Name: 組織性腫瘍組織スライスにおけるリアルタイム薬物応答の測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 学ぶ 組織性腫瘍組織スライスを用いたリアルタイム薬物応答測定法。Vibratomeで切片を調製し、ルミネッセンスベースで生存率を評価。患者由来サンプルでの中高通量スクリーニングが可能で、前臨床薬物開発を加速する。

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この作品は、NIH/NCI[K22CA201229、P30CA015704]、シドニー・キンメル財団[キンメル・スカラー賞]、肺癌発見賞(LCD-505536)によって支えられました。乳がんPDX腫瘍を提供してくれたアラナ・ウェルム博士(ユタ大学)に感謝します。また、比較医学、フレッド・ハッチンソンがん研究センター(FHCRC)のスタッフ、PDXモデルのメンテナンス、グジュラルラボのメンバーの皆様に有益な議論をいただきたいです。N.N.Aは、FHCRCのJSPS海外研究フェローシップと学際的トレーニング助成金の支援を受けています。A.J.B.は、FHCRCの染色体代謝および癌トレーニング助成金によって支えられています。

すべてのマウス実験は、動物福祉法の実験動物のケアと使用のためのガイドと生物医学研究における動物のケアと使用のための国立衛生研究所ガイドラインの勧告に従って行われました。
1. 腫瘍組織スライスの調製
<ol><li>表1のレシピに続いて組織スライス培養(TSC)培地を準備する。0.45 μm真空フィルターユニットで媒体をフィルター処理して滅菌します。</li>
	<li>アリコート 250 μL の TSC 培地は、24 ウェルプレートの場合はウェルあたり、または 6 ウェルプレートの場合は 1 mL の培地です。使用するまで37°C、5%CO2加湿2インキュベーターにプレートを保管してください。 注:培地とサプリメントは、組織の種類と実験目標に応じて最適化することができます。培地の量は、培養挿入物の多孔膜を浸すのに十分であるべきである。膜のレベルを超えないようにしてください。中程度のレベルが低すぎる場合や高すぎる場合は、中音量を調整します。研究者が免疫調節薬を検査している場合は、IL-210で培地を補充することをお勧めします。</li>
	<li>マウス由来の腫瘍組織を用いる場合、推奨処置でマウスを安楽死させ、70%エタノールを散布してマウスの露出した皮膚を消毒し、無菌技術で腫瘍を解剖する。腫瘍組織を氷冷ハンクのバランス塩溶液(HBSS)を含むチューブに保存します。</li>
	<li>新鮮な患者の腫瘍組織を使用する場合は、短期的には氷冷HBSSに保管するか、またはウィスコンシン州の氷冷ベルツァー大学(UW)溶液で長期保存(最大24時間)で組織の生存率を維持します。 注:氷冷UW溶液で一晩出荷されたPDX組織からのスライスは正常に準備されました。</li>
	<li>腫瘍組織を氷冷HBSSを含む10cm培養プレートに移す。氷冷HBSSに沈めながら、メスで腫瘍を半分に切ります。6mmの直径の生検パンチを使用して腫瘍組織をシリンダーに形作り、片側をトリミングして平らな表面を作ります。使用するまで氷冷HBSSに組織を保管してください。 メモ:一般的に中心にあり、不透明で壊れやすい外観を持つ組織の壊死領域を含めないようにしてください。</li>
	<li>ビブラートを設定します。70%エタノールを使用してすべての機器を消毒します。アクリルガラスの蓋で覆われたビブラートメのバッファートレイをビブラートメ氷浴の中央に置きます。氷浴に氷を加え、冷却されたHBSSでバッファトレイを満たし、スライスしながらティッシュを冷たく保ちます。刃ホルダーにカミソリの刃を取り付けます。 注意:振動子を半滅菌環境に保つことは以前の実験に影響を与えませんが、可能であればバイオセーフティキャビネットの下にビブラートを保管することをお勧めします。</li>
	<li>歯付き鉗子を使用してHBSSから生検パンチ腫瘍組織を慎重に持ち上げ、糸くずのないペーパータオルで組織を手に入れ、余分な緩衝液を取り除きます。</li>
	<li>標本の版の上に医学等級のシアノアクリルの接着剤の滴を置き、この滴の上にティッシュを置く。接着剤を2~3分間エアドライし、プレートをバッファートレイに入れます。組織がバッファーに完全に浸漬されるまで、いくつかの HBSS を補います。 注:組織を直立した安定した位置に取り付けることは、均一に切断されたスライスを生成するために重要です。装着された組織が不安定な場合は、周囲の組織にさらに接着剤を追加して直立位置を保持するか、組織をアンロードし、底部を平らにしてもう一度接着します。弾性組織は、スライス中に押し込まれ、曲がりやすい傾向があり、その場合は長さが短く(&lt;5 mm)、複数の実行が適切です。非常に壊れやすい組織の場合、ペーパータオルは組織を破壊する可能性があります。この場合、組織は、いくつかの余分なHBSSを離れてウィックするためにプラスチック表面に配置することができます。</li>
	<li>ビブラートの設定を調整します。切断厚 = 250 μm、振幅 = 3.00 mm、スライス速度 = 0.01~0.25 mm/s、ブレード角度 = 15°~21°の設定が使用されます。 注: 組織の剛性に応じてスライス設定を最適化します。より柔らかいティッシュはより速い速度のより深い刃の角度によってより容易に切られる。刃角18°、切断速度は0.10~0.18mm/s、振幅3.00mmはマウス4T1およびPDX HCI010腫瘍に適しています。硬いティッシュはより速い刃の速度と切断することができる。</li>
