Name: 植物組織の細胞壁におけるアラビノガラクタンタンパク質およびペクチンの蛍光免疫局在化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: 学ぶ植物組織におけるアラビノガラクタンタンパク質とペクチンの蛍光免疫局在化法。固定、包埋、切片、抗体検出の詳細プロトコルにより、細胞壁ポリマーの分布と存在を可視化し、植物生物学研究に応用可能です。

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著者らは、H2020-MSCA-RISE-2015およびSeedWheels FCT PTDC/BIA-FBT/27839/2017が資金を提供するEUプロジェクト690946'SexSeed'(性植物生殖–種子形成)から支援を受けた。AMPは、欧州連合(EU)のMSCA-IF-2016プロジェクト(No. 753328)から助成金を受けました。MCはFCT PhD助成金SFRH/BD/111781/2015から助成金を受けました。

1. サンプル調製:固定、脱水、LR-白埋め込み
<ol><li>固定と脱水 注: 固定プロセスは、サンプルを保存するために重要です。分子を架橋することで細胞代謝が停止し、細胞の完全性を確保し、分子拡散を防止する。固定剤および使用する濃度は、抗体と相互作用するために十分に露出した抗原を残して、その目的に合わせて調整されなければならない。以下のプロトコルは、グルタルアルデヒドのより強い効果と、パラホルムアルデヒドの軽度の固定能力を兼ね備えています。その比率はAMPおよび細胞壁成分に最適化されたが、他のタンパク質および細胞構造に適している。その後の脱水処理により、LR-White埋め込み用サンプルが準備されます。この実験では、いくつかの植物種の植物組織が使用された。 ケルカスバーサンプル は、フィールドで栽培された木から収集しました。 トリスリアの水中植物の サンプルは、ポーラ・ルトール(キューガーデンズ、ロンドン、英国)によって親切に私たちと共有されました。<ol>
<li>すべてのシロイヌナズナズ植物を直接土壌にまき、60%の相対湿度と18°Cで21°Cで16時間光の昼/夜のサイクルを持つ屋内成長施設で成長します。 分析する植物組織を選択し、サンプルを16mm2以下のサイズにトリミングします。</li>
		<li>十分な冷たい固定液溶液(2%ホルムアルデヒド(w/v)、2.5%グルタルアルデヒド(w/v)、25 mM PIPES pH 7および0.001%Tween-20(v/v))で満たされたガラスバイアルにサンプルを直ちに移して、サンプルを完全に水没させます(図1A)。 注意: ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドは、吸入および接触によって有害であり得る固定剤である。ヒュームフードの固定ステップを実行し、適切な防護服とニトリル手袋を着用してください。アルコールシリーズから70%までのこのステップ以降のすべてのソリューションは、後で専門スタッフによる除染のために保管する必要があります。</li>
		<li>すべてのサンプルを収集した後、固定を更新します。</li>
		<li>バイアルを真空チャンバーに移し、ゆっくりと真空を適用します。60 kPaに達すると、浮遊材料はバイアルの底部に沈み始めます(図1B)。</li>
		<li>室温で2時間-80 kPa以下の真空下に保管してください。</li>
		<li>真空をゆっくり解放し、ガラスバイアルを密封し、4°Cで一晩置きます。</li>
		<li>夜間固定中にシンクされなかったサンプルを破棄します。残りのサンプルを25 mM PBS pH 7で10分間洗浄し、続いて25 mM PIPESバッファpH 7.2で20分洗浄します。</li>
		<li>エタノール系列(25%、35%、50%、70%、80%、90%、および3x100%エタノール)でサンプルを脱水し、それぞれ20分間乾燥させます。脱水サンプルを埋め込み用にラベル付きガラスバイアルに直ちに移す(図1C)。 注:脱水プロセスは、70%エタノールステップで一時停止することができます。</li>
	</ol></li>
	<li>LR-ホワイト樹脂埋め込み 注:LR-whiteは、低粘度の非疎水性アクリル樹脂であり、多くの厚い細胞壁層を持つ組織を貫通するのに理想的です。LR-Whiteはまたほとんどの植物のサンプルを切ることのための互換性があるいくつかの硬度の等級入って来。使用樹脂に適切な触媒が混入していることを確認するか、サプライヤーの指示に従って樹脂を準備してください。次の埋め込みプロセスは遅いですが、結果は手段を大いに正当化します。<ol>
