されたラット心臓に対するLV(dys-)機能の特性評価を可能にする。このプロトコルは、治療と分析のユニークな組み合わせを提示します。

<table><tbody><tr><td>麻酔&鎮痛剤</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>ゾエチス</td><td>TU061219 / 8-00487</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>博士E.Gr&auml;ub AG</td><td></td><td>100 mg/kg 体重</td></tr><tr><td>ピリトラミド</td><td>Hameln-Pharma Plus GmbH</td><td></td><td>2 アンプル 30 ml と 30 ml のグルコース 5% 250ml 水</td></tr><tr><td>キシラジン</td><td>バイエル</td><td></td><td>4 mg/kg 体重</td></tr><tr><td><強>挿管</強></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>空気</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>酸素 (純粋)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>換気装置</td><td>Hugo Sachs Electronics</td><td>UGO Basile S.R.L.</td><td>人工呼吸器</td></tr><tr><td>14ゲージチューブ</td><td>Dickinson and Company</td><td></td><td>BD Venflon</td></tr><tr><td>PREPARATION</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-septic povidine yodine solution&nbsp;</td><td>ムンディファーマ</td><td></td><td>・ベタイソドナ溶液</td></tr><tr><td>眼軟膏&nbsp;</td><td>フレゼニウスカビオーストリア</td><td></td>オ<td>レオバイタルビタミンA+デクスパンテノール</td></tr>シェー<tr><td>バー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><ストロング>手術器具</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖学的鉗子</td><td>マーティン</td><td>12-272-15</td><td></td></tr>解<tr><td>剖学的鉗子スモール</td><td>マーティン</td><td>24-386-16</td><td></td></tr>解<tr><td>剖学的鉗子細い</td><td>オデルガ</td><td>RU4042-15</td><td></td></tr><tr><td>焼灼 ファインチップ</td><td>高温</td><td></td><td>bvi-Accu-Temp</td></tr><tr><td>カップ (小、液体用)</td><td>マーティン</td><td>56-231/11</td><td></td></tr><tr><td>Mensur</td><td>MTI</td><td>29-260/25</td><td></td></tr><tr><td>モスキートクランプ</td><td>MTI</td><td>05-055/12</td><td></td></tr><tr><td>ニードルホルダー ショート</td><td>マーティン</td><td>20-658-14</td><td></td></tr><tr><td>ニードルホルダー シン</td><td>マーティン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>丸フック</td><td></td><td>BT-190</td><td></td></tr><tr><td>スキャルペル 3号</td><td>スワン・モートン</td><td>No.10, 0301</td><td></td></tr><tr><td>組織調製用ハサミ</td><td>Aesculap</td><td>BC259R</td><td></td></tr><tr><td>シャープハサミ</td><td>MTI</td><td>01-010/10</td><td></td></tr><tr><td>小型リトラクター</td><td>Alm</td><td>AM.416.10</td><td></td></tr><tr><td>サーシガル鉗子</td><td>マーティン</td><td>12-321-13</td><td></td></tr><tr><td>手術用ハサミ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>縫合糸</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Permaハンドシルク4-0</td><td>ジョンソン&ジョンソンメディカルプロダクツGmbH</td><td>K891H</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 4-0</td><td>ジョンソン&Johnson Medical Products GmbH</td><td>JV2024</td><td>シングルモノフィル縫合糸&nbsp;</td></tr><tr><td>ビクリル 6-0</td><td>ジョンソン &ジョンソンメディカルプロダクツGmbH</td><td>V301G</td><td>ポリエチレン縫合糸&nbsp;</td></tr><tr><td>コンピュータープログラム&APPARATUS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labchart 7 Pro</td><td>ADInstruments</td><td>v7.3.2</td><td>Labchartソフトウェア</td></tr><tr><td>PowerLabシステム&nbsp;</td><td>ADInstruments</td><td>Powerlab 8/30</td><td></td></tr><tr><td>EX VIVO HEMODYNAMICS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flowmeter Narcomatic RT-500</td><td>Narco Bio-Systems</td><td></td><td>フロープローブ&nbsp;</td></tr><tr><td>孤立した心臓装置&nbsp;</td><td>ヒューゴ・ザックス・エレクトロニクス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labchart 7 Pro</td><td>ADInstruments GmbH</td><td>v7.3.2</td><td>Labchartソフトウェア</td></tr><tr><td>ミラーSPR-407</td><td>ミラー・インスツルメンツ株式会社</td><td>840-4079</td><td>ハイフィデリティMicroTipカテーテル&nbsp;</td></tr><tr><td>Animal bio Amp</td><td>ADInstruments GmbH</td><td>MLA1203</td><td></td></tr><tr><td>Physiological Pressure Transducer (MLT844) with Clip-on BP Domesによる針電極&nbsp;</td><td>ADInstruments GmbH</td><td>MLT844</td><td></td></tr><tr><td>PowerLabシステム&nbsp;</td><td>ADInstruments GmbH</td><td>Powerlab 8/30</td><td></td> (英語</tr></tbody></table>)

