Name: 高分子群集を用いたヒト皮萎縮性瘢痕化のインビトロモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: 学ぶ高分子群集を用いたヒト皮膚線維芽細胞の培養法。in vivo環境を模倣した瘢痕組織モデルを構築し、細胞外基質の挙動と線維化疾患のメカニズム解明に貢献する革新的な手法を探索する。

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この研究は、シンガポール科学技術庁「SPF 2013/004:皮膚生物学基礎研究」と「熱帯地方創傷ケアイノベーション」IAF-PP/2017(HBMS)H17/01/01/a0/009からの資金提供によって支えられました。著者らは、ポーラ・ベニー博士とマイケル・ラグナート博士からの助言と支援を感謝しています。

1. 細胞培養
<ol><li>10%の胎児子牛血清(FCS)および1%v/vペニシリン/ストレプトマイシン溶液(P/S)を含むダルベックコの修飾イーグル培地(DMEM)の非病理学組織(hNSF)に由来するhHSFおよび正常な皮膚線維芽細胞を5%CO/95%のインキュベーターで37°Cで維持する2。</li>
	<li>適切な会社からFicoll 70、Ficoll 400、およびアスコルビン酸を購入してください。</li>
</ol>2. MMC肥大性瘢痕モデルの構築
<ol><li>hHSF または hNSF (50,000/well) を、各ウェルに 1 mL のメディアを含む 24 ウェルプレートにシードします。</li>
	<li>5%CO2で37°Cインキュベーターに入2れ、一晩放置します。</li>
	<li>MMC メディアを準備します。実験に必要な総容積に基づいて、Ficoll 70(18.75 mg/mL)、Ficoll 400(12.5 mg/mL)、アスコルビン酸(100 μM)を混合して10%のFCS/DMEM培地を製造します。</li>
	<li>混合物を37°Cの水浴に1時間入れて、群発を溶液中に分散させ、0.2 μmフィルターを使用してMMC培地を殺菌します。</li>
	<li>使用済みのメディアを吸引し、作りたてのMMCメディアに置き換えます。</li>
	<li>37°Cおよび5%CO2で6日間培養し、3日2ごとに培地を交換する。</li>
</ol>3. コラーゲンの全量の発現
<ol><li>シリウス赤溶液(0.1%w/v)を準備します。1 mLの酢酸で200mLの蒸留脱イオン水(ddH2 O)にダイレクトレッド80パウダー0.2gを溶解します。</li>
	<li>MMCメディアを吸引し、各井戸にシリウスレッド溶液の300 μLを追加します。37°Cで90分間インキュベートします。</li>
	<li>シリウスレッド溶液を水道水でそっとすすべし、プレートを一晩で空気乾燥させます。</li>
	<li>水酸化ナトリウム(0.1M)を各ウェルに200μL加えてシリウスレッド染色を抽出します。プレートを軌道シェーカーの上に5〜10分間置き、シリウスレッドの汚れを完全に抽出します。</li>
	<li>抽出したシリウスレッド染色の100 μLを96ウェル透明プレートに移し、マイクロプレートリーダーを使用して620nmで吸光度を測定します。</li>
</ol>4. コラーゲンI(免疫染色)の発現
<ol><li>200 μLのリン酸緩衝生理食塩分(PBS、pH = 7.35)を使用してウェルを洗浄します。</li>
	<li>4 °Cでメタノール(500μL/ウェル)を使用して10分間細胞を固定します。</li>
	<li>室温(RT)で30分間、3%のウシ血清アルブミンによる非特異的相互作用をブロックする。</li>
	<li>ブロッキング溶液を吸引し、200 μLの抗コラーゲンI抗体(10 μg/mL)をRTで90分間インキュベートします。</li>
	<li>一次抗体を吸引し、3倍をPBSでそれぞれ5分間洗浄します。</li>