	<li>ブレードの開始位置と終了位置を設定し、ステージの高さを調整します。ティッシュが均一に切断されるまで、数サイクルのスライスをカットするために連続モードで器具を実行します。</li>
	<li>組織をスライスし続けます。少量のHBSSバッファーと共に、幅の広いチップ転送ピペットを使用して、スライス全体を持ち上げるため、広いチップ転送ピペットを用いた培地で、少量のHBSSバッファーをセル培養インサートに移します。24ウェルプレートに挿入ごとに1つのスライスを置きます。6つのウェルプレート用のインサートは、複製アッセイ用に最大4枚のスライスを収容できます。 注:ティッシュスライスの最後の端がまだノーカットティッシュに取り付けられている場合は、ビブラートを停止し、組織スライスに触れたり突いたりすることなく、2組の細かい先端鉗子で組織スライスを分離します。別のカミソリの刃は、吊り下げ組織を除去するのに役立ちます。</li>
	<li>細かいチップ転送ピペットで余分なバッファーを取り除きます。</li>
	<li>刃が接着された組織の近くに達したら、器具を停止し、ステージを下げ、別のブレードで硬くなった組織を取り除き、新しい組織を取り付ける。十分なスライスが収集されるまでスライスを続けます。</li>
	<li>プレートを37°C、5%CO2に設定した加湿インキュベーターで培養2する。組織スライスは、細胞培養インサート上の空気液間相で培養される。組織スライスは、最初のスライス調製後24〜48時間の実験の準備ができています。長期栽培のために、2~3日ごとに培地交換を行う。</li>
</ol>2. 生存率測定
<ol><li>組織スライスの生存率測定のために、ルシファーゼとプロ基板の両方を含む発光ベースの生存率測定試薬と、メーカーの指示に従ってTSC培地中の1:1,000希釈で培地を交換します。試薬は、代謝されたプロ基板の生細胞の還元活性をルシフェリン11に測定する。各組織スライスの上に酵素-基質混合物の50 μLを移す。</li>
	<li>加湿式インキュベーターの内側に位置するオービタルシェーカーに穏やかな攪拌でインキュベートし、一晩で5%CO2で37°Cに設定します。</li>
	<li>発光信号は、マイクロプレートリーダーまたは24ウェルプレートで培養された組織用のインビボイメージング装置を使用して測定できます。6ウェルプレート上の複数の組織の個々の生存率を測定するには、in vivoイメージングシステムを使用する必要があります。<ol>
<li>マイクロプレートリーダーを使用する場合は、蓋を付けずにマイクロプレートをセットします。発光強度を測定できるマイクロプレートリーダーの任意のタイプは、実験に適している必要があります。読み取り時間 = 1 s、上から測定、ゲイン = 200の設定を使用しました。 メモ: 精度を高めるには、白壁のマイクロプレートを使用して実験を設定します。白壁、明確な底24の井戸の版はテストされた、そしてほとんどの場合、明確な井戸の版は結果を妥協しない。</li>
		<li>生体内イメージングシステムを使用して生存率を測定する場合は、プレートをステージの中央に置き、蓋を取り外します。Cでステージ設定のフィールドを持つ発光画像が続く通常の写真画像を取得し、自動露光時間、f-ストップ=1、被写体の高さ= 0.0cmのマイクロプレートとしての目標設定。</li>
		<li>in vivoイメージングシステムを伴うイメージングソフトウェアを使用して、発光強度を定量化します。各組織スライスの周囲に一貫した関心領域(ROI)を描きます。このプロトコルは、ROI として直径 1 cm の円を使用します (図 1を参照)。面積の総流束(p/s)を測定します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 組織スライスに対する薬物効果の評価
<ol><li>セクション2で説明したように、発光ベースの生存率測定試薬を用いて治療前のベースライン生存率を測定する。 注:いくつかの組織が他の組織と比較して有意に低い生存率を有する場合は、アッセイから組織を省略してください。</li>
	<li>ジメチルスルホキシド(DMSO)に薬剤を溶解し、ストック液を作ります。所望の濃度でTSCまたは他の培養培地(250 μLの培地を含む24ウェルプレートの場合は25μL/well)を用いて10倍の薬剤溶液を調製します。車両制御のために、DMSOの同等の容積を含む媒体を準備する。</li>
	<li>ウェルの底にある培養培地に10倍の薬物溶液を補充する。ピペットで混合し、組織の上に培地の50 μLを移します。 注:複数の組織スライスが利用可能な場合は、各条件の重複またはトリクエートをテストします。</li>
	<li>37°C、5%CO2、加湿インキュベーターで軌道シェーカーで穏やかな2揺れで一晩インキュベート。</li>
	<li>プレートをシェーカーから取り出し、37°C、5%CO2、加湿イン2キュベーターで静にインキュベートします。</li>
	<li>所望のタイムポイントで、マイクロプレートリーダーまたはインビボイメージングシステムを使用して組織からの発光強度を測定する。通常、薬物効果は1〜6日間の治療後に検出可能になる。 注:発光ベースの生存率試薬は、培養条件下で少なくとも3日間安定しています。しかし、組織の代謝活性に応じて、アッセイ中に基質が枯渇する場合がある。以前に高いシグナルを持つ組織で有意なシグナル低下が観察された場合は、すべてのウェルの基質を補完する。</li>
	<li>次の式を使用して、処理された腫瘍組織の残りの生存率を計算します。 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61036/61036eq1v2.jpg"> 治療された組織の生存率は、制御腫瘍組織のベースライン生存率および生存率シフトによって正規化される。</li>
</ol>

