Name: レポータータンパク質を発現する組換えロタウイルスを回収する簡略逆遺伝学法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 40 s
Description: 学ぶ簡略逆遺伝学法で蛍光レポータータンパク質を発現する組換えロタウイルスを回収する方法。BHKT7細胞とMA104細胞を用いた効率的なウイルス生成プロトコルで、ロタウイルス研究とワクチン開発に貢献します。

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この研究は、NIH助成金R03 AI131072とR21 AI144881、インディアナ大学スタートアップ資金、ローレンスM.ブラット基金によってサポートされました。私たちは、IUロタフージャー研究所、ウルリッヒ・デッセルベルガー、グイド・パパのメンバーに、逆遺伝学プロトコルの開発における多くの貢献と提案に感謝します。

<ol><li>Crawford, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Disease+Primers%22%5BJournal%5D)">Rotavirus infection.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).</li>
<li>Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+model+of+an+infectious+rotavirus+particle%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Atomic model of an infectious rotavirus particle.</a> The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).</li>
<li>International Committee on Taxonomy of Viruses. Taxonomic information. Virus taxonomy: 2018b release. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://talk.ictvonline.org/taxonomy">https://talk.ictvonline.org/taxonomy</a> (2019).</li>
<li>Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Parashar, U. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((World+Health+Organization-Coordinated+Global+Rotavirus+Surveillance+Network.+Global%2C+regional%2C+and+national+estimates+of+rotavirus+mortality+in+children+%3C5+years+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">World Health Organization-Coordinated Global Rotavirus Surveillance Network. Global, regional, and national estimates of rotavirus mortality in children <5 years of age.</a> Clinical Infectious Diseases. 62, Suppl 2 96-105 (2016).</li>
<li>Troeger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+vaccination+and+the+global+burden+of+rotavirus+diarrhea+among+children+younger+than+5+years%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Rotavirus vaccination and the global burden of rotavirus diarrhea among children younger than 5 years.</a> JAMA Pediatrics. 172 (10), 958-965 (2018).</li>
<li>Matthijnssens, J., Van Ranst, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotype+constellation+and+evolution+of+group+A+rotaviruses+infecting+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Genotype constellation and evolution of group A rotaviruses infecting humans.</a> Current Opinion in Virology. 2 (4), 426-433 (2012).</li>
<li>McDonald, S. M., Nelson, M. I., Turner, P. E., Patton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reassortment+in+segmented+RNA+viruses%3A+mechanisms+and+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Reassortment in segmented RNA viruses: mechanisms and outcomes.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (7), 448-460 (2016).</li>
<li>Patton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+diversity+and+evolution+in+the+post-vaccine+world%5BTitle%5D)+AND+%22Discovery+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rotavirus diversity and evolution in the post-vaccine world.</a> Discovery Medicine. 13 (68), 85-97 (2012).</li>
<li>Kanai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entirely+plasmid-based+reverse+genetics+system+for+rotaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Entirely plasmid-based reverse genetics system for rotaviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2349-2354 (2017).</li>
<li>Trask, S. D., McDonald, S. M., Patton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+coupling+of+virion+assembly+and+rotavirus+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the coupling of virion assembly and rotavirus replication.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (3), 165-177 (2012).</li>