<li>一連の三日単位の樹脂濃度(1:3、2:3、1:1、3:2、3:1、1:0)の一連の樹脂でLR-白樹脂をインキュベートし、各ステップで4°Cで24時間インキュベートします。 注意:LR-ホワイト樹脂は低毒性アクリル樹脂です。しかし、接触や吸入によって皮膚に刺激を与える可能性があります。換気の良い場所や、適切な保護用の着用とニトリル手袋を備えたヒュームフードの下での作業は強くお勧めします。</li>
		<li>LR-白色樹脂をリフレッシュし、4°Cでさらに12時間インキュベートします。</li>
		<li>適切なサイズの埋め込みゼラチンカプセル(サイズ1(0.5 mL)をサンプルに3mmまで、最大5 mmまたは3 x 0.3 mLまでのサンプルに対して2 x 0.37 mL、および紙タグ(図1D)を準備します。 注:試料を樹脂に完全に封じ込めることができるように、サンプルよりもわずかに大きいカプセルサイズを選択します。また、ペンや印刷されたインクは樹脂を汚染し、サンプルを損なうので、タグに鉛筆でラベルを付けることを忘れないでください。</li>
		<li>各カプセルの底に新鮮なLR-白樹脂を1滴塗布します。</li>
		<li>各ゼラチンカプセルにサンプルを入れ、新鮮な樹脂で最大容量に充填します。カプセルキャップを置き、静かに押して密閉シールを形成します(図1E)。</li>
		<li>樹脂を58°Cで24〜48時間重合し、完全に硬化するまで重合します。</li>
		<li>サンプルは室温で保存します。 注:ポスト重合LR白色樹脂は不活性です。</li>
	</ol></li>
</ol>2. スライド準備
注:ガラススライドは、ほこり、グリース、その他の汚染物質を含まず、清潔でなければなりません。一部のサプライヤーは、スライドがくっつくのを防ぐために油と洗剤を使用するので、新しいスライドを清掃する必要があります。ポリL-リジンで処理しても、グリースや洗剤は、スライドへのセクション接着を妨げます。糸くずとほこりは標本の観測に影響を与え、実験を台無しにする可能性が非常に高い。反応ウェル付きのテフロンコーティングスライドは、このタスクに最適です。それらは現実的で再利用可能であり、必要な抗体溶液の量を劇的に減らす。適切な洗浄により、優れた品質の蛍光免疫局在化を非常に手頃なコストで実行できます。
<ol><li>
スライド洗浄
	<ol>
<li>スライドを染色ラックに入れ、洗浄液(0.1%SDS(w/v)、酢酸1%(v/v)、エタノール10%(v/v))で覆います。</li>
		<li>20分間軽度の攪拌を維持します。</li>
		<li>染色ラックを軽度の攪拌でddH2Oバスに10分間移します。4回繰り返します。</li>
		<li>100%エタノールに短時間浸漬する前にラックを慎重に排水し、スライドをほこりのない環境で乾燥させます。</li>
		<li>使用するまで保管してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ポリL-リジンコーティング(オプション) 注:小さなセクションは、通常、ガラスのスライドをきれいにするために非常によく固執します。この手順は、大きなセクション (>2 mm2)にのみ推奨されます。大きなセクションは折り目やしわになりがちで、お勧めできません。それにもかかわらず、必要に応じて、より大きな穴を持つ反応スライドを使用します。上記のように清掃し、次のように進めます。<ol>
<li>正方形のペトリ皿にきれいなスライドを置きます。ピペット0.001%ポリL-リジン溶液(w/v)は、オーバーフローすることなく、スライドの穴をカバーします。</li>
		<li>スライドは、閉じたペトリ皿で40°Cで一晩乾燥させてください。 注:コーティングされたスライドはすぐに使用する準備ができて、数ヶ月間、室温で、ほこりのない環境に保存することができます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. サンプルのトリミングと切り離し
<ol><li>
サンプルトリミング
	<ol>
<li>鋭利なカミソリの刃で、LR-Whiteブロックを実体顕微鏡でトリムして、試料の対象領域に対して頂点が垂直であるピラミッド型の構造を形成する(補足図1A)。 注:超ミクロトームの標本のホールダーはブロックをしっかり止める優秀な用具である。デバイスにユニバーサル試料ホルダーがない場合は、ラウンドブロックに最も適合したものを使用してください。</li>
		<li>余分な樹脂の細かいスライスをピラミッドの長軸に垂直に取り除くことによって、ピラミッド構造をトリムします。</li>
		<li>切断面を形成するサンプルに到達するまで進みます。切断面内では、ターゲットサンプルを台形で囲むのが理想的です。 メモ:樹脂ブロックは、スリット角度でさらにトリミングして、鋭い刃で断面表面積を小さくすることができます(図1F)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