	<li>200 μLのヤギ抗ウサギ-FITC二次抗体(1:400希釈)と4'6-ジミディノ-2-フェニリンドール(DAPI;1:2000希釈)をRTで30分間インキュベートし、アルミニウム箔でプレートを覆います。</li>
	<li>二次抗体とDAPIの両方を廃棄し、3xをPBSでそれぞれ5分間洗浄します。</li>
	<li>顕微鏡下で直接蛍光染色を可視化します。</li>
</ol>5. ウェスタンブロッティング
<ol><li>細胞をPBSで2倍洗います。</li>
	<li>各ウェルに40μLのライシスバッファーを加え、ピペットチップでセル層を削ります。このリシスバッファーには、RIPA バッファー、プロテアーゼ阻害剤カクテル (PIC)、2 mM バナデートナトリウム、および 10 mM フッ化ナトリウムが含まれています。</li>
	<li>タンパク質のライゼートをマイクロ遠心チューブに移し、製造業者の指示に従ってタンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度を測定する。</li>
	<li>各グループのタンパク質10 μgを4%~12%のビストリスタンパク質ゲルのウェルにロードします。ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を200Vで30分間実行します。</li>
	<li>90Vで90分間ウェスタンブロットを走らしてタンパク質をニトロセルロース膜に移し、ゲルとニトロセルロース膜との間に気泡が形成されないようにします。</li>
	<li>10 mLのブロッキングバッファーで膜をブロックします。</li>
	<li>一次抗体を一晩4°Cでインキュベートする。一次抗体は、抗コラーゲンI、抗コラーゲンIII、抗コラーゲンIV、抗αSMA、抗MMP-1、抗MMP-2、抗MMP-13、抗MMP-13、抗グリセアルデヒド3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)です。</li>
	<li>0.1%TBS-Tween 20(5分5分)で膜を洗浄します。TBS/Tween 20(1 L)には、50mLの1 Mトリス(pH = 7.4)、5M塩化ナトリウム30mL、Tween 20の1mL、およびddH2Oの920 mLが含まれています。</li>
	<li>1時間RTで適切な二次抗体を種とインキュベートする。</li>
	<li>ステップ5.8を繰り返し、イメージングシステムを用いて蛍光を可視化する。</li>
</ol>6. RT-PCR
<ol><li>RNA抽出アッセイキットに含まれる2-メルカプトエタノールと混合したリシスバッファーを使用して、RNA 全体を収集します。</li>
	<li>メーカーの指示に従ってRNAを浄化する17.</li>
	<li>マイクロボリューム分光光度計を用いてRNA濃度を測定します。</li>
	<li>メーカーの指示に従って、cDNA合成キットを使用して最初のストランドcDNA合成を実行します。</li>
	<li>RT-PCRオリゴヌクレオチドプライマーは、カスタム96ウェルプレートに提供(プレコーティング)される。カスタマイズされたプレートに10 μLのSYBRグリーンスーパーミックスを使用して、cDNAサンプルの100 ngを混合します。</li>
	<li>ddH 2 Oを使用して、総体積を20μL/wellに増やします。</li>
	<li>メーカーの指示に従ってサーマルサイクラーを使用してRT-PCRを実行します:15 sの98°Cで変性の40サイクル、60°Cで60°Cでアニーリング/延長60 s。RT-PCRでテストされる遺伝子には、COL1A1、COL3A1、ACTA2、ACTA2スマッド2、スマド3、スマッド4、スCOL3A1マッド7、IL1A、IL1B、IL6、IL8、MMP1、MMP2、MMP3、TGFB1、IL1BおよびVEGFが含まれます。 IL1A IL6 IL8 MMP1 MMP2 MMP3 TGFB1,</li>
</ol>