<ol><li>Klemm, F., Joyce, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+regulation+of+therapeutic+response+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental regulation of therapeutic response in cancer.</a> Trends in Cell Biology. 25 (4), 198-213 (2015).</li>
<li>Horvath, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+out+irrelevant+cell-based+models+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Screening out irrelevant cell-based models of disease.</a> Nature Reviews: Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).</li>
<li>Seruga, B., Ocana, A., Amir, E., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Failures+in+Phase+III%3A+Causes+and+Consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Failures in Phase III: Causes and Consequences.</a> Clinical Cancer Research. 21 (20), 4552-4560 (2015).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Nishida-Aoki, N., Gujral, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+approaches+to+study+cell-cell+interactions+in+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Emerging approaches to study cell-cell interactions in tumor microenvironment.</a> Oncotarget. 10 (7), 785-797 (2019).</li>
<li>van der Kuip, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+term+culture+of+breast+cancer+tissues+to+study+the+activity+of+the+anticancer+drug+taxol+in+an+intact+tumor+environment%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Short term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug taxol in an intact tumor environment.</a> BMC Cancer. 6, 86(2006).</li>
<li>Nagaraj, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+Analysis+of+Tumor+Slice+Explants+As+a+Prerequisite+for+Diagnostic+Testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment and Analysis of Tumor Slice Explants As a Prerequisite for Diagnostic Testing.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58569(2018).</li>
<li>Naipal, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+slice+culture+system+to+assess+drug+response+of+primary+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor slice culture system to assess drug response of primary breast cancer.</a> BMC Cancer. 16, 78(2016).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lived+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+slice+cultures+enable+precise+study+of+the+immune+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment.</a> Oncoimmunology. 6 (7), 1333210(2017).</li>
<li>Sivakumar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+tumor+slice+cultures+provide+a+versatile+platform+for+immuno-oncology+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoimmunology%22%5BJournal%5D)">Organotypic tumor slice cultures provide a versatile platform for immuno-oncology and drug discovery.</a> Oncoimmunology. 8 (12), 1670019(2019).</li>
<li>Duellman, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Cell+Viability+Assay+and+Use+in+Inhibitor+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Real-Time Cell Viability Assay and Use in Inhibitor Screening.</a> Assay and Drug Development Technologies. 13 (8), 456-465 (2015).</li>
<li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology%2C+growth%2C+metastasis+and+disease+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).</li>
<li>Lazaro, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment%2C+characterization%2C+and+long-term+maintenance+of+cultures+of+human+fetal+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Establishment, characterization, and long-term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes.</a> Hepatology. 38 (5), 1095-1106 (2003).</li>
<li>Chadwick, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Brain+Tumor%2FOrganotypic+Slice+Co-culture+System+for+Studying+Tumor+Microenvironment+and+Targeted+Drug+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Brain Tumor/Organotypic Slice Co-culture System for Studying Tumor Microenvironment and Targeted Drug Therapies.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53304(2015).</li>
<li>Parker, J. J., Lizarraga, M., Waziri, A., Foshay, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Human+Glioblastoma+Organotypic+Slice+Culture+Model+for+Study+of+Tumor+Cell+Migration+and+Patient-specific+Effects+of+Anti-Invasive+Drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53304(2017).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルでは、organotypic腫瘍組織スライスに関する定量的かつリアルタイムの薬物有効性研究のためのプラットフォームを実証する。組織スライス培養システムは、天然腫瘍微小環境の細胞異質性および生理学的特徴を捕捉することにより、従来の細胞ベースのin vitro法よりも明確な利点を提供する。このプラットフォームは、薬物有効性試験のスループットを高め、細胞培養研究と生体内実験のギャップを埋めるのに役立ちます。
正確で一貫した結果を得るためには、調製中の組織の損傷を最小限に抑えることが不可欠です。物理的な接触によって引き起こされる損傷を避けるために、ティッシュスライスは広い先端プラスチックピペットと処理されるべきである。培養培地の体積は、実験の間、組織スライスが空気と媒体の両方に接触できるように維持されなければならない。
培養培地は、組織の種類や実験目的に応じて最適化する必要があります。このプロトコルで使用されるTSC培地は、原発性肝細胞培養13のためにもともと開発された無血...