半薄い切断 注:ガラスナイフ付きのミクロトームが使用されます。エピトープに結合する抗体の能力は、免疫標識反応の成功を条件とします。LR-White樹脂の親水性により、抗体と試料切片との接触が良好に認められます。薄いセクションは、セクションを見つけ、イメージングプロセスを支援するために使用されるかすかなカルコフルーター着色を提示します。後で適用される可能性のある他の汚れについても同じことが言えます。また、厚さが過ぎると、画像取得品質にも影響します。断面の厚さに対する優れた妥協点は、組織の特性に応じて、200〜700 nmの間で見つけることができます。超ミクロトームの標本ホルダーにしっかりとブロックを取り付けます。<ol>
<li>超ミクロトームを使用して、厚さが200~700nmの断面を作ります(図1G)。</li>
		<li>一部のセクションをガラススライド上のddH2Oドロップに移して、セクション領域を確認します。50°Cのホットプレートにスライドを置き、水が蒸発するまで置きます。30 sのセクションの上に1%ホウ酸溶液(w/v)に1%のトルイジンブルーO(w/v)の低下を置くステイン。すすいで顕微鏡で観察します。</li>
		<li>所望の構造を見つけると、クリーンな反応スライドの各ウェルにあらかじめ置かれたddH2Oの各ドロップに1つまたは2つのセクションを移します。</li>
		<li>各スライドを閉じた清潔な10cm平方シャーレに入れ、50°Cで乾燥させます。</li>
		<li>使用するまで、スライドをクリーンなアーカイブ ボックスに保存します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 免疫局在
注:蛍光免疫局在化手順は、2つの抗体の逐次使用に依存します。一次抗体は、特異的標的抗原に対して上昇する。二次抗体は、一次抗体に対して特異的に提起され、蛍光技術のために、フルオロフォア(この特定のプロトコルにおけるFITC)に結合される。一次抗体はサンプル中の標的抗原を検出するために使用され、二次抗体は、一次抗体の過剰を洗い流した後、サンプルに結合された一次抗体の位置をマークするために使用されます。制御はこのアッセイの重要な部分であり、観測の正確性を保証するために常に行われなければならない。スライド上の1つの井戸は、一次抗体治療がスキップされる陰性対照として予約されるべきであり、したがって、実験の最後に信号を観察してはならない。陽性のコントロールは、標識がすでに知られており、確実である抗体で1つをうまく治療することによって実験に含まれなければならない。陽性対照は、二次抗体の標識効果と反応条件を確認するために使用され、陰性対照は二次抗体特異性を試験する。
<ol><li>湿らせたペーパータオルをピペットチップボックスの底に置き、スズホイルで包んでインキュベーションチャンバーを準備します(補足図1B-1E)。スライドをインキュベーションチャンバーに設置します。</li>
	<li>ピペットはブロッキング溶液(1 M PBSで5%ノンファットドライミルク(w/v)の8mmウェルあたり50 μLの低下を、10分間インキュベートします。ブロッキング溶液を取り出し、PBSで2回10分間全てのウェルを洗います。</li>
	<li>一次抗体溶液を調製( 補足表1参照)、ブロッキング溶液中の1:5(v/v)抗体;8 mm 当たり約40 μLの推定値を作ります。 注: 抗体の濃度は、製造プロトコルに従って調整する必要があります。</li>
	<li>ddH2Oで5分間最終洗浄を行い、井戸を完全に乾燥させないでください。</li>
	<li>反応ウェルに対する一次抗体溶液をピペットする。コントロールウェルへのピペットブロッキング溶液。</li>
	<li>インキュベーションチャンバーを閉じ、室温で2時間放置し、続いて4°Cで一晩放置します。 2次抗体溶液を1%ブロッキング溶液(v/v)で調製し、1ウェルあたり約40μL。スズ箔で覆ったままにしておきなさい。</li>
	<li>PBSで10分間すべての井戸を2回洗浄し、続いてddH2O.で10分追加します。</li>
	<li>すべてのウェルに二次抗体溶液をピペットします。これからは、光からスライドを保護します。</li>
	<li>室温で暗闇の中で3〜4時間インキュベートします。</li>
	<li>PBSで10分間すべての井戸を2回洗い、続いてddH2Oで10分の別の洗浄を行います。</li>
	<li>各ウェルにカルコフルーア(1:10,000(w/v)蛍光明るい28の滴を適用します。洗浄せずに、各ウェルに取り付け媒体(材料表を参照)を適用し、カバースリップを配置します(図1H)。</li>
	<li>10x/0.45、20x/0.75、40x/0.95、100x/1.40レンズを搭載した蛍光顕微鏡で観察し、UV(カルコフルーター染色用)とFITCフィルターを使用して細胞壁と免疫局在を検出します(図1I)。UV の場合は励起/放出 (nm) 358/461、FITC の場合は 485/530 の波長を使用します。</li>