<ol><li>vander Veer, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+cellular+and+molecular+causes+of+hypertrophic+scar+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">Potential cellular and molecular causes of hypertrophic scar formation.</a> Burns. 35 (1), 15-29 (2009).</li>
<li>Linge, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophic+Scar+Cells+Fail+to+Undergo+a+Form+of+Apoptosis+Specific+to+Contractile+Collagen%5Bmdash%5DThe+Role+of+Tissue+Transglutaminase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Hypertrophic Scar Cells Fail to Undergo a Form of Apoptosis Specific to Contractile Collagen[mdash]The Role of Tissue Transglutaminase.</a> Journal of Investigative Dermatology. 125 (1), 72-82 (2005).</li>
<li>Penn, J. W., Grobbelaar, A. O., Rolfe, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+TGF-beta+family+in+wound+healing%2C+burns+and+scarring%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Burns+and+Trauma%22%5BJournal%5D)">The role of the TGF-beta family in wound healing, burns and scarring: a review.</a> International Journal of Burns and Trauma. 2 (1), 18-28 (2012).</li>
<li>Wang, X. Q., Kravchuk, O., Winterford, C., Kimble, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+correlation+of+in+vivo+burn+scar+contraction+with+the+level+of+alpha-smooth+muscle+actin+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Burns%22%5BJournal%5D)">The correlation of in vivo burn scar contraction with the level of alpha-smooth muscle actin expression.</a> Burns. 37 (8), 1367-1377 (2011).</li>
<li>Eitan, E., Zhang, S., Witwer, K. W., Mattson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle-depleted+fetal+bovine+and+human+sera+have+reduced+capacity+to+support+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle-depleted fetal bovine and human sera have reduced capacity to support cell growth.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26373(2015).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li>
<li>Kapalczynska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D+cell+cultures+-+a+comparison+of+different+types+of+cancer+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures.</a> Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).</li>
<li>Lareu, R. R., Arsianti, I., Subramhanya, H. K., Yanxian, P., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+enhancement+of+collagen+matrix+formation+and+crosslinking+for+applications+in+tissue+engineering%3A+a+preliminary+study%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">In vitro enhancement of collagen matrix formation and crosslinking for applications in tissue engineering: a preliminary study.</a> Tissue Engineering. 13 (2), 385-391 (2007).</li>
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<li>Chen, C., Loe, F., Blocki, A., Peng, Y., Raghunath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+macromolecular+crowding+to+enhance+extracellular+matrix+deposition+and+its+remodeling+in+vitro+for+tissue+engineering+and+cell-based+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Applying macromolecular crowding to enhance extracellular matrix deposition and its remodeling in vitro for tissue engineering and cell-based therapies.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 277-290 (2011).</li>
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<li>Chen, C. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Scar-in-a-Jar%3A+studying+potential+antifibrotic+compounds+from+the+epigenetic+to+extracellular+level+in+a+single+well%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The Scar-in-a-Jar: studying potential antifibrotic compounds from the epigenetic to extracellular level in a single well.</a> British Journal of Pharmacology. 158 (5), 1196-1209 (2009).</li>
<li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+%22macromolecular+crowding%22+in+vitro+to+investigate+the+naphthoquinones+shikonin%2C+naphthazarin+and+related+analogues+for+the+treatment+of+dermal+scars%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico-Biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">Application of "macromolecular crowding" in vitro to investigate the naphthoquinones shikonin, naphthazarin and related analogues for the treatment of dermal scars.</a> Chemico-Biological Interactions. 310, 108747(2019).</li>
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<li>Minton, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+Excluded+Volume+Interaction+between+an+Unfolded+Protein+and+Rigid+Macromolecular+Cosolutes%3A+Macromolecular+Crowding+and+Protein+Stability+Revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Models for Excluded Volume Interaction between an Unfolded Protein and Rigid Macromolecular Cosolutes: Macromolecular Crowding and Protein Stability Revisited.</a> Biophysical Journal. 88 (2), 971-985 (2005).</li>
<li>Ernst, O., Zor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linearization+of+the+bradford+protein+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Linearization of the bradford protein assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (38), e1918(2010).</li>
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<li>Xue, M., Jackson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+Matrix+Reorganization+During+Wound+Healing+and+Its+Impact+on+Abnormal+Scarring%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+wound+care+%28New+Rochelle%29%22%5BJournal%5D)">Extracellular Matrix Reorganization During Wound Healing and Its Impact on Abnormal Scarring.</a> Advances in wound care (New Rochelle). 4 (3), 119-136 (2015).</li>
<li>Rohani, M. G., Parks, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+remodeling+by+MMPs+during+wound+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Matrix remodeling by MMPs during wound repair.</a> Matrix Biology. 44-46, 113-121 (2015).</li>
<li>Ulrich, D., Ulrich, F., Unglaub, F., Piatkowski, A., Pallua, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+metalloproteinases+and+tissue+inhibitors+of+metalloproteinases+in+patients+with+different+types+of+scars+and+keloids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plastic%2C+Reconstructive+%26+Aesthetic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases in patients with different types of scars and keloids.</a> Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (6), 1015-1021 (2010).</li>
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<li>Rashid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+use+for+polyvinylpyrrolidone+as+a+macromolecular+crowder+for+enhanced+extracellular+matrix+deposition+and+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">Novel use for polyvinylpyrrolidone as a macromolecular crowder for enhanced extracellular matrix deposition and cell proliferation.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (12), 994-1002 (2014).</li>
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<li>Cigognini, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+crowding+meets+oxygen+tension+in+human+mesenchymal+stem+cell+culture+-+A+step+closer+to+physiologically+relevant+in+vitro+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Macromolecular crowding meets oxygen tension in human mesenchymal stem cell culture - A step closer to physiologically relevant in vitro organogenesis.</a> Scientific Reports. 6, 30746(2016).</li>
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<li>Fan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shikonin+reduces+TGF-beta1-induced+collagen+production+and+contraction+in+hypertrophic+scar-derived+human+skin+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Shikonin reduces TGF-beta1-induced collagen production and contraction in hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts.</a> International Journal of Molecular Medicine. 36 (4), 985-991 (2015).</li>
<li>Werner, S., Krieg, T., Smola, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocyte-Fibroblast+Interactions+in+Wound+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Keratinocyte-Fibroblast Interactions in Wound Healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 127 (5), 998-1008 (2007).</li>
</ol>