癌細胞は、周囲の間質組織の物理的および生化学的特性との相互作用がTMEを形成する。TMEは、腫瘍の増殖、転移、および治療1に対する腫瘍応答を調節することを刺激することができる。従来の前臨床薬開発では、薬剤候補は、典型的には、培養癌細胞株を用いて最初にスクリーニングされる、TME2を極度2に欠けているアッセイプラットフォームである。細胞ベースの事前スクリーニング段階における生理学的TMEの欠如は、腫瘍を持つ動物モデルにおける有効な薬剤の発見を制限し、開発の後期臨床段階で多くの有望な腫瘍学的薬剤の高い消耗率に寄与し得る3。
腫瘍薬物反応を調節する上でTMEの重要性にもかかわらず、実験的制約は、創薬および開発の初期段階におけるより生理学的に関連するシステムの適用を制限する。動物モデルまたは患者の腫瘍標本から腫瘍に対して何百もの治療薬をスクリーニングすることは現実的ではない。確かに、外科標本は様々な遺伝的背景を持つ希少な資源であり、動物モデルにおける何千もの候補分子をスクリーニングすることは、実験的規模、コスト、および動物福祉のために実現不可能である。
腫瘍組織スライス培養は、正確に切断され、薄い腫瘍切片がex vivoで培養され、薬物スクリーニングアッセイにおける生理学的TMEの限界に対処することができる。歴史的に、神経科学の分野は、脳組織4のためのスライス培養の開拓および広範な最適化を行った。近年、多くの研究は、細胞株由来腫瘍、自発的腫瘍モデル、患者由来の異種移植片(PDX)、および原発性患者腫瘍を含む様々なタイプの腫瘍組織からのスライスの調製を実証している。エクスビボ組織スライス培養は、生体内およびインビトロ培養5の両方から利益を統合する。腫瘍組織スライスは、無傷の組織アーキテクチャと可変細胞組成を保持し、TMEコンテキスト内の癌細胞の研究を可能にする。
このプロトコルは、薬物応答を評価するために、リアルタイムで高感度な生存アッセイと組み合わせたorganotypic腫瘍組織スライス培養システムを導入する。以前に導入されたプロトコルにおけるorganotypic型腫瘍組織スライスの薬物有効性試験は、蛍光色素の組み込み、免疫組織化学(IHC)、またはMTT((3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-2]-2,5ジフェニルテトラゾリウム臭化物)アッセイ6,7,6,7,8,9による細胞生存率の変化を測定することに依存している。8,9しかし、これらの方法はすべてエンドポイントアッセイであり、低感度、長い処理時間、複雑なデータ分析、狭い信号範囲、および高い実験誤差に苦しんでいます。当社の発光ベースの生細胞適合試薬は、事前処理と最小限の後処理なしで広い信号範囲と瞬時(〜5分)の測定を提供することにより、これらのアッセイを改善します。この試薬は高感度で、細胞培養培地に共存できるため、細胞生存率の連続的かつタイムコース測定が可能です。このアッセイシステムは、前臨床薬物開発における組織スライス上の薬剤候補のハイスループットスクリーニングに適用可能である。