<li>Guglielmi, K. M., McDonald, S. M., Patton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+intraparticle+synthesis+of+the+rotavirus+double-stranded+RNA+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanism of intraparticle synthesis of the rotavirus double-stranded RNA genome.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (24), 18123-18128 (2010).</li>
<li>Komoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+recombinant+rotaviruses+expressing+fluorescent+proteins+by+using+an+optimized+reverse+genetics+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Generation of recombinant rotaviruses expressing fluorescent proteins by using an optimized reverse genetics system.</a> Journal of Virology. 92 (13), 00588-00618 (2018).</li>
<li>Trask, S. D., Taraporewala, Z. F., Boehme, K. W., Dermody, T. S., Patton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+selection+mechanisms+drive+efficient+single-gene+reverse+genetics+for+rotavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dual selection mechanisms drive efficient single-gene reverse genetics for rotavirus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 18652-18657 (2010).</li>
<li>Fabbretti, E., Afrikanova, I., Vascotto, F., Burrone, O. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+non-structural+rotavirus+proteins%2C+NSP2+and+NSP5%2C+form+viroplasm-like+structures+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Two non-structural rotavirus proteins, NSP2 and NSP5, form viroplasm-like structures in vivo.</a> Journal of General Virology. 80, 333-339 (1999).</li>
<li>Eichwald, C., Rodriguez, J. F., Burrone, O. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+rotavirus+NSP2%2FNSP5+interactions+and+the+dynamics+of+viroplasm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of rotavirus NSP2/NSP5 interactions and the dynamics of viroplasm formation.</a> Journal of General Virology. 85, 625-634 (2004).</li>
<li>Kawagishi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+genetics+system+for+a+human+group+A+rotavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Reverse genetics system for a human group A rotavirus.</a> Journal of Virology. , (2019).</li>
<li>Komoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+infectious+recombinant+human+rotaviruses+from+just+11+cloned+cDNAs+encoding+the+rotavirus+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Generation of infectious recombinant human rotaviruses from just 11 cloned cDNAs encoding the rotavirus genome.</a> Journal of Virology. 93 (8), 02207-02218 (2019).</li>
<li>Mohanty, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+point+mutation+in+the+rhesus+rotavirus+VP4+protein+generated+through+a+rotavirus+reverse+genetics+system+attenuates+biliary+atresia+in+the+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">A point mutation in the rhesus rotavirus VP4 protein generated through a rotavirus reverse genetics system attenuates biliary atresia in the murine model.</a> Journal of Virology. 91 (15), 00510-00517 (2017).</li>
<li>Navarro, A., Trask, S. D., Patton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+genetically+stable+recombinant+rotaviruses+containing+novel+genome+rearrangements+and+heterologous+sequences+by+reverse+genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Generation of genetically stable recombinant rotaviruses containing novel genome rearrangements and heterologous sequences by reverse genetics.</a> Journal of Virology. 87, 6211-6220 (2013).</li>