	<li>結果のより良い視覚化のために、両方の画像が ImageJ または類似の画像と重なっています。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは利益相反を宣言しない。

ここで説明する植物における蛍光免疫局在化法は、シームレスに簡単に説明する一方で、いくつかの小さなステップの成功に依存しています。最初のサンプル調製と固定です。この最初のステップでは、ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドの混合物が細胞成分の大部分を架橋するために使用されます。溶液中のホルムアルデヒドは、グルタルアルデヒドが強いより永続的な結合を提供しながら、軽度で可逆的な固定を提供します。2つの固定剤間のバランスは、適切な量の架橋を提供し、エピトープの曝露が一次抗体10と反応することを可能にする。固定ソリューションが正常に動作するためには、サンプルが小さくなければなりません。直径7mmを超える大きな構造物は、固定が非常に難しく、固定性浸透を確実にするために切り取る必要があります。
傷やストレスの後、一部の植物は、固定プロセスを妨害するホルムアルデヒドと反応する可能性のある暗い沈殿物を形成する大量のタンニンを分泌する。試料を氷の上に置き、曇りになるたびに固定液を交換することで、この効果を軽減できます。空気はまた、固定プロセスと後で樹脂の埋...

植物細胞壁は、多糖類と糖タンパク質から構成される複雑な構造です。細胞壁は、そのアーキテクチャ、組織および構成が細胞の種類、局在化、発達段階、外部および内部刺激によって異なる非常に動的な構造である 1.アラビノガラクタンタンパク質(AMP)およびペクチンは、植物細胞壁の重要な構成要素である。AGPは、高グリコシル化タンパク質およびペクチンは、その組成、量および構造が異なる植物の発生段階2、3、4の間に大きく変化するホモガラクチュロン多糖である。ASPおよびペクチン研究は、プログラムされた細胞死、無生物性ストレスへの応答、性植物の生殖、他の多くの間でのいくつかの植物プロセスへの関与を明らかにした5。これらの研究のほとんどは、免疫局在性研究から得られた情報から始まりました。
その複雑さを考えると、細胞壁の研究には多くの異なるツールが必要です。モノクローナル抗体(mAbs)を用いたグリカンエピトープの検出は、この構造に沿った多糖類および糖タンパク質分布を解決するための貴重なアプローチです。グリカンエピトープを検出するために利用可能なmAbsの大規模なコレクションがあり、各mAbの特異性は6と同様に継続的に改善されている。ここで説明する技術はすべての植物種に適用可能であり、より高価で複雑な技術を伴うかもしれない将来の研究の方向性を導くのに最適なツールです。
この技術では、特定の抗体は、FITC(フルオレセイン・イソチオシアネート)、TRITC(テトラメチルローダミン-5-(および6)-イソチオシアネート)またはいくつかのアレクサフルオール染料などの蛍光色素に化学的に結合されます。免疫蛍光は、蛍光顕微鏡下で直接観察することができるグリカンの明確かつ迅速な細胞内局在化を可能にするいくつかの利点を提供する。それは、高い特異的かつ感受性であり、試料の調製は、より少量で存在する場合であっても、抗原の自然な構造を効果的に保護することができるので。それは同じサンプルの複数の抗原の検出を可能にし、最も重要な、高品質および視覚的に美しい結果を提供する。蛍光免疫局在化研究によって提供される大きな力にもかかわらず、彼らはしばしば、手順の異なるステップの視覚化を可能にする詳細なプロトコルの欠如のために、実行し、実装することが困難であると考えられている。ここでは、この手法を実行する方法と高品質の画像を取得する方法について、いくつかの簡単なガイドラインを提供します。
ここで示すプロトコルの場合、サンプルはまず修正され、最も適切な固定を使用して埋め込む必要があります。時間がかかり、比較的面倒な技術と考えられていますが、植物試料の適切な固定と埋め込みは、免疫局在アッセイを成功させるための鍵です。この目的のために、最も通常はアルデヒドのような架橋固定剤を用いた化学固定である。架橋固定剤は、組織の分子間の化学的結合を確立し、サンプルを安定化し硬化させる。ホルムアルデヒドとグルタルアルデヒドは、架橋性固定剤であり、そして時々両方の固定剤の混合が7を使用する。ホルムアルデヒドは、組織の構造保存を大きくし、長期間にわたって、小さな組織の引き込みと免疫染色との互換性を提供します。グルタルアルデヒドは、ホルムアルデヒドと組み合わせて通常使用される、より強力で安定した固定剤です。グルタルアルデヒドの使用は、いくつかの自由なアルデヒド基を固定組織に導入し、非特異的標識を生成する可能性があるため、考慮しなければならないいくつかの欠点を有する。また、タンパク質と他の分子との架橋は、時折、抗体に対してアクセスできない標的エピトープをレンダリングする可能性があります。これを回避するには、固定の数量と期間を慎重に定義する必要があります。