著者には利益相反はありません。

このプロトコルは、人間の皮瘢痕組織の改良された:scar-in-a-jar"in vitroモデルを最適化し、認証することを目的としています。これまでの研究では、ヒト肺線維芽細胞12、ヒト骨髄間葉幹細胞23、およびヒト真皮線維芽細胞23に対するMMC技術の応用が報告されており、デキストラン12、Ficoll12、および12PVP23を群集者として用いた。ここで報告された研究では、肥大性瘢痕由来のヒト皮膚線維芽細胞に関する以前に発表されたプロトコルは、群衆としてFicollまたはPVPで最適化された。
高分子群集の選択と濃度は、同等の結果を生み出さないため、重要なパラメータです。以前の研究では、PVP40(18%FVO)およびPVP360(54%FVO)が真皮線維芽細胞<sup class="xref...

瘢痕組織は、組織修復の終点を表す。しかし、多くの個人、特に火傷や外傷1に苦しむ人では、瘢痕化が過剰であり、治癒した皮膚の形態および機能に望ましくない影響を及ぼす可能性がある。病理的(肥大性瘢痕およびケロイド)瘢痕形成の正確なメカニズムは十分には理解されていないが、創傷治癒時のコラーゲンの過剰な沈着が必須の寄与である2であることが実証された。
成長因子β1(TGF-β1)とα平滑筋アクチン(αSMA)の変換が肥大性瘢痕の形成において重要な役割を果たすのは十分に確立されている。証拠は、上昇したTGF-β1がSMADシグナル伝達経路3を調節することによってコラーゲンの過剰な沈着を直接刺激することを示唆している。また、αSMAは創傷治癒過程4において細胞収縮や再形成を調節することにより肥大性瘢痕形成に寄与することが分かった。インビトロおよびインビボモデルの適切な欠如は、瘢痕修復のための介入および治療法の開発と評価に対する大きな障害である。本研究の目的は、既存のMMC技術を利用して、新たな瘢痕関連の介入を評価するのに適した「生体内に似た」肥大性瘢痕モデルを構築することである。
体外の生体組織を再現する、科学界では何年もの間の目標となってきました。20世紀初頭のインビトロ技術の開発は、この目標を部分的に達成しました。現在のインビトロ技術は、胚細胞が暖かい生理食動物5で数日間生き残ることができるというルーの当初の実証からわずかに進化した。しかし、in vitroの方法論は、主に2次元で培養された単一細胞型に限定され、生体内の組織を正確に再現しない。細胞生化学、生理学、遺伝学を調べるのに役立ちますが、ネイティブ組織は3次元であり、複数の細胞タイプを組み込んでいます。単純な2次元インビトロシステムは、哺乳類細胞を、ネイティブの組織特異的なアーキテクチャが失われる高度に人工的な環境に供する6.これは細胞内および細胞外の事象に影響を及ぼし、細胞の形態、生理学、および行動7に異常をもたらす。
このプロトコルの背後にある関心は、肥大性瘢痕およびケロイドの開発および臨床管理にある。皮膚線維芽細胞が瘢痕組織に存在するコラーゲンの豊富な産生を主に担うことは定評があるが、2次元インビトロ系を用いて皮膚線維芽細胞を培養することは、生体内8で観察されたコラーゲンのターンオーバーを再現することができない。現代のインビトロ法は、生きている組織とは全く異なる環境である「温かい生理学」を依然として本質的に使用しています。生体内の組織は非常に混雑しており、タンパク質、核酸、リボヌクレオタンパク質、多糖類が総容積の5~40%を占めています。2つの分子が同時に同じ空間を占有することはできないので、利用可能な空きスペースはほとんどなく、水のほとんど完全な欠如9。
MMC技術は、細胞質ゾルおよび間質流体の熱力学的特性に影響を与える制約を課す。分子相互作用、受容体リガンドシグナル伝達複合体、酵素、およびオルガネラは、閉じ込められ、自由に相互作用することから制限される9.細胞内環境(すなわち、インタースティジウム)内の相互作用もまた制約される。最近の証拠は、混和溶液中の高濃度の不活性高分子が拡散を摂動し、物理的な関連、粘度および流体力学的特性10を摂動することを確認している。
興味深いことに、いくつかの一般的な混雑剤(すなわち、フィコール、デキストラン、ポリビニルピロリドン[PVP]、および4-スチレンスルホン酸ナトリウム[PSS])は、異なる細胞タイプおよび異なる設定に適用すると同等ではない。ある以前の研究では、FicollはPVPと比較して間葉系幹細胞の細胞毒性が低いことが報告されました。これらの結果は、その中性電荷と比較的小さい流体力学的半径11の結果であると解釈された。対照的に、第2の研究は、dextranがFicoll12と比較してヒト肺線維芽細胞によるコラーゲンI沈着を刺激するのにより効果的であることを発見した。我々自身の研究からのデータは、Ficollが肥大性瘢痕由来線維芽細胞によるコラーゲン沈着を増強するのに対し、PVPはこれらの細胞13に対して毒性があることを示唆している。
インビボ環境14では非常に混雑している間にコラーゲンへのプロコラーゲンの変換が速く、希釈された2次元培養系15では生物学的反応速度が遅れることが実証されている。ここでは、MMCを組み込んで、真皮線維症および瘢痕形成のより「インビボ様」モデルとしての役割を果たすように、in vitroプロトコルを最適化しました。一般的な2次元培養系とは対照的に、MMCでhHSFを栽培することは、コラーゲンの生合成および沈着を有意に刺激する13。特に、線維化の他の特徴(すなわち、マトリックスメタロプロテイナーゼ[MmPs]および炎症性サイトカインの発現の増加)も、この最適化されたMMCプロトコル13の下でも明らかである。この方法を用いて培養した場合、真皮細胞が生体内で測定した生理学的、生化学的、および機能的なパラメータを再現することが示される。
最適化されたMMC in vitroプロトコルは、肥大性瘢痕真皮および関係のない隣接する真皮から分離された真皮線維芽細胞によってコラーゲンおよび他のECMタンパク質の発現を評価するために使用されてきた。生体外のMMC環境で栽培した場合、hHSFが生体内の真皮肥大性瘢痕組織と同様に特定の特徴(すなわち、mRNA、生化学、生理学、および表現型)を発現することが観察されている。この証拠は、群集を選択し、体外栽培のためのMMC条件を最適化する際に、物理的および化学的特性が重要な考慮事項であることを示している。
原理の証明のために、MMCプロトコルは、シコニンとその類似体がアポトーシスを誘導する能力を定性的かつ定量的に評価するために、ここで適用される。これにより、真皮瘢痕13を管理するためのこれらの天然由来の伝統的な中国医学(TCM)化合物の潜在的な用途の評価が可能になる。それにもかかわらず、このインビトロMMCプロトコルのシンプルさ、費用対効果、適時性は、EU指令2010/63/EUおよび米国環境保護庁(EPA)による哺乳類の実験を排除するための最近の規制も満たしています。