<table><tbody><tr><td>10 cmディッシュ</td><td>コーニング</td><td>430293</td><td></td></tr><tr><td>24 ウェルディッシュ</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7524</td><td></td></tr><tr><td>4T1</td><td>ATCC</td><td>CRL-2539</td><td></td></tr><tr><td>直径 6 mm 生検パンチ</td><td>インテグラ ミルテックス</td><td>33-36</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960-5g</td><td>TSC 用ミディアム</td></tr><tr><td>Belzer UW 冷蔵ソルキューション (UW ソリューション)</td><td>Bridge to Life</td><td>500 mL</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Membrane Mix</td><td>Fisher scientific</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Corning</td><td>MT-25950CQC</td><td></td></tr><tr><td>Double Edge Stainless Steel Cutting</td><td>Blades TED PELLA</td><td>121-6</td><td></td></tr><tr><td>ドキソルビシン (塩酸塩)</td>ケイ<td>マンケミカル</td><td>15007</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>細い先端の鉗子</td><td>ROBOZ</td><td>RS-4974</td><td></td></tr><tr><td>細い先端の鉗子</td><td>ROBOZ</td><td>RS-4976</td><td></td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767-500g</td><td>TSC 中</td></tr><tr><td>HBSS カルシウム、マグネシウム、フェノールを含まない</td><td>Red Gibco</td><td>14-175-103</td><td></td></tr><tr><td>HCI010</td><td>Dr. Alana Welm,ユタ大学</td><td>乳がん PDX</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 緩衝液</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>TSC 培地</td></tr><tr><td>用 ITS + プレミックス</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>354352</td><td>TSC 培地用</td></tr><tr><td>IVIS スペクトラム</td><td>パーキンエルマー</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>ライカ VT1200S ビブラートム</td><td>ライカ</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Gibco</td><td>25030164</td><td>TSC培地</td></tr><tr><td>ミリセル細胞培養インサート用、12 mm、親水性PTFE、0.4 & micro;m</td><td>ミリポア</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>ミリセル細胞培養インサート、30 mm、親水性 PTFE、0.4 & micro;ミリ</td><td>ポア</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>ニコチンアミド</td>シ<td>グマ-Aldrich</td><td>N0636-500g</td><td>TSC媒体用</td></tr><tr><td>PELCO Pro CA44組織接着剤</td><td>TED PELLA</td><td>10033</td><td>グル</td></tr><tr><td>ーペン 連鎖球菌</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>フィッシャー科学</td><td>15140163</td><td>TSC媒体</td></tr><tr><td>用 RealTime-Glo MT 細胞生存率アッセイ</td><td>Promega</td><td>G9711</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス EGF</td><td>BioLegend</td><td>585608</td><td>TSC 中</td></tr><tr><td>RPMI1640</td>用 <td>Gibco</td><td>11875135</td><td></td></tr><tr><td>シングルエッジ工業用かみそりブレード</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>接着組織を除去するため</td></tr><tr><td>重炭酸</td>ナトリウム <td>コーニング 25-035-CI</td><td></td><td>TSC 中</td></tr>型<tr><td>ピルビン酸</td><td>ナトリウムフィッシャー用科学</td><td>BW13115E</td><td>TSC媒体</td></tr><tr><td>用 スタウロスポリン</td><td>サンタクルス バイオテクノロジー</td><td>sc-3510A</td><td></td></tr><tr><td>シナジー H4</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トゥース鉗子</td><td>ROBOZ</td><td>RS-5155</td><td></td></tr><tr><td>トランスファーピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-711-7M</td><td>ワイドチップ</td></tr><tr><td>トランスファーピペット</td><td>サムコサイエンティフィック</td><td>235</td><td>ファインチップ</td></tr><tr><td>ウィリアムズメディウムE、グルタミンなし</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック サイエンティ</td><td>フィック12551032</td><td>TSCミディアム用</td></tr></tbody></table>