固定後、サンプルは、セクションを得る前に硬化するために適切な樹脂に埋め込まれます。ロンドン樹脂(LR-白)アクリル樹脂は、免疫局在性試験に適した樹脂です。他の樹脂とは異なり、LR-Whiteは親水性であり、抗体が抗原に到達することを可能にし、それを容易にする治療を必要としない。LR-Whiteは低い自己蛍光を提供する利点もあり、免疫蛍光イメージング中のバックグラウンドノイズの低減を可能にする。
アルシアンブルー染色、トルイジンブルー染色、周期酸-シッフ(PAS)染色など、細胞壁の異なる成分を検出するために利用可能な多くの染色技術があります。これらのどれも免疫局在性分析の力を提供していません8.このアプローチは、グリカンの検出に大きな特異性を与え、細胞壁の構成と構造に関するより広大な情報を提供します。

<table><tbody><tr><td>25% (w/v) グルトアルデヒド</td><td>寒天 Scientific</td><td>AGR1010</td><td>aq. 溶液、メタノールフリー</td></tr><tr><td>8ウェル ガラス反応スライド</td><td>マリンフェルド</td><td>MARI1216750</td><td>他のブランドも使用可能</td></tr><tr><td>酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>抗ラット IgG (wole 分子)-GOAT で産生</td>された <td>Sigma-Aldrich</td><td>F6258</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ、24 mm x 50mm</td><td>マリンフェルド</td><td>MARI0100222</td><td>カバー スリップはすべての井戸を覆う必要があります。他のブランドを使用することもできます&nbsp;</td></tr><tr><td>ddH2O</td><td>na</td><td>無</td><td></td></tr><tr><td>水エタノール</td><td></td><td></td> na 蛍光<td></td></tr><tr><td>増白剤 28</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-6259</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチンカプセル</td><td>寒天科学</td><td>AGG29211</td><td>カプセルのサイズは、サンプルのサイズに合う必要があります。</td></tr><tr><td>ガラスバイアル</td><td>na</td><td>na</td><td>密封可能なシンプルで安価なガラスバイアルであれば、どれでも使用できます。バイアルは、使用後に96%エタノールで洗浄してLR-White残留物を除去し、再利用することができます。&nbsp;</td></tr><tr><td>LR-white 中グレード、埋め込み樹脂</td><td>寒天科学</td><td>AGR1281</td><td>LR-White にはいくつかの形態があります。中グレードはほとんどの組織に適切な切断サポートを提供しますが、硬い組織にはより硬いグレードの LR-white が推奨される場合があります。可能であれば、ポリメレーション活性剤(過酸化ベンゾイル)と混合済みの樹脂を使用し、そうでない場合は、供給業者の指示に従って樹脂を調製してください。</td></tr><tr><td>無脂肪粉ミルク</td><td>ネスル&eacute;</td><td>na</td><td>任意の無脂肪粉乳は、</td></tr><tr><td>オーブン</td><td>na</td><td>na</td><td>一般的な実験室オーブン</td></tr><tr><td>ペトリ皿、10 cm x 10 cm四方</td><td>na</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パイプ</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1851</td><td></td></tr><tr><td>ラットは、モノクローナル抗体</td><td>植物プローブを生成します</td><td></td><td>細胞壁の成分を認識するいくつかの抗体は、Complex Carbohydrate research center (CCRC、ジョージア大学USA)とPlant Probes(Paul Knox Cell Wall Lab、英国リーズ大学)の両方で入手可能です 。 