<li>Duarte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotavirus+infection+alters+splicing+of+the+stress-related+transcription+factor+XBP1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Rotavirus infection alters splicing of the stress-related transcription factor XBP1.</a> Journal of Virology. 93 (5), 01739-01818 (2019).</li>
<li>Philip, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+recombinant+rotavirus+expressing+NSP3-UnaG+fusion+protein+by+a+simplified+reverse+genetics+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Generation of recombinant rotavirus expressing NSP3-UnaG fusion protein by a simplified reverse genetics system.</a> Journal of Virology. , 1616-1619 (2019).</li>
<li>Papa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+rotaviruses+rescued+by+reverse+genetics+reveal+the+role+of+NSP5+hyperphosphorylation+in+the+assembly+of+viral+factories%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Recombinant rotaviruses rescued by reverse genetics reveal the role of NSP5 hyperphosphorylation in the assembly of viral factories.</a> Journal of Virology. , (2019).</li>
<li>Komoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+genetics+system+demonstrates+that+rotavirus+nonstructural+protein+NSP6+is+not+essential+for+viral+replication+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Reverse genetics system demonstrates that rotavirus nonstructural protein NSP6 is not essential for viral replication in cell culture.</a> Journal of Virology. 91 (21), 00695-00717 (2017).</li>
<li>Philip, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collection+of+recombinant+rotaviruses+expressing+fluorescent+reporter+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+Resource+Announcements%22%5BJournal%5D)">Collection of recombinant rotaviruses expressing fluorescent reporter proteins.</a> Microbiology Resource Announcements. 8 (27), 00523-00619 (2019).</li>
<li>Kanai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+stable+rotavirus+reporter+expression+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Development of stable rotavirus reporter expression systems.</a> Journal of Virology. , 01774-01818 (2019).</li>
<li>Donnelly, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%27cleavage%27+activities+of+foot-and-mouth+disease+virus+2A+site-directed+mutants+and+naturally+occurring+%272A-like%27+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">The 'cleavage' activities of foot-and-mouth disease virus 2A site-directed mutants and naturally occurring '2A-like' sequences.</a> Journal of General Virology. 82, 1027-1041 (2001).</li>
<li>Kumagai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bilirubin-inducible+fluorescent+protein+from+eel+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A bilirubin-inducible fluorescent protein from eel muscle.</a> Cell. 153, 1602-1611 (2013).</li>
<li>Rodriguez, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+and+glowing+toolbox+of+fluorescent+and+photoactive+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42, 111-129 (2017).</li>
<li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+%28BRSV%29+from+cDNA%3A+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture%2C+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> Journal of Virology. 73, 251-259 (1999).</li>
<li>Centers for Disease Control and Prevention (CDC). <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biosafety+in+microbiological+and+biomedical+laboratories+%28BMBL%29%2C+5th+edition%22">Biosafety in microbiological and biomedical laboratories (BMBL), 5th edition</a>. , HHS publication no. CDC 21-1112 (2009).</li>