ラットの心筋梗塞を誘導する半最小侵襲法と、単離した働く心臓システムによる心機能の評価

Semi-Minimal Invasive Method to Induce Myocardial Infarction in Rats and the Assessment of Cardiac Function by an Isolated Working Heart System

心筋梗塞(MI)は、世界中の罹患率と死亡率の主な要因であり続けています。したがって、このトピックに関する研究は必須です。さらに洞察を得るためには、簡単かつ再現性の高いMI誘導手順が必要です。この手順は、急性MI、その後のリモデリングおよび心不全(HF)における新しい有望な治療法(薬物または介入として)の効果または効力を評価するためにも使用することができる。動物の挿管および術前の準備の後、イオブルランを用いた麻酔プロトコルを行い、外科的処置を迅速に行った。低侵襲アプローチを用いて、左前下降動脈(LAD)を合字によって配置し、閉塞した。閉塞は、その後の再灌流(虚血/再灌流損傷)のために急性に行うことができる。あるいは、血管を永久に結紮して、慢性のMI、リモデリングまたはHFの発達を調査することができる。一般的な落とし穴にもかかわらず、ドロップアウト率は最小限です。遠隔虚血コンディショニングなどの様々な治療法は、その心保護電位の前、周りおよび術後について調べることができます。麻酔が正確に制御され、手術期間が短かったので、術後の回復は速かった。術後鎮痛は3日間投与した。低侵襲の手順は、感染や炎症のリスクを軽減します.さらに、迅速な回復を促進します。「作業心臓」測定はex vivoを行い、プリロード、アフターロード、フローの正確な制御を可能にしました。この手順では、適切な性能を得るための特定の機器とトレーニングが必要です。本稿では、これらの測定を行うための詳細なステップバイステップの紹介を提供します。