<table><tbody><tr><td>0.2 &mu;m フィルター</td><td>ザルトリウス</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>P36962</td><td></td></tr><tr><td>アレクサフルオロ 680</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-21076</td><td></td></tr><tr><td>アレクサフルオッサー 800</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A-11371</td><td></td></tr><tr><td>α smooth muscle actin (&alpha;SMA) Primary antibody</td><td>Abcam</td><td>ab5694</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (thermal cycler) Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>4351106</td><td></td></tr><tr><td>Ascorビン酸</td><td>Wako</td><td>#013-12061</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>#A2153</td><td></td></tr><tr><td>Bradford protein assay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Collagen I 一次抗体 (免疫染色用)</td><td>Abcam</td><td>6308</td><td></td></tr><tr><td>Collagen I 一次抗体 (ウェスタンブロット用)</td><td>Abcam</td><td>ab21286</td><td></td></tr><tr><td>Collagen III 一次抗体</td><td>Abcam</td><td>ab7778</td><td></td></tr><tr><td>Collagen IV 一次抗体</td><td>Abcam</td><td>ab6586</td><td></td></tr><tr><td>Direct Red 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2610108</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)</td><td>Life Technologies</td><td>11996-065</td><td></td></tr><tr><td>子牛胎児血清 (FCS)</td><td>Life Technologies</td><td>6000-044</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>GE HealthCare</td><td>#17-0300-10</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 70</td><td>GE HealthCare</td><td>#17-0310-10</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH 一次抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ二次抗体</td><td>Abcam</td><td>ab97050</td><td></td></tr><tr><td>ヒト肥大型瘢痕/正常線維芽細胞 (hHSF/hNSF)</td><td>Cell Research Corporation</td><td>106, 107, 108</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>#1708890</td><td></td></tr><tr><td>MMP-1 一次抗体</td><td>Abcam</td><td>ab38929</td><td></td></tr><tr><td>MMP-13 一次抗体</td><td>Abcam</td><td>ab39012</td><td></td></tr><tr><td>MMP-2 一次抗体</td><td>Abcam</td><td>ab37150</td><td></td></tr><tr><td>MMP-9 一次抗体</td><td>Abcam</td><td>ab38898</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 微量分光光度計</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ニトロセルロースメンブレン</td><td>Bio-Rad</td><td>10484060</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>オデッセイブロッキング</td><td>バッファーLI-CORバイオサイエンス</td><td>927&ndash;40000</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Fc Imaging System</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX-81 HCS microscope (for immunotaining)</td><td>Olympus</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/streptomycin solution (P/S)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>PrimePCR Assays</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Customized Primeers pre-coated in 96-well plates based on requirement</td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル(PIC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>PVP 360</td><td>Sigma</td> <td>#PVP360</td><td></td></tr><tr><td>PVP 40</td><td>Sigma</td> <td>#PVP40</td><td></td></tr><tr><td>RIPAバッファー</td><td>Merck</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus Mini Kit</td><td>QIAGEN#</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>バナジン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>450022</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウムvanadate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M5 マルチモードマイクロプレートリーダー</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>SsoAdvanced universal SYBR green supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>#172-5270</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr></tbody></table>