<li>Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing%2C+storage%2C+and+quantification+of+rotaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Culturing, storage, and quantification of rotaviruses.</a> Current Protocols in Microbiology. 15 (1), (2009).</li>
<li>Benureau, Y., Huet, J. C., Charpilienne, A., Poncet, D., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin+is+associated+with+the+rotavirus+capsid+and+is+activated+by+solubilization+of+outer+capsid+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Trypsin is associated with the rotavirus capsid and is activated by solubilization of outer capsid proteins.</a> Journal of General Virology. 86 (11), 3143-3151 (2005).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

我々の研究室では、組換えSA11ロタウイルスを産生するために本明細書に記載されている逆遺伝学プロトコルに日常的に依存しています。このアプローチでは、分子生物学の技術やロタウイルスの研究経験がほとんどない人は、最初の試みでも組み換えウイルスを回復します。このプロトコルに従って、外来タンパク質(例えば、FP)を発現するように再設計され、配列の追加、欠失、点突然変異を含むゲノムを含む100近くの組換えウイルスを生成しました。
このプロトコルで与えられた条件およびインキュベーション時間は、組換えウイルスの十分に成長株の回復に適用されます。遺伝子組み換えのために、低成長が予想される可能性があるSA11ウイルスを回復しようとする場合は、調整を考慮する必要があります。特に、BHK-T7/MA014細胞ライセートにトランスフェクトされたウイルスの価率が低い場合があるため、その後の増幅工程で接種物として使用されるリセートの量は通常2倍となる。さらに、増幅段階では、不十分なウイルスは、細胞の収穫に十分なレベルのCPEに達する前に、より長い時間のインキュベーションを必要とするかもしれません。実際、このよ...

ロタウイルスは、乳幼児の重度の胃腸炎の主な原因であり、他の多くの哺乳類および鳥類の若者1.レオビリダ科の一員として、ロタウイルスはセグメント化された二本鎖RNA(dsRNA)ゲノムを有する。ゲノムセグメントは、タンパク質2の3つの同心層から形成された非エンベロープ二面体のビリオン内に含まれている。ゲノムセグメントのシーケンシングと系統解析に基づいて、9種のロタウイルス(A-D、F-J)が定義されている。ロタウイルス種Aを含む株は、ヒト疾患4の大多数を担っている。過去10年間に始まった小児予防接種プログラムへのロタウイルスワクチンの導入は、ロタウイルスの死亡率および罹患率の有意な減少と相関している。最も顕著なのは、ロタウイルス関連の小児死亡率は、2000年の約528,000人から2016年には128,500人に減少した。,5ロタウイルスワクチンは、生きたウイルスの弱化株から処方され、生後6ヶ月までに小児に2〜3回投与される。ヒトおよび他の哺乳類種で循環する多数の遺伝的に多様なロタウイルス株は、突然変異および再分類を通じて急速に進化する能力と相まって、小児66、7、87,8に感染するロタウイルスの種類の抗原性変化を招く可能性がある。このような変化は、既存のワクチンの有効性を損ない、その交換または改変を必要とする可能性がある。
11個のロタウイルスゲノムセグメントの操作を可能にする完全プラスミドベースの逆遺伝学系の開発は、最近になってようやく達成された。これらのシステムの利用により、ロタウイルス複製および病因の分子詳細を解明し、抗ロタウイルス化合物の高スループットスクリーニング方法を開発し、ロタウイルスワクチンの新しい潜在的に効果的なクラスを作成することが可能になりました。ロタウイルス複製の間、制限されたウイルス(+)RNAは、ウイルスタンパク質の合成を導くだけでなく、子孫のdsRNAゲノムセグメント10、11,11の合成のためのテンプレートとしても役立つ。これまでに記載されたすべてのロタウイルス逆遺伝学系は、組換えウイルス9、12、13,の回収に使用されるcDNA由来(+)RNAの供給源として、T7転写ベクターを哺乳動物細胞株に9,トランスフェクションすることに依存している。13転写ベクター内では、フルレングスのウイルスcRNAは、ウイルス(+)RNAが本物の5'および3'末語を含むT7 RNAポリメラーゼによって合成されるような上流T7プロモーターと下流型肝炎デルタウイルス(HDV)リボザイムの間に位置付けられている(図1A)。第1世代逆遺伝学系では、T7RNAポリメラーゼ(BHK-T7)を11T7(pT7)転写ベクターで発現する赤ちゃんハムスター腎臓細胞をトランスフェクトすることにより組換えウイルスが作られた、 各各々は、シミアンSA11ウイルス株のユニークな(+)RNAの合成、及び3つのCMVプロモーター駆動発現プラスミド、1つはワクシニアウイルスD1R-D12Lキャッピング酵素複合体9のアビアンレオウイルスp10FAST融合タンパク質および2つのコード化サブユニットをコードする。トランスフェクトされたBHK-T7細胞で生成された組換えSA11ウイルスは、MA104細胞とのオーバーシードにより増幅され、ロタウイルス増殖に対する細胞株透過性である。第1世代リバース遺伝学系の改変版は、もはや支持プラスミド12を使用していないと述べてきた。代わりに、改変系は、11個のSA11 T7転写ベクターを用いてBHK-T7細胞をトランスフェクトするだけで組み換えロタウイルスを生成することに成功し、ウイルス工場(viroplasm)ビルディングブロック(非構造タンパク質NSP2およびNSP5)のベクターが他のベクターよりも3倍高いレベルで追加されるという14,警告がある。逆遺伝学システムの改変バージョンは、ロタウイルス16、17,17のヒトKUおよびオデリア株の回復をサポートするも開発されている。ロタウイルスゲノムは、逆遺伝学による操作に非常に適しており、VP418、NSP19、NSP219、NSP3,20、21、およびNSP520,2122、23に導入された変異を伴ってこれまでに生成された組換えウイルスを有する。23これまでに生成された最も有用なウイルスの中には、蛍光レポータータンパク質(F)9、12、21、24、2512,21,24,25を発現するように設計されたものがある。9
本稿では、我々の研究室で使用する逆遺伝学システムのプロトコルを提供し、SA11ロタウイルスの組換え株を生成する。我々のプロトコルの主な特徴は、BHK-T7細胞を11 pT7転写ベクター(pT7/NSP2SA11およびpT7/NSP5SA11ベクターの3倍のレベルを含むように改変した)およびアフリカの豚熱ウイルス(ASFV)NP868Rキャッピング酵素をコードするCMV発現ベクターである21(我々の手では、NP868Rプラスミドの存在は、トランスフェクトされたBHK-T7細胞による組換えウイルスのより高い強化剤の産生をもたらす。本稿では、セグメント7タンパク質産物NSP3だけでなく、別のFPを発現する組換えウイルスを生成できるよう、pT7/NSP3SA11プラスミドを改変するためのプロトコルも提供する。これは、pT7/NSP3SA11プラスミドのNSP3オープンリーディングフレーム(ORF)を再設計し、下流の2Aトランスレーショナルストップリスタート要素を含み、続いてFP ORF(図1B)24、26を含むことによって達成される。24このアプローチを通じて、UnaG(緑)、mKate(ファーレッド)、mRuby(赤)、タグBFP(青)、CFP(シアン)、YFP(黄色)24、27、28,27など、さまざまなFPを発現する組み換えロタウイルスを28生成しました。これらのFP発現ロタウイルスは、NSP3 ORFを削除することなく作られ、機能するウイルスタンパク質の完全な補完をコードすると予想されるウイルスを生み出す。