、一般的に使用されるMABSの短いリストと、それらが購入できる場所 は、補足表1</td></tr>、<tr><td>カミソリの刃、</td><td>または</td><td></td><td>通常のカミソリの刃、</td></tr><tr><td>SDS</td><td>、シグマ-アルドリッチ</td><td>、L6026</td><td></td></tr>、<tr><td>トルイジン、ブルーオー</td><td>、寒天、科学</td><td>AGR1727</td><td></td></tr>、<tr><td>トゥイーン、20</td><td>、シグマ-アルドリッチ</td><td>、P9416</td><td></td></tr><tr><td>、ウルトラミクロトーム</td><td>に記載されています。ライカマイクロシステムズ</td><td>UC7</td><td></td></tr><tr><td>直立落射蛍光顕微鏡、UVおよびFITC蛍光フィルター付き</td>ライ<td>カマイクロシステム</td><td>DMLb</td><td></td></tr><tr><td>真空チャンバー</td><td>、</td><td></td><td></td></tr>真空<tr><td>ポンプ</td><td>、</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td>、<td>Vecta Labs、</td><td>T-1000</td><td>他の退色防止剤を使用することもできます。FITCおよび蛍光ブライトナー28との互換性を確認してください。(注:非商業的な代替品については、(Jonhson et al 198218を参照)25 mg/mLの1,4-ジアゾビシクロ-(2,2,2)オクタン(DABCO)を9:1(v / v)グリセロールに1xPBSに混合することにより、退色防止培地を作ることができます。希釈したHClでpHを8.6に調整します。</td></tr></tbody></table>

植物組織の細胞壁におけるアラビノガラクタンタンパク質およびペクチンの蛍光免疫局在化

Fluorescent Immunolocalization of Arabinogalactan Proteins and Pectins in the Cell Wall of Plant Tissues

植物の開発には、内部および外部刺激の両方に応答して、細胞壁の組成と構造の一定の調整が含まれます。細胞壁は、タンパク質、フェノール化合物および水と共にセルロースおよび非セルロース性多糖類で構成されています。細胞壁の90%は、多糖類(例えば、ペクチン)およびアラビノガラクタンタンパク質(AMP)で構成されています。植物組織学的セクションにおける特定のグリカンエピトープの蛍光免疫局在化は、壁多糖ネットワーク、構造および構成要素のリモデリングを明らかにする重要なツールであり続けています。
ここでは、植物組織中のAMPおよびペクチンからグリカンエピトープを検出するための最適化された蛍光免疫局在化手順を報告する。パラホルムアルデヒド/グルタルアルデヒド固定は、植物サンプルのLR-White埋め込みと一緒に使用され、組織構造および組成のより良い保存を可能にする。超ミクロトームで得られた埋め込みサンプルの薄い部分は、特定の抗体による免疫局在化に使用された。この手法は、大きな解像度、高い特異性、および同じサンプル内の複数のグリカンエピトープを検出する機会を提供します。この技術は、グリカンの細胞内局在化を可能にし、細胞壁に蓄積のレベルを検出します。また、発達過程におけるAGPおよびペクチン分布の時空間的パターンの決定も可能となる。このツールの使用は、最終的に研究の方向を導き、植物の特定の機能にグリカンをリンクすることができます。さらに、得られた情報は、生化学的および遺伝子発現研究を補完することができる。

実験が成功すると、二次抗体は特異的に明るい緑色の特定のエピトープの位置を一貫した方法で特定し、細胞、組織または器官の特定の発達段階で細胞壁組成物の特徴付けを可能にする。例えばLM6抗体は、1,5-アラビナン、開発中のケルカス・スバー ・アンテル(図2A)の細胞壁に豊富にラベルを付けているI型ラムノガラクチュランを有する化合物に対する高い親和性を有し、したがって、このタイプのペクチンが豊富であり、一次細胞壁組成物の一部であると結論付けることができる。JIM5は、典型的にはケルカス・スベル胚の根端に見られるほとんどエステル化されていないホモガラクトゥロン類に対する親和性を有し、器官の機械的特性を指定する(図2B)。キシログラクロナンは、細胞壁の緩みと関連するキシロースが豊富なペクチンの一種であり、退化細胞に見られる。この抗体LM8は、キシログラクトルナンを特異的に認識し、成熟器官において、ケルカス・シューバー・アグリイオン熟成の最終段階における胚乳細胞のような退行細胞ま...

