高分子群集を用いたヒト皮萎縮性瘢痕化のインビトロモデル

高分子群集技術を用いて、細胞が生体内で経験する環境を模倣する個々のコラーゲン豊富なモデルを作成しました。皮膚は、私たちが既に体外で細胞を成長させるために使用している液体環境とは異なり、混雑した環境です。従来の単層細胞培養システムと比較して、このモデルは、細胞が生体内で経験する混雑した分子環境、特に豊富な細胞外マトリックスが液体水を置き換える瘢痕組織で再現する。

肥大性瘢痕に加えて、この高分子群集化技術は、肺線維症などの細胞外マトリックスが豊富な研究に使用することができる。原稿の方向に従って瘢痕由来および正常な線維芽細胞を成長させる。その後、培地の1ミリリットルでウェルあたり50,000細胞で24ウェルプレートにそれらを播種します。

プレートを摂氏37度と二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。10%FCS DMEMにFicoll 70、Ficoll 400およびアスコルビン酸を混合することによって高分子の混雑またはMMC培地を準備する。水浴でメディアをインキュベートし、群集を溶液中に分散させます。

その後、0.2マイクロメートルのフィルターでそれを殺菌する。使用済みメディアを繊維芽細胞から吸引し、作りたてのMMCメディアに置き換えます。細胞を摂氏37度で6日間インキュベートし、3日ごとにMMC培地を交換します。

1ミリリットルの酢酸で200ミリリットルの蒸留脱イオン水に0.2グラムのダイレクトレッド80粉末を溶解してシリウスレッド溶液を調製します。細胞からMMC培地を吸引し、各井戸に300マイクロリットルのシリウスレッド溶液を加える。その後、細胞を培養器に90分間戻します。

インキュベーション後、シリウスレッド溶液を水道水でそっとすすべし、プレートを一晩空気乾燥させます。翌日、シリウスレッドを各井戸に200マイクロリットルの水酸化モルナトリウムを加え、プレートを5~10分間振って抽出します。抽出した汚れの100マイクロリットルを透明な96ウェルプレートに移し、マイクロプレートリーダーで620ナノメートルで吸光度を測定します。

200マイクロリットルのPBSで各井戸を洗い、10分間摂氏4度でメタノールで細胞を固定します。その後、ウェルに3%BSAを加え、室温で30分間プレートをインキュベートします。ブロッキング溶液を吸引し、各ウェルに抗コラーゲン1抗体の200マイクロリットルを加えます。

プレートを90分間インキュベートします。その後、抗体を吸引し、1回の洗浄につき5分間PBSでウェルを3回洗浄する。ヤギ抗ウサギ-FITC二次抗体とDAPIの200マイクロリットルを各ウェルに加えます。

プレートをアルミホイルで覆い、室温で30分間インキュベートします。二次抗体とDAPIを捨て、PBSでの化しを繰り返します。次に、顕微鏡下で直接蛍光を可視化します。

PBSで細胞を2回洗浄した後、各ウェルに40マイクロリットルの溶菌バッファーを加え、ピペットチップで細胞層を削ります。次に、タンパク質のリセートをマイクロ遠心分離チューブに移し、タンパク質濃度を測定します。4~12%のビストリスタンパク質ゲルの各ウェルに10マイクログラムのタンパク質をロードし、200ボルトでSDS-PAGEを30分間実行します。

終了したら、90ボルトで90分のウェスタンブロットを走らせるとニトロセルロース膜にタンパク質を移し、ゲルと膜との間に泡が形成されないように注意する。10ミリリットルのブロッキングバッファーで膜をブロックします。その後、一次抗体を摂氏4度で一晩インキュベートします。

翌日、膜を0.1%TBS Tween 20で5回洗浄します。次に、種に適した二次抗体を室温で1時間インキュベートします。このスミッシュを繰り返し、イメージングシステムで蛍光を可視化します。

市販のRNA抽出キットでRNA全体を精製した後、マイクロ体積分光光度計を用いてRNA濃度を測定します。次に、cDNA合成キットを使用して、最初の鎖DNA合成を行います。CDNAをSYBRグリーンスーパーミックスの10マイクロリットルと混合し、オリゴヌクレオチドプライマーであらかじめコーティングされたカスタム96ウェルプレートにサンプルを移します。

水で1ウェルあたり20マイクロリットルに総容量を調整し、原稿の指示に従ってRT-PCRを実行します。肥大型瘢痕由来ヒト皮膚線維芽細胞の細胞密度は、PVPまたは対照を用いた場合と比較して、Ficollで培養した後に有意に増加した。9%の分量占有率でFicollを用いた高分子群集は、コラーゲン1を含むコラーゲンの堆積を他の製剤と比較して有意に増強した。

定量分析により、さらに実証された。MMC環境で栽培された瘢痕由来線維芽細胞および正常な皮膚線維芽細胞は、コラーゲンに加えてECM種の発現を調節することを発見した。特に、母体メタロプロテイナーゼまたはMMPの発現が、天然組織と比較して肥厚性瘢痕組織に蓄積することが判明した。

MMP2,9,13の発現は、高分子混成条件で培養された両細胞培養において有意にアップレギュレーションされている事が観察された。MMPは創傷治癒と瘢痕形成の間に重要な役割を果たし、ECMアセンブリおよびリモデリングを調節する。インターロイキン6と血管内皮増殖因子の合成は、ウェスタンブロットでは検出できなかった。

しかし、RT-PCR分析は、インターロイキン6の発現が有意にアップレギュレートされ、血管内皮増殖因子の発現はMMC条件で栽培された線維芽細胞でダウンレギュレートされたことを明らかにした。このプロトコルを試みるとき、非常に少ないCO病原体を有する真皮線維芽細胞を選択することは非常に重要である。また、アスコルビン酸はMMC培地に不可欠な成分であることを覚えておいてください。

特に、このMMCモデルにおけるコラーゲンの析出とアライメントの検出に関心があります。このインビトロモデルを生体内の在来瘢痕組織と比較するために、高度な顕微鏡技術を使用する予定です。我々は、他の人が補助的なモーダル組織の体外の真正性を改善するために、この高分子群集技術を使用することを奨励する。

もちろん、高分子群集は、インビトロで病気や病理のモデルを再計算するためにも使用できます。