<table><tbody><tr><td>Baby Hamster Kidney - T7 RdRP (BHK-T7) 細胞</td><td></td><td></td><td>接触:</td></tr><tr><td>ubuchholz@niaid.nih.gov Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>45608105</td><td></td></tr><tr><td>Cellometer AutoT4 生存細胞カウンター</td><td>Nexcelom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP Gel Imaging System</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>MP</td><td>194002</td><td></td></tr><tr><td>クラリティ ウェスタンエンハンスド化学発光 (ECL) 基質</td><td>バイオ・ラッド</td><td>170-5060</td><td></td></tr><tr><td>大腸菌 DH5alpha バクテリア</td><td>Lucigen</td><td>60602-2</td><td></td></tr><tr><td>完全プロテアーゼ阻害剤</td><td>ピアス</td><td>A32965</td><td></td></tr><tr><td>ディスポーザブル トランスファー ピペット、超微細拡張チップ</td><td>MTC バイオ</td><td>P4113-11</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ モディファイド イーグル メディウム (DMEM)</td><td>ロンザ</td><td>12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Eagle's Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM)</td><td>Quality Biological</td><td>115-073-101</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, Absolute (200 proof)</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml)</td><td>Invitrogen</td><td>15585-011</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)、熱不活化</td><td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>Flag M2 抗体、マウスモノクローナル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit</td><td>Sigma</td><td>NA0200-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin (G-418)</td><td>Invitrogen</td><td>10131-027</td><td></td></tr><tr><td>Gibco FluroBrite DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>A1896701</td><td>DMEM with low background蛍光</td></tr><tr><td>Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM)</td><td>Gibco</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated</td><td>Cell-Signaling Technology</td><td>7074S</td><td></td></tr><tr><td>Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum</td><td>Patton lab</td><td>lot 55068</td><td></td></tr><tr><td>Guinea Pig Anti-VP6 Antierum</td><td>Patton lab</td><td>lot 53963</td><td></td></tr><tr><td>ウマ抗モルモットIgG、セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合</td><td>KPL</td><td>5220-0366</td><td></td></tr><tr><td>ウマ抗マウスIgG、セイヨウワサビエロキシダーゼ(HRP)結合</td><td>細胞シグナル技術</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>iNtRON バイオテクノロジー e-マイコマイコプラズマPCR検出キット</td><td>JH Science</td><td>25235</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール</td><td>マクロン</td><td>3032-02</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン溶液(100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Luria Agar Powder (Miller's LB Agar)</td><td>RPI 研究製品</td><td>L24020-2000.0</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199 (M199) 培養培地</td><td>Hyclone</td><td>Sh30253.01</td><td></td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium -Eagle Joklik's Forumation (SMEM)</td><td>Lonza</td><td>04-719Q</td><td></td></tr><tr><td>Monkey Kidney (MA104) Cells</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-2378.1</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One 分光光度計</td><td>ThermoScientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ニュートラルレッド溶液 (0.33%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N2889-100ml</td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸溶液 (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel</td><td>Invitrogen</td><td>XP00102BOX</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin ゲルおよび PCR クリーンアップキット</td><td>宝</td><td>740609.25</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM 還元血清培地</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>ペレット乳棒 (RNase-フリー、使い捨て)</td><td>Fisher</td><td>12-141-368</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン溶液、(100x ペン連鎖球菌)</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate緩衝生理食塩水 (PBS)、10x</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP399-20</td><td></td></tr><tr><td>ブタトリプシン、Type IX-S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0303</td><td></td></tr><tr><td>PureYield プラスミド Miniprep System</td><td>Promega</td><td>A1223</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12162</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen プラスミド Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep スピン ミニプレップキット</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>SA11 pT7転写ベクター</td><td>Addgene</td><td>89162-89172</td><td></td></tr><tr><td>SA11 pT7/NSP3 転写ベクター 蛍光タンパク質を</td><td></td><td></td>発現 <td>お問い合わせ:</td></tr><tr><td>jtpatton@iu.edu SeaKem LE アガロー</td>ス <td>ロンザ</td><td>50000</td><td>ゲル電気泳動用</td></tr><tr><td>SeaPlaque アガロース</td><td>ロンザ</td><td>50100</td><td>プラークアッセイ用</td></tr><tr><td>Superscript III One-Step RT-PCR kit</td><td>Invitrogen</td><td>12574-035</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>170-4270</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Llot Turbo Transfer System</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TransIT-LTI Transfection Reagent</td><td>Mirus</td><td>MIR2306</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0772</td><td></td></tr><tr><td>Triton X 100</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP151-500</td><td></td></tr><tr><td>Trizol RNA抽出試薬</td><td>Ambion</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Corning</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン(0.05%)-EDTA(0.1%) 細胞解離 溶液</td><td>品質 生物学的</td><td>118-087-721</td><td></td></tr><tr><td>トリプトースリン酸ブロス</td><td>Gibco</td><td>18050-039</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>VWR</td><td>0777-1L</td><td></td></tr><tr><td>Vertrel VF 溶剤</td><td>Zoro</td><td>G0707178</td><td></td></tr><tr><td>Zoe 蛍光ライブセルイメージャー</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

レポータータンパク質を発現する組換えロタウイルスを回収する簡略逆遺伝学法

Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins

ロタウイルスは、ヒトを含む多くの哺乳類および鳥類宿主種の若者に重度の胃腸炎を引き起こすセグメント化された二本鎖RNAウイルスの大規模で進化する集団である。近年のロタウイルス逆遺伝学システムの登場により、指向性変異誘発を用いてロタウイルス生物学を探索し、既存のロタウイルスワクチンを修飾・最適化し、ロタウイルス多標的ワクチンベクターを開発することが可能になりました。本報告では、組換えロタウイルスの効率的かつ確実な回復を可能にする、簡素な逆遺伝学システムについて述べる。このシステムは、フルレングスロタウイルス(+)RNAを発現するT7転写ベクターと、T7 RNAポリメラーゼ(BHK-T7)を構成的に産生するBHK細胞にRNAキャッピング酵素をコードするCMVベクターの共同トランスフェクションに基づいている。組換えロタウイルスは、トランスフェクトされたBHK-T7細胞をMA104細胞(ウイルス増殖に対して非常に寛容であるサル腎臓細胞株)で過剰播種することによって増幅される。本報告では、ゲノムセグメント7(NSP3)への2A翻訳ストップリスタート素子の導入を通じて、別の蛍光レポータータンパク質を発現する組換えロタウイルスを生成するアプローチについても述べる。このアプローチは、ウイルスのオープンリーディングフレームのいずれかを削除または変更することを避け、蛍光タンパク質を発現させながら完全に機能するウイルスタンパク質を保持する組換えロタウイルスの産生を可能にする。

本稿で説明する逆遺伝学プロトコルは、複数の異なるステップを経て進行します: (1) ロタウイルス pT7 転写ベクターと pCMV/NP868R 発現プラスミドを持つ BHK-T7 細胞の共同トランスフェクション, (2)MA104細胞を用いたトランスフェクトされたBHK-T7細胞の過剰播種、(3)MA104細胞を用いたリセートのBHK-T7/MA104細胞に存在する組換えウイルスの増幅、および(4)MA104細胞を用いた組換えウイルスのプラーク単離(図2)。私たちの手では、プロトコルは効率的であり、BHK-T7/MA104細胞ライセートの組換え野生型SA11ウイルス(rSA11/wt)の力素を生み出し、約104 PFU/mLの細胞ライセートを増幅し、&gt;1 x 107 PFU/mLのMA104細胞ライセートを増幅します。FPを発現する修飾pT7/NSP3SA11プラスミド(例えば、rSA11/NSP3-2A-3xFL-UnaG)を用いて逆遺伝学によって生成されたSA11組換えウイルスは、rSA11/wtより〜4倍少ない価に成長す...

プラスミドDNAからの組換えロタウイルスの生成は、ロタウイルス複製および病因の研究、およびロタウイルス発現ベクターおよびワクチンの開発に不可欠なツールを提供する。本明細書において、蛍光レポータータンパク質を発現する株を含む組換えロタウイルスを生成するための簡略な逆遺伝学アプローチについて述べる。

Rotaviruses are a large and evolving population of segmented double-stranded RNA viruses that cause severe gastroenteritis in the young of many mammalian ...