このプロトコルは、アラビノガラクタンタンパク質およびペクチンの免疫局在化のための植物材料が固定され、親水性アクリル樹脂に埋め込まれ、切り離され、ガラススライドに取り付けられる方法を詳細に記述する。我々は、細胞壁関連エピトープが特定の抗体で検出されることを示す。

Plant development involves constant adjustments of the cell wall composition and structure in response to both internal and external stimuli. Cell walls ...

たった1つの実験からの情報量は膨大です。これらの細胞壁ポリマーの存在を検出し、それらが細胞や組織にどのように分布しているかを正確に知ることができ、その存在量を決定することさえできます。この方法は、分析したい種の植物組織のほとんどすべての種類に適用することができるように設計されています。植物組織における免疫局在化には多くの細心の注意を払った作業が必要であり、実際に何が起こるかを見ずに説明することは困難です。植物組織サンプルを採取する前に、ガラスバイアルに十分な冷たい固定液を充填して、すべてのサンプルを完全に水没させます。次に、分析する植物組織を選択し、サンプルを16平方ミリメートル以下のサイズにトリミングします。直ちにサンプルを固定液に浸します。グルタルアルデヒドとホルムアルデヒドはどちらも優れた固定剤ですが、どちらも危険であり、フローフードで取り扱う必要があります。バイアルを真空チャンバーに移し、ゆっくりと真空を適用します。圧力が負の60キロパスカルに達すると、バイアルの浮遊材料は底に沈み始めます。部屋の圧力は、負の80キロパスカル以下で維持します。沈むプロセスには最大 2 時間かかる場合があります。サンプルが真空チャンバーに2時間入った後、真空をゆっくりと放出する。ガラスバイアルを密封し、摂氏4度で一晩冷蔵します。一晩固定した後、バイアルの底に沈んでいないサンプルを捨てます。残りのサンプルを25ミリモルPBSで10分間洗浄し、25ミリモルパイプバッファーで20分間洗浄します。固定性がサンプルに浸透していない可能性が非常に高いため、すべてのフローティングサンプルを削除することは非常に重要です。エタノール系列でサンプルを脱水し、各エタノール濃度で20分間サンプルを浸漬する。サンプルを透過するには、エタノールにLR-白色樹脂の濃度を加え、1部の樹脂からエタノールの3部に添加します。各濃度で、摂氏4度で24時間インキュベートする。LR-白樹脂をフレッシュ樹脂に交換し、さらに12時間摂氏4度でインキュベートします。埋め込みゼラチンカプセルを用意し、サンプルを樹脂に完全に封入できるようにサンプルよりわずかに大きいカプセルを選択します。インクは樹脂を汚染するので、紙のタグに鉛筆のラベルを付けます。各カプセルの底に新鮮なLR-白樹脂を1滴塗布します。各カプセルにサンプルを入れ、カプセルを新鮮な樹脂で最大容量に充填します。カプセルにキャップを置き、軽く押して密封します。樹脂を重合するには、24~48時間程度硬化するまで58°Cでカプセルを硬化させます。LR-白樹脂からゼラチンカプセルを剥離した後、樹脂ブロックをステレオ顕微鏡の下に置きます。鋭利なカミソリの刃を使用して、LR-白いブロックをサンプルに対して45度の角度でトリミングします。サンプルを回転させ、90度の角度で2回目のカットを1回目にします。同じパターンで切断を続けて、ピラミッドの頂点を持つピラミッドをサンプルの対象領域の真上に形成し、切断面がサンプルに到達するまで長軸に垂直な細かいスライスを削除します。ターゲットサンプルは、理想的には台形で囲む必要があります。トリムされた樹脂ブロックを超ミクロトームに入れる。ナイフの端と樹脂ブロックの間の角度を調整します。200~700ナノメートルの厚さのブロックから切り取ります。ワイヤーループを使用して、サンプルされたセクションを慎重にマイクロトームから持ち上げます。ガラスのスライドの上に蒸留脱イオン水の滴にそれらを置きます。50°Cのホットプレートにスライドを置くことによって水を蒸発させ、その後、セクションに汚れの滴を追加します。30秒後、汚れをすすいで顕微鏡下でスライドを観察し、断面の一般的な状態を確認し、所望の植物構造が見えることを確認します。スライドの各ウェルに蒸留脱イオン水を一滴入れることで、きれいな反応スライドを準備します。1つまたは2つのサンプルセクションを水滴に移します。