組織性腫瘍組織スライスにおけるリアルタイム薬物応答の測定

Measuring Real-time Drug Response in Organotypic Tumor Tissue Slices

腫瘍組織は、癌細胞、浸潤免疫細胞、内皮細胞、線維芽細胞、および細胞外マトリックスから構成される。この複雑なミリューは、腫瘍微小環境(TME)を構成し、インビボまたは薬物応答ex vivoでの治療に対する応答を調節することができる。従来のがん創薬スクリーンは、単層で培養された細胞に対して行われ、TMEの影響を極めて欠けるシステムである。したがって、高感度かつハイスループットなアッセイを生理学的TMEと統合する実験システムは、前臨床創薬プロセスを強化する。ここでは、中高スループットの薬物スクリーニングのプラットフォームとして、エキビボ腫瘍組織スライス培養を紹介する。オルガノミピック組織スライス培養は、液体空気界面で多孔質膜の支持を得て維持される、正確に切断された薄い腫瘍切片を構成する。本プロトコルでは、患者由来異種移植片(PDX)モデルからマウス腫瘍および腫瘍から調製された組織スライスの調製および維持について説明する。薬物治療に応答して組織生存率の変化を評価するために、我々は生体適合性の発光ベースの生存率アッセイを活用し、組織中の生存細胞のリアルタイム、迅速かつ敏感な測定を可能にした。このプラットフォームを用いて、マルチキナーゼ阻害剤、スタウロスポリン、および細胞傷害剤であるドキソルビシンに対する組織スライスの用量依存応答を評価した。また、単一PDX腫瘍から調製した組織スライスに対して17の臨床および前臨床薬をスクリーニングすることにより、エキビボ薬理学用の組織スライスの適用を実証する。生理学的に関連性が高く、高感度で堅牢なex vivoスクリーニングプラットフォームは、前臨床腫瘍学の創薬と治療の意思決定を大幅に強化します。

ここで、マウス4T1乳房腫瘍組織および乳癌PDXモデルから調製された腫瘍組織スライスに対する複数の薬物有効性評価プロトコルである時間経過を示す、HCI01012を示す。我々は、いくつかのマウス由来腫瘍、PDX、および新鮮な患者腫瘍10からの組織スライスの準備に成功した。腫瘍組織製剤および薬物有効性試験の全体的なワークフローは、図1に記載されている。一般に、体積1,000~1,500mm3の単一バルク腫瘍から20~40個の組織3スライスを準備することができました。
生存率測定では、発光ベースの生細胞適合性生存率試薬を利用しました。マルチキナーゼ阻害剤の治療は、スタウロスポリンを、1μM濃度で4日間、DMSOコントロールで治療した腫瘍組織と比較して100倍のシグナル強度を低下させた(図2A)。4T1腫瘍から調製した組織スライスを、時折中型交換で少なくと...