このプロトコルは、組換えロタウイルスを作るための信頼性の高い効率的な逆遺伝学システムを記述する。また、蛍光マーカータンパク質を発現する組換えロタウイルスの作り方についても説明します。この方法は、最小限の数のプラスミドを必要とする単純であり、別々のフッ素タンパク質だけでなく、ウイルスタンパク質を発現する組換えロタウイルスを生成することができます。BHKT7細胞を12ウェルプレートに播種し始めます。細胞の新鮮なコンフルエント単層をPBSでリンスします。次に、トリプシン-EDTA溶液で単層を破壊し、GMEM完全培地の5ミリリットルで細胞を再懸濁する。トリパンブルーと自動セルカウンターを使用して、生存可能なBHKT7細胞の濃度を決定します。その後、12ウェル細胞培養プレートの各ウェルにGMEMの1ミリリットルで5番目の細胞に2回10回播種する。一晩5%の二酸化炭素インキュベーターで37°Cでプレートをインキュベートします。翌日、原稿の指示に従ってトランスフェクション用のプラスミド混合物を準備します。その後、各プラスミド混合物に110マイクロリットルの事前温め込み減らされた血清培地を加え、ピペットを上下に軽く加え、混合します。32マイクロリットルのトランスフェクション試薬を混合物に加える。ボルテックスに続いて短い遠心分離を行い、室温で20分間インキュベートします。一方、GMEM不完全培地の2ミリリットルでBHKT7細胞をすすいでください。各ウェルにSMEM不完全培地を1ミリリットル加え、プレートをインキュベーターに戻します。20分間のインキュベーションの後、200マイクロリットルのピペットを使用して、トランスフェクション混合物を各ウェルに滴下して添加します。そっとプレートを揺らし、インキュベーターに戻します。トランスフェクションの2日後、MA104細胞の新鮮なコンフルエント単層をPBSでリンスする。トリプシン-EDTA溶液で単層を破壊し、DMEM完全培地の5ミリリットルで細胞を再懸濁する。細胞を数え、DMEM不完全培地のミリリットル当たり5番目の細胞に8倍10倍に濃度を調整します。トランスフェクトされたBHKT7細胞を持つウェルに滴下するMA104細胞の0.25ミリリットルを追加します。各ウェルに1ミリリットルトリプシンストック溶液あたり1ミリグラムに0.8マイクロリットルを追加することにより、トリプシンの濃度を1ミリリットル当たり0.5マイクログラムに調整します。残りのMA104細胞をDMEM完全培地中のミリリットル当たり1.5倍の10倍の濃度に希釈し、6ウェルプレートの各ウェルに2ミリリットルを入れる。トランスフェクションの6日後、トランスフェクトされた細胞から組換えウイルスを回収する。BHKT7 MA104細胞を無菌条件下で3サイクルの凍結/解凍を行い、プレートをマイナス20°Cの冷凍庫と室温の間で移動させる。1.5ミリリットルのチューブにライセートを移す。500倍gで10分間チューブを遠心分離し、セルラーデブリをペレットに摂氏4度。上清を集め、摂氏4度で保存します。1ミリリットルあたり10マイクログラムの最終濃度に100マイクロリットルの明確な細胞ライセートにトリプシンを加え、1時間摂氏37度で混合物をインキュベートします。次に、DMEM不完全培地で10からマイナス1から10からマイナス7までの10倍のシリアル希釈シリーズを準備します。MA104単層を2ミリリットルのPBSで2回、DMEM不完全培地で1回リンスします。400マイクロリットルのライセート希釈液をプレートに加え、摂氏37度と二酸化炭素5%でインキュベートし、10~15分ごとに揺れ、単層全体に希釈液を再分配します。1.5%溶融し、冷却アガロースと事前に温めた2X EMEMの等しい量を組み合わせることによってアガロースMEMオーバーレイソリューションを準備します。水浴中の摂氏42度で溶液を維持し、細胞上に置く前に、トリプシン濃度を1ミリリットル当たり0.5マイクログラムに調整します。6ウェルプレートからの吸気溶離希釈液。その後、不完全な培地の2ミリリットルで細胞を一度すすい。アガロースMEMオーバーレイ溶液の3ミリリットルを各ウェルの細胞単層にそっと加えます。アガロースを室温で硬化させます。その後、プレートをインキュベーターに戻します。3日後、先に説明したようにアガロースMEMオーバーレイ溶液を調製し、使用直前にミリリットル当たり50マイクログラムの最終濃度に中性赤色を加える。6ウェルプレートの既存のアガロースの上に2ミリリットルのオーバーレイ溶液を追加します。アガロースを硬化させ、プレートをインキュベーターに戻し、中性の赤でプレートを光から保護します。