以下の結果は、ピルツら6によって公表された。この正確な外科的処置によって、遠隔虚血per調べ(RIPerc)の心保護効果を調査することができる。これは、急性MIまたはMIRとその後の心室リモデリングに苦しむ患者のための潜在的な新しい治療法であり、多くの場合、連続したHFにつながるMI/MIRの病態生理学的変化を模倣することは、インビトロまたはエクスビボ研究としての治療の評価における必須のステップであり、生理学的環境を提供しない。このプロトコルでは、動物は30分のLADオクルージョンを受け、続いて再灌流(すなわち、MIR)を行った。
手順の再現性を証明するために、組織学的切り傷および汚れを行った(図4A)。MIR+リパーク処理動物の線維性瘢痕は、シャムとMIR群の線維化の比較が有意であった一方で、シャム動物の瘢痕形成と同等であることは明らかであった(図4B)。さらに、MIR+リパーク処理動物は、MIR処理動物と比較して線維化が有意に減少した。しかし、代表的な組織学的画像は、梗塞がMIR群で明示的に持続する場合、この外科的処置の効力を明らかにする(図4A)。インビボエクログラフィーを用いて、駆出率、LV末端拡張期および終期収縮期径(LVEDDおよびLVESD)を測定し、血行力学的パラメータをRIPercによって保存しながらMIR治療による心機能を有意に低下させた(図4C−F)。−FEX生体血球力学データは、MIR群がLVSP、心拍出量(CO)、脳卒中量(SV)ならびに外部心臓作業(EHW)の有意な減少を示したので、手順の有効性を示した(図5A−G)。
この外科的処置に関する文献検索は、それが十分に行われたときに否定的または不満足なコメントと結果を報告しなかった。それにもかかわらず、導入と議論で言及された落とし穴を防止する必要があり、トレーニングは、パフォーマンスの安定したレベルを取得し、同等の結果を得るために必須です。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61033/61033fig1.jpg"> 図1:術前の準備と外科的処置を行う. (A) 14Gチューブを用いた動物の挿管。(B) 手術場の位置決めと消毒(C)皮膚切開(第3肋間空間のレベルで左胸部に2mmの寄生皮)。切開は、5番目の肋間空間のレベルで前軸線に到達する必要があります。(D) 筋肉を変えて、肋骨を見えるようにする。(E)胸郭の開口部。(F) 6-7 ノットを使用した LAD の永久閉塞。(G) 止血帯を用いたLADの一時的な閉塞。(H) 肋骨の周りに3つの単一結び目縫合糸を置くことによって心筋虚血および再灌流後の胸部の閉鎖。(私)胸郭の適切な閉鎖。最後の結び目をしっかりと固定する前に、胸郭から残った空気を取り除くために10 mLのシリンジを使用してください。気胸を防ぐために不可欠です。(J)皮膚縫合。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61033/61033fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61033/61033fig2.jpg"> 図2:臓器収穫。(A) サブシフィダルカットで胸を開き、両腋窩線に伸ばします。胸骨の持ち上げを容易にするために、肋骨を通してさらに切り傷が行われる。(B) 心臓の切除<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61033/61033fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61033/61033fig3.jpg"> 図3:孤立した心臓装置。(A) ランゲンドルフ モード。心臓は大腸の缶化を介してWH装置に取り付けられる。(B) ワーキングハートモードシステムは、左心房をカニュータリングすることによって心機能を評価するためにWHモデルに切り替えることができます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61033/61033fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61033/61033fig4.jpg"> 図4:瘢痕形成、左心室機能および改造に対する遠隔虚血調節の効果。(A) 14日目の事後心筋再灌流に収穫された組織学的LVスライス。(B)棒グラフでの線維化の結果を定量化した。(C) 代表Mモード心エコー図(D) 浮出率 (EF) を棒グラフで定量化。(E)LV末端収縮期直径 (LVESD) を棒グラフで定量化。(F)LV末端拡張期直径 (LVEDD) を棒グラフで定量化した。MIR, 心筋虚血再灌流;RIPerc、リモート虚血パーコンディショニング。データは平均値 ± SEM. *p &lt; 0.05 として表されます。**p &lt; 0.01;p &lt; 0.001.エルゼビアの許可を得てピルツら6から転載。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61033/61033fig4large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61033/61033fig5.jpg"> 図5: LV血動力学的機能に対するRIPercの効果(A)LV収縮期圧(LVSP)、(B)心拍出量(CO)、および(C)脳卒中量(SV)結果は、14日目の心筋再灌流で単離された働き心から得られた。B(D) CO は、後負荷の関数として描かれています。(F)外部心臓ワークを後読みの関数として、棒グラフ(EおよびG)で定量化された結果。データは、グループごとに平均値±SEMおよびn= 4~7で表されます。*p &lt; 0.05;**p &lt; 0.01;p &lt; 0.001.MIR, 心筋虚血/再灌流;RIPerc,遠隔虚血予備調整;EHW,外部心臓の仕事;SV、ストロークボリューム;AUC、曲線下の領域。エルゼビアの許可を得てピルツら6から転載。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61033/61033fig5large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

本稿では、低侵襲アプローチを用いてラットの心筋虚血とその後の慢性再灌流を行う効率的な方法を提示する。さらに、ラットの左心室血力学的機能は、心エコー検査および単離された作業心臓法によって評価される。

Myocardial infarction (MI) remains the main contributor to morbidity and mortality worldwide. Therefore, research on this topic is mandatory. An easily ...