我々は、組織性腫瘍組織スライスにおけるリアルタイム薬物応答を測定するためのプロトコルを導入する。ここで概説する実験戦略は、ex vivo条件下で臨床またはマウス腫瘍に由来する組織スライス上で中高スループットの薬物スクリーンを実施するためのプラットフォームを提供する。

Tumor tissues are composed of cancerous cells, infiltrated immune cells, endothelial cells, fibroblasts, and extracellular matrix. This complex milieu ...

当社のプロトコルは、他の分子分析方法と互換性があり、薬物がタクト組織スライスの生存率と中スループットスクリーニングのパフォーマンスにどのような影響を与えるかの評価を可能にします。この技術の主な利点は、非常に少ない前処理または後処理で、組織全体のスライスの生存率をリアルタイムで測定できることです。この技術は、患者の腫瘍組織サンプルから直接取得した薬剤候補または組織スライスを試験することによって、前臨床薬の開発および腫瘍学を加速する。当社のリアルタイム組織生存率評価法は非常に汎用性が高く、がん生物学、神経科学、発生生物学の研究に応用できます。タクト内の実行可能な組織スライスを準備することは、手順の成功の鍵です。中組成のビブラートーム設定は、組織の種類とハリに応じて調整する必要があります。腫瘍組織スライス取得の日に、アリコート250マイクロリットルの組織スライス培養培地をウェル当たり24ウェルプレートに入れ、各ウェルに1つの組織培養液を挿入する。その後、使用するまで5%の二酸化炭素を加湿した37°Cの加湿インキュベーターにプレートを置きます。腫瘍組織断片を取得するには、10センチメートル培養プレートに氷冷HBSSに腫瘍組織を沈め、メスを使用して組織を半分に切断する。6ミリメートルの生検パンチを使用して腫瘍組織のシリンダーを取得し、各シリンダーの一端をトリミングして平らな表面を作ります。新鮮な氷冷HBSSにティッシュピースを置き、ビブラートメをオンにします。すべての装置を70%エタノールで消毒し、アクリルガラスの蓋で覆われたビブラートメバッファートレイをビブラートメ氷浴の中央に置きます。お風呂に氷を加え、バッファトレイに冷たいHBSSを充填します。刃ホルダーにカミソリの刃をロードし、慎重に生検パンチ腫瘍サンプルを選択するために歯付き鉗子を使用します。標本の版に医学等級のシアノアクリル酸接着剤の滴を加える。余分なバッファーを取り除き、直立した安定した位置のドロップにティッシュのシリンダーを取り付けるために、糸くずのないペーパータオルの上にティッシュをダブ。空気乾燥の2〜3分後、プレートをバッファトレイに入れ、組織がバッファに完全に浸されるまで、さらにHBSSをトレイに追加します。その後、バイブロックにアイストレイとバッファートレイアセンブリを配置し、腕をロックすることにより、ビブラートメを組み立てます。ビブラートメ切断の厚さを250マイクロメートル、振幅を3ミリメートル、スライス速度を0.01~0.25ミリメートル/秒、ブレード角度を15~21度に設定します。ブレードの開始位置と終了位置を設定し、ステージの高さを調整します。ティッシュが均一に切断されるまで、数サイクルのスライスをカットするために連続モードで機器を実行します。広い先端移動Bipedを使用して、スライスと

measuring-real-time-drug-response-in-organotypic-tumor-tissue-slices

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

出典:Ciraku, L., et.alです。乳がんの脳転移性腫瘍の成長を研究し、標的とするためのex vivo Brain Sliceモデル。J. Vis. Exp.(2021).このビデオは、器官型マウス脳スライスにおけるルシフェラーゼ発現腫瘍細胞のイメージングを示しています。ルシフェリンを培地に添加し、プレートをin...