高分子群集を用いたヒト皮萎縮性瘢痕化のインビトロモデル

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

生体内組織はタンパク質、核酸、リボヌクレオタンパク質、多糖類などによって非常に混雑することが示されています。次のプロトコルは、高分子群集(MMC)技術を適用して、体性ポリマー(群集機)をインビトロの細胞培養に添加することによってこの生理的混雑を模倣する。Ficollまたはデキストランをクラウダーとして使用した以前の研究は、MMC技術を使用してWI38およびWS-1細胞株におけるコラーゲンIおよびフィブロネクチンの発現が有意に増強されることを実証している。しかし、この技術は、一次肥大性瘢痕由来のヒト皮膚線維芽細胞(hHSF)において検証されていない。このプロトコルは、コラーゲンの過剰な沈着から肥大性瘢痕化が生じるため、hHSFを用いたMMC技術を適用することで、コラーゲンが豊富な体外肥肥性瘢痕モデルを構築することを目的としています。この最適化されたMMCモデルは、従来の2次元(2次元)細胞培養系と比較して、生体内瘢痕組織との類似性が高い点が示されている。さらに、動物モデルに比べて費用対効果が高く、時間効率が高く、倫理的に望ましいです。したがって、ここで報告される最適化モデルは、肥大性瘢痕関連研究のための高度な「生体内様」モデルを提供する。

各実験で三重サンプルを実施し、各実験を3人の個別の患者由来の細胞を用いて3倍ずつ繰り返した。データは、制御グループのパーセントで表されます。一方向の分散分析とTukeyの事後検定は、統計的差異を分析するために適用されました(*p 00.05)。
9%FVOでFicollを用いたMMC(分量占有率)は、hHSF13におけるコラーゲン及びコラーゲンI沈着の総13量を増強する。図1Aに示すように、hHSFの細胞密度は、PVPを用いた対照およびMMCと比較して9%および18%FVOでFicollで培養した後に有意に増加した。図1B,Cは、Ficoll(9%FVOで)他のMMC製剤と比較してコラーゲン(コラーゲンIを含む)の堆積を有意に増強したことを示す。定量分析(図1D,E)は、フ...

このプロトコルは、高分子群行の使用を用い、生体内条件に似たヒト肥大型瘢痕組織モデルを作成することを説明する。人間の皮膚線維芽細胞は、高分子環境で栽培すると、色型、生化学、生理学、および瘢痕組織に似た機能特性を示します。