治療の著しい改善にもかかわらず、急性心筋梗塞後に心不全を発症する患者の数は依然として増加している。急性のMIから心不全への移行を観察するには、再現可能な動物モデルが必要です。比較的簡単で再現性が高く、動物に対する不快感を最小限に抑えるMIのモデルを実演します。さらに、分離された心臓装置は、時間およびコスト効率の高い方法で研究することができる非常に再現性の高い製剤を提供する。世界中の他の研究グループと共同で、この技術を用いて、MI.挿管やLAD閉塞のレベルなど、このプロトコルの最も重要なステップの視覚的デモンストレーションが一般的な落とし穴を防ぐのに役立つMI.Visualに続く心筋修復および機能を改善する新薬および治療アプローチの安全性と有効性を明らかにするためにこの技術を使用しています。ステップバイステップの記述は訓練を受けていない研究者によって行われた場合でも再現可能な結果を可能にする。ラボ技術者のMilat Inciは、作業心臓測定を行っており、数学者で電子エンジニアのマイケル・コッホが計算解析に貢献しています。ラットを麻酔した後、酸素、空気、およびイオブルランの混合物で14ゲージチューブと体積制御換気でそれを挿管する。熱した手術台の上にネズミを置き、前肢をテープで固定します。次に、ECGプローブを動物の四肢に皮下に配置する。メスを使用して、第3肋間空間のレベルで左胸郭に2ミリメートルのパラスターナルを開始し、第5肋間空間のレベルで前腋窩線に進む切開を行います。肋骨が見られるように、表面筋をそっと動かします。第4肋間空間のレベルで胸部開裂術を行い、心臓と肺の視認性を得るためにレトラクターを挿入する。その後、慎重に出血を避けるために心膜を開きます.虚血再灌流を定義された時間にわたって誘導するために、止血帯で左前前下降動脈を閉塞する。心筋を破裂させた後、左動脈を特定し、縫合糸を心臓の腹側のマージンで国境の下に2〜3ミリメートル置く。30分後に止血帯を取り除いて動脈を再開します。あるいは、6~0の縫合糸で6~7ノットを作って結紮を閉じさせることで、動脈を永久に閉塞させることができる。4-0の単一のモノフィラメント縫合糸を使用して、3つの単一ボタン縫合糸で胸郭を閉じます。最後の縫合糸を締める前に、気胸を防ぐために10ミリメートルの注射器で胸郭から残留空気を取り除きます。筋肉を交換し、揮発性麻酔をオフにします。次に、連続した4-0縫合糸で皮膚を縫合する。縫合糸の感染や噛み付きから保護するために消毒スプレーを投与します。深部麻酔の場合、心エコー検査または心臓の測定の前に、1キログラム体重当たり4ミリグラムのキシラジンと1キログラム体重当たり100ミリグラムのケタミンを投与する。心エコー検査の場合、ラットを加熱トレイの上の位置に置き、乳頭筋のレベルで左心室腔の寄尾骨短軸図を得る。次に、左心室駆出率と形態を測定するためにMモード心エコー検査を行う。臓器を収穫するために、静脈内ヘパリン注射を行う。その後、メスを使用してキシフォイドの下で皮膚切開を行い、はさみで両側の肋骨に平行に伸ばします。前腋窩線のリブを切り、シフォイドをつかんで胸を持ち上げます。2組の鉗子で組織を慎重に破裂させることにより、解剖学的または線維組織の接着を除去する。5ミリリットルの注射器で静脈から血液サンプルを採取する。次に、入口および出口レベルで心臓全体の切除を行う。氷冷クレブス-ヘンセライトバッファーに心臓を浸し、大オルタをカニューララットすることによって赤血球透過孤立した心臓システムにマウントします。ランゲンドルフ モードから開始します。そして、15分後、ワーキングハートモードに切り替えます。肺静脈を介して左心房をカンニュレートします。次に、左心房への灌流と左心の生理学的血流をもたらす心房カニューレを閉塞するクリップを開くことによって流れ方向を変える。作業心臓モードで20分間の血行力学的測定を記録し、2ミリリットルの注射器で冠動脈の血滴を収集し、5分ごとに冠状動脈の流れを測定する。プローブで左心房流と大動脈流の連続測定を行います。必要に応じて、大動脈弁を介して逆行して左心室に高忠実度カテーテルを挿入し、左心室収縮期圧を測定します。テキスト原稿に記載されているように、脳卒中のボリュームと外部心臓の仕事を計算して分析を終了します。組織学的切り傷および汚れは、手順の再現性を証明するために行われた。MIRおよび治療動物における線維性瘢痕は、恥動物群とMIR群間の線維化の差が有意であった一方で、偽動物の瘢痕形成と同等であった。さらに、MIRおよび遠隔虚血性コンディショニング処理動物は、MIR処理動物と比較して線維症が有意に低下した。インビボエカグラフィーは、駆出率、LV末端拡張期および終期収縮期の直径を測定するために使用された。分析は、MIR治療による心機能の有意な低下を示したが、血行力学的パラメータは、RIPercによって保存された。EX vivo血行力学データは、MIR群がLV収縮期圧、心拍出量、脳卒中容積、および外部心臓作業において有意な減少を示したため、手順の有効性を示した。この手順を試みる際には、閉塞した縫合糸の適切な位置付けと、単離された心臓装置への心臓の取り付けが、再現性のある結果を得る可能性が著しく高くなることを覚えておくことが重要です。急性または慢性の器具を通じて、あるいは心エコー検査またはMRIによって非侵襲的に、無傷の動物の心機能を評価する多くの方法があります。しかし、孤立した再生心臓は依然として顕著な調査ツールであり、ユニークな利点の全体の配列を提供しています。

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Research

JoVE Journal

Medicine

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