フローサイトメトリーを用いた経月細菌に結合するヒトノロウイルスウイルス様粒子の定量化

ウイルスと細菌の相互作用は、成功したウイルス感染および宿主免疫応答の刺激のために重要であり得る。しかし、現在、ヒトノロウイルスの高度に濃縮され精製されたストックは、実験室で生産することはできません。この技術は、ウイルス様の粒子または生きたウイルスのいずれかが利用可能な細菌に結合する任意のウイルスで使用することができます。

これにより、これらのウイルスと細菌の相互作用を定量化することができます。凍結グリセロールストックから直接寒天プレートからエンターボバクタークロアカエの単一の単一の分離コロニーで液体培地の5ミリリットルを接種します。一晩細菌を成長させます。

翌日、培養物の1.3ミリリットルのアリコートを2つの別々の1.5ミリリットル遠心管に移す。チューブを10,000 x gで5分間遠心分離する。上清を取り除き、洗浄ごとに1ミリリットルの滅菌1X PBSを使用してサンプルを2回洗浄します。

サンプルを10,000 x gで再び5分間遠心分離する。上清を取り除き、滅菌1X PBSの1.3ミリリットルでペレットを再懸濁します。0.5ミリリットルの洗浄培養から始まり、10からマイナス1からマイナス4まで1X PBS中の細菌を連続して希釈する。

分光光度計を用いて、洗浄された希釈されていない培養液と4つの希釈液の光密度を600ナノメートルで測定する。1X PBSで10倍の連続希釈を、以前の希釈液ごとに実行します。各シリーズの最後の3つの希釈液の100マイクロリットルを寒天プレートに広げ、各サンプルの1ミリリットル当たりのコロニー形成単位の数を決定します。

プレートを室温で5分間乾燥させます。プレートを反転し、インキュベーターでインキュベートします。原稿に記載されている試薬、抗体、および細菌を調製した後、BSL-2バイオセーフティキャビネット内のすべての材料を組み立てます。

ヒトノロウイルスのウイルス様粒子はBSL-2病原体としてリストされており、VLPを用いて行うすべての作業は、認定バイオセーフティキャビネットで行う必要があります。細菌の各チューブにヒトノロウイルスVLPの10マイクログラムを追加し、ピペット処理によって徹底的に混合します。一定の回転で摂氏37度で1時間チューブをインキュベートします。

インキュベーション後、チューブを10,000 x gで5分間遠心分離します。吸引し、上清を捨て、PBSの1ミリリットルで細菌ペレットを再懸濁する。洗浄ステップを一度繰り返した後、チューブを10,000 X gで再び5分間遠心します。

上清を捨て、5%ブロッキングバッファーの150マイクロリットルでVLP-バクテリアペレットを再懸濁します。一般的なエラーは、チューブがスワップされ、間違った処理が追加されるということです。これを防ぐために、すべてのチューブを正しい処理に対応するラインに並べ、チューブに一度に1つの治療を加えます。

各細菌サンプルに対して、希釈されたヒトノロウイルスGII抗体を50マイクロリットル調製する。5%ブロッキングバッファーを使用して、E.cloacaeサンプルに対して抗体を1〜125に希釈します。同じ希釈比を使用して、各細菌サンプルに対して50マイクロリットルの希釈アイソタイプ抗体を調製します。

各取り付けアッセイサンプルを350マイクロリットルのアリコートに分け、清潔な1.5ミリリットルの遠心管に移します。染色されていないコントロールを作成するには、各細菌サンプルから最初のアリコートに50マイクロリットルのブロッキングバッファーを追加します。染色されたサンプルについては、GII抗体希釈液の50マイクロリットルをアリコートの第2のセットに加える。

アイソタイプコントロールを作成するには、希釈アイソタイプ抗体の50マイクロリットルをアリコートの第3セットに加えます。氷の上と暗闇の中で30分間すべてのサンプルをインキュベートします。次に、10,000 X gで全てのサンプルを5分間遠心分離する。

上清を捨て、各サンプルをFCSBの150マイクロリットルで再懸濁します。再度、10,000 X gで全てのサンプルを5分間遠心分離する。再度、上清を捨てて、FCSBの100マイクロリットルでサンプルを再中断します。

サンプルを最後に1回遠心し、上清を捨て、150マイクロリットルのFCSBでサンプルを再中断します。各サンプルを400マイクロリットルのFCSBを含むチューブに移し、合計容量は550マイクロリットルです。サンプルは、フローサイトメトリーで分析されるまで摂氏4度で保存します。

VLP付着はフローサイトメトリーを用いて測定した。まず、密度プロットを使用して細胞の破片をゲートアウトし、その後のドットプロットゲーティングを使用して細菌のダブレットと細胞塊を除去しました。代表的なヒストグラムは、細菌のみのサンプルにおけるPEシグナルの欠如と、不染色およびアイソタイプ制御と比較してVLP:細菌サンプルにおけるPE信号強度の変化を示す。

10マイクログラムのVLPで1時間のインキュベーションの後、フローサイトメトリーはE.colacaeとL.gasseriの両方に結合する粒子を検出した。このアッセイに対する結合定量の限界を決定するために、VLPsの希釈系列を細菌に添加する前に生成した。VLPの量の減少は、VLPによって結合されたパーセント細菌に対応する減少をもたらした。

ウイルスを知る:細菌比と実験間の比率の一貫性を保つことは、結果を解釈する上で重要です。細菌およびウイルス変異体は、この相互作用を媒介する微生物表面構造を特異的に決定するために生成することができる。この技術により、ウイルス遺伝子型の変化、細菌の増殖条件、細菌表面構造の変化がウイルス結合をどのように変化させるかなど、ノロウイルスと細菌の相互作用に影響を与える状況や条件に関する質問に答えることができます。