次の6時間にわたって、ライトボックスの助けを借りてロタウイルスプラークを識別します。使い捨て可能な移写ピペットを使用して明確に定義されたプラークを選び、細胞層に完全に伸びるアガロースプラグを回収する。0.5ミリリットルのDMEM不完全培地を含む1.5ミリリットルのチューブにプラグを抜き、サンプルを30秒間渦に入れます。MMEM不完全培地およびトリプシン1ミリリットル当たり0.5マイクログラムのMA104単層またはAT25フラスコで伝播することにより、培地中に溶出したプラーク分離ウイルスを増幅する。600マイクロリットルの透明化された感染細胞ライセートと400マイクロリットルのグアニジニウム・チオシアネートを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに加えます。30秒間ボルテックスし、室温で5分間インキュベートします。その後、クロロホルムの200マイクロリットルを追加します。溶液を30秒間ボルテックスし、3分間インキュベートする。13,000グラムと摂氏4度で5分間のマイクロセントリフィケーションを行った後、上水相の550マイクロリットルを新鮮なチューブに移します。冷たいイソプロピルアルコールの2つのボリュームを追加し、チューブを4〜6回反転します。室温で10分間インキュベートします。その後、13,000倍gと摂氏4度で10分間遠心分離します。RNAペレットを残して上澄み物を捨てます。1回反転させ、700g、摂氏4度で5分間遠心分離して、75%エタノールの1ミリリットルをチューブに加えてRNAを洗浄します。エタノールを慎重に除去した後、RNAを5〜10分間空気乾燥させます。その後、ペレットを15マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水に溶解する。溶存RNAサンプルの10マイクロリットルに6X DNAローディングバッファーの2マイクロリットルを追加します。プレキャスト10%ポリアクリルアミドミニゲルにロードします。トリスグリシンランニングバッファ内の電気泳動で、一定の16ミリアンペア電流で2時間RNAを解決します。ゲルの実行が完了したら、ゲルを1ミリリットルのエチジウム臭化エチジウムを含む水に5〜10分間浸し、UVトランスイルミエーターでロタウイルスゲノムセグメントを検出します。この逆遺伝学プロトコルは、組換えSA11ウイルスを生成するために使用され、これは、プラークの単離を可能にするMA104細胞上のプラークアッセイで容易に同定することができる。プラーク精製されたrSA11野生型およびSA11-UnaGウイルスのdsRNAゲノムを、フェノールおよびグアニジニウム・チオシアネートを含む溶液で抽出し、10%ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動によって分解し、臭化エチジウムで染色することによって検出した。予想通り、rSA11-UnaGのセグメント7またはNSP3 dsRNAは、2A-3xFLUnaG配列の存在により、rSA11野生型よりもはるかに遅く移行した。UNaG蛍光タンパク質の発現を確認するために、MA104細胞を野生型および組換えウイルスに感染させ、生細胞画像で検査した。分析の結果、rSA11-UnaGは緑色蛍光を生み出し、rSA11野生型に感染した細胞では蛍光は検出されなかった。免疫ブロット分析を行い、2A要素のrSA11-NSP3-2A-xflUnaGが2つの別々のタンパク質の発現を促進したかどうかを調べた。分析の結果、NSP3-2Aおよび3xFL-UnaGは、実際に機能的2A元素を示す別々のタンパク質として発現していた。組換えロタウイルスの回復を成功させるためには、トランスフェクション用の品質、よく維持されたBHKT7細胞、過剰播種用MA104細胞、および正確な量の高純度プラスミドを使用することが重要です。このプロトコルは、逆遺伝学系を使用してロタウイルスNSP3遺伝子を改変する方法を説明しますが、SP1などの他の遺伝子を改変するためにも同じアプローチを使用できます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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レポータータンパク質を発現する組換えロタウイルスを回収する簡略逆遺伝学法

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