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

高分子群集技術を用いて、細胞が生体内で経験する環境を模倣する個々のコラーゲン豊富なモデルを作成しました。皮膚は、私たちが既に体外で細胞を成長させるために使用している液体環境とは異なり、混雑した環境です。従来の単層細胞培養システムと比較して、このモデルは、細胞が生体内で経験する混雑した分子環境、特に豊富な細胞外マトリックスが液体水を置き換える瘢痕組織で再現する。肥大性瘢痕に加えて、この高分子群集化技術は、肺線維症などの細胞外マトリックスが豊富な研究に使用することができる。原稿の方向に従って瘢痕由来および正常な線維芽細胞を成長させる。その後、培地の1ミリリットルでウェルあたり50,000細胞で24ウェルプレートにそれらを播種します。プレートを摂氏37度と二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。10%FCS DMEMにFicoll 70、Ficoll 400およびアスコルビン酸を混合することによって高分子の混雑またはMMC培地を準備する。水浴でメディアをインキュベートし、群集を溶液中に分散させます。その後、0.2マイクロメートルのフィルターでそれを殺菌する。使用済みメディアを繊維芽細胞から吸引し、作りたてのMMCメディアに置き換えます。細胞を摂氏37度で6日間インキュベートし、3日ごとにMMC培地を交換します。1ミリリットルの酢酸で200ミリリットルの蒸留脱イオン水に0.2グラムのダイレクトレッド80粉末を溶解してシリウスレッド溶液を調製します。細胞からMMC培地を吸引し、各井戸に300マイクロリットルのシリウスレッド溶液を加える。その後、細胞を培養器に90分間戻します。インキュベーション後、シリウスレッド溶液を水道水でそっとすすべし、プレートを一晩空気乾燥させます。翌日、シリウスレッドを各井戸に200マイクロリットルの水酸化モルナトリウムを加え、プレートを5~10分間振って抽出します。抽出した汚れの100マイクロリットルを透明な96ウェルプレートに移し、マイクロプレートリーダーで620ナノメートルで吸光度を測定します。200マイクロリットルのPBSで各井戸を洗い、10分間摂氏4度でメタノールで細胞を固定します。その後、ウェルに3%BSAを加え、室温で30分間プレートをインキュベートします。ブロッキング溶液を吸引し、各ウェルに抗コラーゲン1抗体の200マイクロリットルを加えます。プレートを90分間インキュベートします。その後、抗体を吸引し、1回の洗浄につき5分間PBSでウェルを3回洗浄する。ヤギ抗ウサギ-FITC二次抗体とDAPIの200マイクロリットルを各ウェルに加えます。プレートをアルミホイルで覆い、室温で30分間インキュベートします。二次抗体とDAPIを捨て、PBSでの化しを繰り返します。次に、顕微鏡下で直接蛍光を可視化します。PBSで細胞を2回洗浄した後、各ウェルに40マイクロリットルの溶菌バッファーを加え、ピペットチップで細胞層を削ります。次に、タンパク質のリセートをマイクロ遠心分離チューブに移し、タンパク質濃度を測定します。4~12%のビストリスタンパク質ゲルの各ウェルに10マイクログラムのタンパク質をロードし、200ボルトでSDS-PAGEを30分間実行します。終了したら、90ボルトで90分のウェスタンブロットを走らせるとニトロセルロース膜にタンパク質を移し、ゲルと膜との間に泡が形成されないように注意する。10ミリリットルのブロッキングバッファーで膜をブロックします。その後、一次抗体を摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、膜を0.1%TBS Tween 20で5回洗浄します。次に、種に適した二次抗体を室温で1時間インキュベートします。このスミッシュを繰り返し、イメージングシステムで蛍光を可視化します。市販のRNA抽出キットでRNA全体を精製した後、マイクロ体積分光光度計を用いてRNA濃度を測定します。次に、cDNA合成キットを使用して、最初の鎖DNA合成を行います。CDNAをSYBRグリーンスーパーミックスの10マイクロリットルと混合し、オリゴヌクレオチドプライマーであらかじめコーティングされたカスタム96ウェルプレートにサンプルを移します。水で1ウェルあたり20マイクロリットルに総容量を調整し、原稿の指示に従ってRT-PCRを実行します。肥大型瘢痕由来ヒト皮膚線維芽細胞の細胞密度は、PVPまたは対照を用いた場合と比較して、Ficollで培養した後に有意に増加した。9%の分量占有率でFicollを用いた高分子群集は、コラーゲン1を含むコラーゲンの堆積を他の製剤と比較して有意に増強した。定量分析により、さらに実証された。MMC環境で栽培された瘢痕由来線維芽細胞および正常な皮膚線維芽細胞は、コラーゲンに加えてECM種の発現を調節することを発見した。特に、母体メタロプロテイナーゼまたはMMPの発現が、天然組織と比較して肥厚性瘢痕組織に蓄積することが判明した。MMP2,9,13の発現は、高分子混成条件で培養された両細胞培養において有意にアップレギュレーションされている事が観察された。MMPは創傷治癒と瘢痕形成の間に重要な役割を果たし、ECMアセンブリおよびリモデリングを調節する。インターロイキン6と血管内皮増殖因子の合成は、ウェスタンブロットでは検出できなかった。しかし、RT-PCR分析は、インターロイキン6の発現が有意にアップレギュレートされ、血管内皮増殖因子の発現はMMC条件で栽培された線維芽細胞でダウンレギュレートされたことを明らかにした。このプロトコルを試みるとき、非常に少ないCO病原体を有する真皮線維芽細胞を選択することは非常に重要である。また、アスコルビン酸はMMC培地に不可欠な成分であることを覚えておいてください。特に、このMMCモデルにおけるコラーゲンの析出とアライメントの検出に関心があります。このインビトロモデルを生体内の在来瘢痕組織と比較するために、高度な顕微鏡技術を使用する予定です。我々は、他の人が補助的なモーダル組織の体外の真正性を改善するために、この高分子群集技術を使用することを奨励する。もちろん、高分子群集は、インビトロで病気や病理のモデルを再計算するためにも使用できます。