器官型マウス脳スライスにおける腫瘍増殖を評価するための生物発光イメージング

癌細胞との器官型脳切片の共培養は、脳組織の癌細胞浸潤の過程で蛍光だけでなく、明視野（ビデオ）顕微鏡によって形態学的変化を可視化することができます。このモデル系は、細胞の交換や補充的なアプローチを可能にし、操作及び分析を幅広く提供しています。...

器官型脳スライスと癌細胞の3Dスフェロイドとの共培養システム

多くの種類のヒト脳腫瘍は、脳内の特定の領域に局在しており、培養で成長するのが困難です。このプロトコルは、腫瘍微小環境の役割に対処し、器官型マウス脳スライスで増殖する蛍光初代脳腫瘍細胞を分析することにより、新しい薬物治療を調査します。...

腫瘍微小環境と標的薬物療法研究のための脳の腫瘍/器官スライス共培養系

神経膠芽腫（GBM）の現在のex vivoモデルは、ヒト腫瘍浸潤の生理学的に関連する研究のために最適化されていない。ここでは、我々は、新鮮なヒトGBM組織からの器官型スライス培養物の生成および維持のためのプロトコールを提示する。経時顕微鏡法および定量的細胞移動分析技術の説明が提供される。...

腫瘍細胞移動の研究および抗浸潤性薬物の患者特異的効果の研究のためのヒト神経膠芽腫の器官型スライス培養モデル

世代、栽培、マウス肺腫瘍由来の切片スライスの系統的解析の手段します。我々...

診断テストのための前提条件として外植体腫瘍スライスの樹立と解析

このプロトコルは、器官型スライス培養物(OTSC)の調製を説明しています。この技術により、無傷の多細胞組織の ex vivo...

原発性膵臓癌および転移における腫瘍微小環境の前臨床モデルとしての器官型スライス培養

このプロトコルは、中処理から高スループットのオルガノイド薬物スクリーニングのための半自動化された方法と、顕微鏡に依存しない自動画像分析ソフトウェアを説明し、マルチパラメトリックの単一オルガノイド薬物反応を定量化および視覚化して、腫瘍内の不均一性をキャプチャします。...

バルクおよび単一オルガノイド分析のための広視野生細胞イメージングを用いたマルチパラメトリック腫瘍オルガノイド薬物スクリーニング(英語)

腹膜表面に転移したヒトがんの産生、培養、可視化のためのプロトコルについて説明します。切除した腫瘍標本をビブラトームを使用して切断し、透過性インサートで培養して酸素化と生存率を高めた後、共焦点顕微鏡とフローサイトメトリーを使用したイメージングとダウンストリーム分析を行います。...

切除されたヒト腫瘍標本からの ex vivo 器官型偽粘液腫腹膜腫瘍スライスの培養とイメージング

患者由来の腫瘍オルガノイドは、基礎研究およびトランスレーショナル研究のための高度なモデルシステムです。この手法では、異なるオルガノイド表現型の同時速度論的評価のためのマルチプレックス蛍光生細胞イメージングの使用について詳しく説明します。...

がんの患者由来オルガノイドモデルにおける薬物反応のための多重化生細胞イメージング(英語)

低コヒーレンスホロトモグラフィーを使用したオルガノイドの高解像度、ラベルフリー、3次元イメージングのための段階的なプロトコルを提示します。このプロトコルは、オルガノイド培養の調製、画像取得、および計算画像解析を詳細に説明し、生きたオルガノイドの構造ダイナミクスと薬物応答のリアルタイムの視覚化を可能にします。...

低コヒーレンスホロトモグラフィーによる腸管オルガノイドのラベルフリー、高解像度3Dイメージングおよび機械学習解析

学ぶ 組織性腫瘍組織スライスを用いたリアルタイム薬物応答測定法。Vibratomeで切片を調製し、ルミネッセンスベースで生存率を評価。患者由来サンプルでの中高通量スクリーニングが可能で、前臨床薬物開発を加速する。

組織性腫瘍組織スライスにおけるリアルタイム薬物応答の測定

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