スライドを10センチメートルの正方形のペトリ皿に入れ、それを覆い、摂氏50度で乾燥させます。反応スライド用のインキュベーションチャンバーを準備するには、湿らせたペーパータオルをピペットチップボックスの下部に置き、箱をアルミホイルで包みます。箱からインキュベーションチャンバーにスライドを移します。各ウェルにブロッキング溶液のピペット50マイクロリットル。スライドを10分間インキュベートした後、ブロッキング溶液を取り出し、その後、すべてのウェルをPBSで2回、毎回10分間洗浄します。原稿に記載されている一次抗体溶液を調製した後、蒸留脱イオン水で井戸の最終洗浄を5分間行う。一次抗体溶液を反応ウェルにピペットし、次いでブロッキング溶液をコントロールウェルにピペットします。インキュベーションチャンバーを閉じます。室温で2時間放置し、摂氏4度で一晩冷蔵します。ブロッキング溶液中に2次抗体の1%溶液を調製する。井戸あたり約40マイクロリットルが必要になります。溶液をアルミホイルで覆います。反応スライドのウェルをPBSで2回、蒸留脱イオン水で1回洗浄し、毎回10分間洗浄します。ブロッキングソリューションやデポジットが井戸に残らないようにしてください。二次抗体溶液を全てのウェルにピペットします。室温で3〜4時間暗い場所でスライドをインキュベートします。繰り返しますが、反応スライドのウェルをPBSで2回、蒸留脱イオン水で1回洗浄し、各ウェルにカルコフルオールホワイトを1滴加えます。洗浄せずに、各ウェルに取り付け媒体の滴を追加し、カバースリップで各井戸をカバーします。蛍光顕微鏡を用いて反応スライドのサンプル切片を観察します。観察ごとに、UVフィルタを使用してカルコフルオールで染色された細胞壁とFITCフィルタを使用して免疫局在を検出します。結果をより見やすくするために、ImageJ または類似の画像解析プログラムを使用して、各 UV フィルタ イメージを対応する FITC フィルタ イメージとマージします。特定のエピトープの局在を特定することにより、このプロトコルは細胞壁組成の特性評価を可能にする。例えば、1、5-アラビナンは、現像したケルカスの細胞壁に豊富に存在する。ほとんどエステル化されたホモガラクチロンは、典型的には、器官の機械的特性を指定するケルカスベル胚の根先に見られる。キシログラクトルナンは、ケルカス・サウバー・ドングリ成熟の最終段階で、胚乳細胞などの変性細胞に見られる。JIM13またはJIM8によって認識されるAGPのエピトープは、シロイヌズナの微小生殖に関連する細胞株や、基底性の血管精子トリトーリア水没者の汚名状乳頭および微生物など、生殖に関連する構造に見られる。このプロトコルを実装する際のよくある誤りは、通常、検出して識別するのが簡単です。この場合、開く場合、または反応ウェルを乾燥させると、通常、二次抗体がスミアとして現れます。緑色のフルオロクロムの凝集体は、非結合一次抗体が適切に洗浄されない場合に形成されます。セクションの折り畳みまたは剥離は、通常、汚れたスライドまたは積極的な洗浄の使用による接着不良に関連しています。サンプルの準備も重要です。樹脂ブロックは、明らかに見える淡い黄色から明るい茶色のサンプルと亀裂のないはずです。非効率的に埋め込まれたサンプルは、粉末状の白い斑点または領域を示す。サンプルサイズを8ミリメートル以下に保つことは、固定溶液の浸透に不可欠です。不十分な固定サンプルは、濃い茶色またはほとんど黒で表示されます。温度が過大な場合、樹脂がサンプルの切り離しを行う原因となります。免疫局在化技術の使用は、いくつかの研究の方向性を開きます。細胞壁の生化学的分析などのより具体的な技術を続けたり、分子的アプローチに進むことさえできます。この技術によって得られる結果は、細胞壁の組成を理解するのに役立つ、単純な化学分析によって分析することは非常に困難な非常に複雑な構造である。

fluorescent-immunolocalization-arabinogalactan-proteins-pectins-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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植物組織の細胞壁におけるアラビノガラクタンタンパク質およびペクチンの蛍光免疫局在化

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