in-vitro-model-human-cutaneous-hypertrophic-scarring-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

このプロトコルの目標は、自然な肌に似た3次元の全厚の皮膚等価物を構築することです。特別に構築された自動創傷装置により、無菌状態を維持しながら、正確で再現性のある創傷を生成することができます。...

三次元の全層皮膚等価物と自動傷つけ処理の発生

この論文の目標は、表皮のケラチノサイトと非活性化されたヒトの真皮から遺伝子組み換えヒトの器官型皮膚を生成する方法について、包括的かつ詳細なプロトコルを提供することです。...

失活ヒト真皮を用いて遺伝子組換え器官皮膚培養物の生成

我々は、高分子crowders（MMC）を使用して、細胞外マトリックスタンパク質に富む細胞由来のマトリックスを得るためのプロトコルを提示します。また、我々は、コンストラクトの成熟度を維持しながら、培養時間を減少させる3D器官型皮膚共培養世代でMMCを組み込むプロトコルを提示します。...

2Dと3Dの肌の改善<em&gt;インビトロ</em分子クラウディングの使用&gt;モデル

元のプロトコル vivo 角膜器官培養モデル創傷治癒の研究を説明に役立ちます。このモデル系は、再生治癒を促進するエージェントまたは整頓されていた 3 D...

前のヴィヴォ角膜器官培養モデルの創傷治癒の研究

このプロトコルは、再現性と堅牢な方法で三次元再構成ヒト表皮を栽培するための簡単な方法を記述する。さらに、表皮バリアモデルの構造機能関係を特徴付けます。炎症促進刺激の際に再構成されたヒト表皮の生物学的応答も提示される。...

3次元の再構築されたヒト表皮を大規模に育成

このプロトコルの目的は、長期的な培養のためのアクセス可能で簡単な技術を使用して、血管化されたヒトの皮膚同等物の生成および体積分析を記述することです。可能な限り、ステップの根拠は、研究者が研究ニーズに基づいてカスタマイズする能力を可能にするために記述されています。...

自己組み立て型血管化ヒト皮膚等価物の生成

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皮膚修復を正確に評価するヒトEx vivo創傷モデルと全山染色法

SCADアッセイを使用した瘢痕発生の可視化 - ex situ 皮膚瘢痕化アッセイ

ここでは、細胞培養ラボでの日常的な研究のためのさまざまな3Dスキンモデルを導入するための安価で簡単な手順を紹介します。研究者は、市販のモデルに頼ることなく、自分のニーズに合わせたモデルを作成することができます。...

2次元(2D)単一培養から3次元(3D)多文化まで、さまざまな用途に対応するスキンモデルの構築

このプロトコルでは、ヒト様の瘢痕化をシミュレートするための機械伝達シグナル伝達を増加させる肥大性瘢痕マウスモデルを確立する方法について説明します。この方法では、マウスの治癒切開部全体の機械的張力を高め、特殊なデバイスを使用して再現性のある過剰な瘢痕組織を作成し、詳細な組織学的およびバイオインフォマティクス分析を行います。...

メカノトランスダクション駆動型ヒト様肥厚性瘢痕のマウスモデル

このプロトコルは、皮膚の構造と機能を複製するために、平面の生理学的に関連する気液界面培養システムを使用して、ヒト人工多能性幹細胞から毛包を含む皮膚オルガノイドを製造する方法を概説します。...

気液界面培養システムを用いたヒト人工多能性幹細胞由来平面毛髪皮膚オルガノイドの作製

学ぶ高分子群集を用いたヒト皮膚線維芽細胞の培養法。in vivo環境を模倣した瘢痕組織モデルを構築し、細胞外基質の挙動と線維化疾患のメカニズム解明に貢献する革新的な手法を探索する。

高分子群集を用いたヒト皮萎縮性瘢痕化のインビトロモデル

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